Effect of Inhibiting PPARγ Expression on Osteogenic Differentiation of BMSCs
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摘要:
目的 探究抑制过氧化物酶增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）表达对BMSCs成骨分化的影响，为原发性骨质疏松症（primary psteoporosis ，POP）的治疗提供理论基础。 方法 将骨密度正常患者提取的BMSCs分为正常对照组（CON组），POP患者提取的BMSCs分为原发性骨质疏松组（POP组），取POP组细胞加入PPARγ抑制剂，分为抑制剂组（INR组），经成骨诱导分化后，检测各组细胞中骨桥蛋白（osteopontin, OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）、Osterix、Runt相关转录因子2 （runt-related transcription factor 2 ，Runx2）的表达情况；碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色观察各组BMSCs成骨分化情况。 结果 POP组ALP阳性细胞数低于CON组和INR组（P < 0.05）；与CON组相比，POP组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）；与POP组相比，INR组中OCN、OPN、Osterix、Runx2表达量升高，差异具有统计学意义（P < 0.05）。 结论 抑制PPARγ表达后，BMSCs成骨分化特异性基因（ALP、OCN、OPN、Osterix、Runx2）表达增加。 Abstract:Objective To investigate the impact of inhibiting peroxisome proliferator-activated receptor γ （PPARγ） expression on osteogenic differentiation of BMSCs, so as to provide a theoretical basis for the treatment of primary osteoporosis （POP）. Methods BMSCs were extracted from patients with normal bone density and categorized into the normal control group（CON group）. BMSCs extracted from patients with primary osteoporosis were categorized into the primary osteoporosis group （POP group）. The cells from the POP group were treated with a PPARγ inhibitor and divided into the inhibitor group （INR group）. Following osteogenic differentiation, the expression of osteopontin （OPN）, osteocalcin （OCN）, Osterix, and runt-related transcription factor 2 （Runx2） was evaluated in the cells of each group.The alkaline phosphatase （ALP） staining was employed to assess the osteogenic differentiation of BMSCs in each group. Results The quantity of ALP-positive cells in the POP group was lower than that in the CON and INR groups （P < 0.05）. The expression of OCN, OPN, Osterix, and Runx2 was found to be decreased in the POP group when compared to the CON group, with statistically significant differences (P < 0.05）. Conversely, the expression of OCN, OPN, Osterix, and Runx2 was elevated in the INR group when compared to the POP group, with statistically significant differences (P < 0.05）. Conclusion Increased expression of osteogenic differentiation-specific genes （ALP, OCN, OPN, Osterix, Runx2） in BMSCs after inhibition of PPARγ expression. -
Key words:
- POP /
- PPARγ /
- BMSCs /
- Osteogenic differentiation
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头颈部癌症是人类第6大常见癌症，约占总癌症种类的3%，这其中48%属于口腔癌。全世界每年约有30万例新发口腔鳞状细胞癌病例，中国口腔癌的发病率约为5～6人/10万[1]。口腔癌具有进展快、浸润广、预后差的特点，尽管目前手术及放化疗等治疗技术在不断提高，但是远未达到理想效果，口腔癌的长期生存率仍然低于50%[1-2]。若能深入阐明其发病的分子机制，综合多项分子靶点进行预测或治疗，则有望在口腔癌的早期诊断、治疗方面有所突破。
SOX5（SRY-related high-mobility-group box 5）属于SOX转录因子家族的成员。近年的研究发现，SOX5在软骨组织分化、性别决定中起到重要的作用，并可促进多种肿瘤的发展与转移。而目前关于SOX5在口腔癌中的表达情况以及其在口腔癌中的可能作用还不清楚。小分子RNA（miRNA）是一类长度为17～25 个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在转录后基因表达调控中起着重要的作用。越来越多的研究表明，miRNA参与口腔癌的发生与发展过程，对口腔癌中miRNA的表达变化以及其调控基因的研究，有助于推进我们对口腔癌发生发展分子机制的认识。最近的研究表明，miR-219-5p做为新的癌症相关miRNA，可抑制包括结直肠癌、胃癌、卵巢癌及胶质瘤癌等多种癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程，miR-219-5p在这些癌组织中的表达下调。但目前关于miR-219-5p在口腔癌中的表达和作用尚不清楚。
根据生物学软件的预测，以及对SOX5基因3’-UTR（非编码区域）的分析，作者发现SOX5 是miR-219-5p的一个潜在靶基因，那么SOX5和miR-219-5p是否参与到口腔癌的发生进展中呢？如果是，miR-219-5p是否通过对SOX5的靶调控参与了口腔癌的发生进展呢？为了解决以上问题，本研究拟对miR-219-5p / SOX5在口腔癌中的作用做一初探，拟为临床治疗提供全新的药物治疗靶点依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
人舌鳞癌细胞株SCC4、SCC9和人正常皮肤成纤维细胞（HF）购自中国科学院上海细胞库。SCC4和SCC9细胞由中国科学院上海细胞库进行STR验证。本研究中没有使用错误识别和/或污染的细胞系。
miR-219-5p模拟物、miR-219-5p抑制剂、miRNA模拟物阴性对照（miR-NC）和siRNA阴性对照（miR-219-5p抑制剂，NC）由中国广州瑞博生物有限公司提供。用Lipofectamine 3000试剂盒（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）进行细胞转染实验。
TRIzol® （Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，Inc.）及miRNeasy mini kit （Qiagen AB）用于总RNA的提取，All-in-OneTM miRNA 定量RT-PCR检测试剂盒（GeneCopoeia公司）用于miR-219-5p 的RT-qPCR分析。用于miRNAhsa-miR-219-5p及U6 （内参基因） RT-PCR分析的引物购自Applied Biosystems及 Thermo Fisher Scientific公司。采用Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase （Takara Bio，Inc.） 及2× Mix SYBR Green I （Takara Bio，Inc.） 检测样本中SOX5 mRNA的表达水平。采用BCA试剂盒（北京生物技术公司）检测蛋白浓度。
1.2 细胞分组
细胞在制备好的培养基中经过第12代传代培养，该培养基成分为：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium （DMEM）/F12（DMEM）/F12 （ThermoFisher，上海，中国）、2 mmol/L谷氨酰胺、10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素（ThermoFisher科学，上海，中国）。在提供5% CO2、恒温37 ℃的培养箱中培养。
将1.5 μL miR-219-5p模拟物（3 μmol/L）、5 μL miR-219-5p抑制剂（2.5 μmol/L）或等量的Lipofectamine 3000试剂盒中的空白对照剂加入SCC4和SCC9细胞系进行瞬时转染。所使用的miRNA的序列描述如下：miR-219-5p 模拟物，UGAUUGUCCAAACGCAAUUCU；miR-219-5p模拟物空白对照（miR-NC），UGGAUUCCUUAACUUCCCAA；miR-219-5p 抑制剂，UUCAACCAGGAAAAG- UUGGGAAU；miR-219-5p 抑制剂空白对照（miR-219 inhibitor NC），AUGGCACGUGUACUCCUACAUAC。将浓度为1×106的各细胞系接种在培养皿中，按照制造商的说明书建议，在37 ℃下用上述试剂共培养48 h。随后，收集处理过的细胞进行进一步的分析，包括逆转录定量PCR （RT-qPCR）及Western blot实验等。
1.3 miR-219-5p靶向SOX5基因及其结合区域的验证
根据miRMine （http://www.microrna.org）在线网站的计算，预测SOX5 mRNA的3′-UTR序列中miR-219-5p的结合位点为5′-GGACCAAA-3′，据此，设计验证实验中相应突变位点序列为5′-GCAGGCCA-3′。
应用荧光素酶报告基因检测验证口腔癌细胞中miR-219-5p靶向调控SOX5基因。通过分子克隆实验将野生型（wt）和突变型（mut）序列插入pmirGLO载体（购自Promega公司）。在荧光素酶活性测定实验中，miR-219-5p模拟物或抑制剂分别用wt-SOX5和mut-SOX5或对照报告质粒转染口腔癌细胞。转染48 h后，使用双荧光素酶报告分析系统（Promega，Madison，WI）测量萤火虫（firefly）和海肾（Renilla）的荧光素酶活性，设定海肾荧光素酶活性作为内部对照。萤火虫的荧光素酶活性以海肾Renilla的荧光素酶活性为准做标准化处理。所有实验均重复进行3次。
1.4 RT-qPCR
按发表文献的方法描述、运用RT-qPCR检测各细胞株中miR-219-5p和SOX5的相对表达水平[3]。参照样本中U6的表达水平对miR-219-5p的相对表达量参照进行标准化[4]。引物设计并购自Invitrogen （Thermo Fisher Scientific，Inc.），所用引物序列描述如下，hsa-miR-219-5p：正向， 5′-UAUCCACUUGAUCG-GCCUAC-3′；反向5′-GCUCCGCTGUAGACCUAUCUGCA-3′；GAPDH，正向5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，反向5′-TTCACACCCATGACGAACAT-3′；SOX5，正向5′-CGTAACGAGCCTATGCAAT-3′，反向5′-TACCGGAAGCTA-CAATGCA-3′。每个PCR反应由两部分组成，包括95 ℃初始变性3 min，多次循环扩增（36个循环，95 ℃ 10 s，56.5 ℃ 20 s，75 ℃ 30 s），随后95 ℃变性15 s，65 ℃退火10 s，最终95 ℃延伸10 s GAPDH 作为内参基因。用2-ΔΔCq法评价各基因的相对表达水平[5]。
1.5 Western blot 分析
Western blot检测SOX5蛋白在个样本中的表达水平。按BCA检测试剂盒说明书检测蛋白浓度。取蛋白质样品（40 μg）用10% SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素膜上（中国碧云天生物）。用5%的脱脂牛奶封闭纤维素膜2 h，随后，加入一抗SOX5 （1∶1000；cat.no.sc-293215；Santa Cruz 生物技术公司）和GAPDH （1∶500；cat.no.sc-47724；Santa Cruz 生物技术公司），4 ℃下孵育过夜。0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min；HRP标记的二抗IgG（1∶2000；cat. no. sc-516102）在20～24 ℃孵育2 h。用增强的化学发光试剂（EMD，Millipore）观察纤维膜上免疫印迹信号。以GAPDH作为蛋白表达的参考。蛋白质的印迹结果采用Bio-Rad化学发光凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）显影，印迹的条带采用Image J软件（V1.8.0.172，美国）进行光密度值的分析。
1.6 统计学处理
运用SPSS 软件（SPSS inc.，version21.0，美国） 对数据进行统计分析。采用方差分析（ANOVA）和Student-Newman-Keuls检验（Student-Newman-Keuls test）测定各组间mRNA和蛋白表达水平是否具有显著性差异。计量数据表述方式采用均数±标准差 （standard deviation，SD），P < 0.05为差异有统计学意义。用Pearson相关系数分析miR-219-5p与SOX5的表达水平是否具有相关性。
2. 结果
2.1 在口腔癌细胞株中miR-219-5p 表达下调、SOX5表达上调
RT-qPCR及Western blot的检测结果显示：在人口腔癌细胞株SCC4及SCC9中，miR-219-5p 的表达下调（图1A），与正常细胞株HF相比有统计学差异（P < 0.05）；而SOX5的基因（图1B）及蛋白（图1C）表达水平显著增加，与正常细胞株HF相比有统计学差异（P < 0.05）；Pearson相关系数分析合并后各组数据结果显示，人口腔癌细胞株中miR-219-5p 及SOX5的表达水平r = -0.869，绝对值接近1，说明miR-219-5p 的表达水平和SOX5的表达水平呈现负性相关。
图 1 miR-219-5p及SOX5在人口腔癌细胞株SCC4及SCC9中的表达检测A：miR-219-5p在HF、SCC4及SCC9细胞株中的表达水平比较；B：SOX5 mRNA在HF、SCC4及SCC9细胞株中的相对表达水平；C：SOX5在HF、SCC4及SCC9各细胞株中的蛋白检测表达结果，左边为Western blot检测的印迹图，GAPDH为内参；右边为SOX5蛋白定量直方图。Figure 1. The expressions of miR-219-5p and SOX5 in oral squamous cell lines SCC4 and SCC92.2 miR-219-5p通过靶向3′- UTR区域调控口腔癌细胞中SOX5的表达
miR-219-5p通过靶向3′-UTR区域调控口腔癌细胞中SOX5的表达见图2。
图 2 miR-219-5p靶向3’-UTR特异性序列调控SOX5A：miRMine预测人SOX5 mRNA序列中miR-219-5p可能的结合位点，红色标注的为miR-219-5p与SOX5 mRNA靶向结合的潜在位点；B：根据预测结果设计的miR-219-5p与SOX5 mRNA靶向结合潜在位点的突变序列（黄色标示）；3’UTR，3’非编码区；C：SCC4细胞的双荧光素酶报告实验结果；D：SCC9细胞的双荧光素酶报告实验结果。SOX5 3'UTR-wt，SOX5 3'UTR结合位点野生型组（未突变组）；SOX5 3'UTR-mut，SOX5 3'UTR结合位点突变组；miR-NC，miR-219-5p空白对照剂转染；miR-219-5p，miR-219-5p转染。Figure 2. miR-219-5p regulates SOX5 by binding to specific sites in 3’-UTR由于SOX5和miR-219-5p在口腔癌细胞中表达趋势相反，呈现负性相关，笔者推测miR-219-5p可能通过特定的“种子”区域靶向调控SOX5 mRNA表达。为了验证这一推测，我们使用miRMine来预测SOX5 mRNA中miR-219-5p可能的结合位点。结果表明，SOX5 mRNA的3′- UTR上确实存在miR-219-5p的结合位点，SOX5是miR-219-5p的潜在靶基因（图2A，红色标注的为miR-219-5p与SOX5 mRNA靶向结合的潜在位点）。根据此结合位点，笔者设计验证实验中相应突变位点序列为5′-GCAGGCCA-3′（图2B，黄色标示的为突变后的序列）。
接下来的双荧光素酶报告实验揭示：与相应对照组（SOX5 3′UTR-wt+miR-NC）相比，未经突变处理的野生型SOX5 3′UTR-wt与miR-219-5p模拟物 （SOX5 3′UTR-wt+miR-219-5p）联合转染可显著降低SCC4与SCC9的荧光素酶活性（P < 0.05，图2C-D）。而在SOX5种子序列区做了突变处理即SOX53′-UTR-mut载体转染后的细胞中，miR-219-5p处理均不能诱导SCC4或SCC9细胞中荧光素酶活性降低 （SOX5 3′UTR-mut+miR-NC vs. SOX5 3′UTR-mut+miR-219-5，P > 0.05，图2C-D）。
为了进一步确定在口腔癌细胞中miR-219-5p是否靶向调节SOX5的表达水平，笔者用miR-219-5p模拟物或抑制剂处理SCC4和SCC9细胞，随后检测SOX5的表达水平。结果显示，miR-219-5p模拟物处理后显著抑制了SOX5表达，而miR-219-5p抑制剂处理显著恢复了SCC4 （图3A～B） 和SCC9 （图3C～D） 细胞中SOX5的表达水平，与各自的对照组相比具有统计学差异（P < 0.05）。这些结果验证了在口腔癌细胞中miR-219-5p通过与SOX5 mRNA3′-UTR中特定的序列结合而靶向调控SOX5的表达。
图 3 在口腔癌细胞SCC4及SCC9中miR-219-5p靶向调控SOX5的表达A：miR-219-5p在SCC4细胞中对SOX5 mRNA水平的表达调控； B：miR-219-5p在SCC9细胞中对SOX5 mRNA水平的表达调控；C：miR-219-5p在SCC4细胞中对SOX5蛋白水平的表达调控，上方为Western blot检测的蛋白印迹图，GAPDH为内对照，下方SOX5蛋白水平的定量统计直方图；D：miR-219-5p在SCC9细胞中对SOX5蛋白水平的表达调控，上方为Western blot检测的蛋白印迹图，GAPDH为内对照，下方SOX5蛋白水平的定量统计直方图。Figure 3. miR-219-5p regulates the expression of SOX5 in SCC4 and SCC93. 讨论
作为SOX转录因子家族的成员，SOX5除了在软骨组织分化、性别决定中起到重要的作用，也是许多疾病的易感基因，可促进鼻咽癌[6]、舌癌[3]、肝癌[7]、乳腺癌[8]和前列腺癌[9]等多种肿瘤的发展与转移。Huang等发现SOX5通过调控SPARC的表达下降来促进鼻咽癌的进展，同时SOX5在鼻咽癌组织中的过表达与临床低生存率成正相关性[6]；在肝癌及乳腺癌中，SOX5通过Smad3-Sox5-Twist1信号通路促进上皮-间质转化及肿瘤细胞的入侵[7-8]；在前列腺癌中，SOX5通过调控Twist1的表达来调节TGF-β诱导的上皮-间质转化过程[9]。而本研究发现SOX5在人口腔癌组织以及细胞中表达异常增加，且其表达水平上调与患者的组织分型、临床表现及生存率呈现正相关。本研究首次揭示了SOX5在人口腔癌肿瘤组织中的表达，并与患者的临床表现呈现出恶性相关，即SOX5的表达水平增加可能导致了人口腔癌的恶化与预后不良。
为了检测SOX5表达水平改变的上游调控机制，笔者把研究目标转向了miRNA水平。miRNA通过与靶基因mRNA的3′-非翻译区（3′-UTR）互补结合从而诱导靶基因mRNA的直接降解，进而导致靶蛋白表达下降。目前的研究发现，超过30%的人类基因受miRNA调控，而同一种miRNA可以调控数百种mRNA的降解[10]。miRNA通过调节靶向基因的表达来参与细胞增殖与分化、发育、细胞凋亡、炎症及肿瘤发生与转移等过程[10-11]。研究表明，miRNA可以做为原癌基因或肿瘤抑制物来调节靶基因表达及旗下有信号通路的传导[12]。越来越多的研究表明正常组织与癌组织中的miRNA表达谱是不一样的。研究发现，不同类型的组织或细胞中都有特异表达的miRNA，不同癌组织中的特异miRNA表达谱可为临床诊断与治疗提供重要的信息。miRNA参与口腔癌的发生与发展过程，越来越多的研究表明，针对特异miRNA，如miR-196a-5p和miR-145，具有抑制口腔鳞状细胞癌的潜在作用[13-14]，因此，对口腔癌中miRNA的表达变化以及其调控基因的研究，有助于推进笔者对口腔癌发生发展分子机制的认识；同时miRNA介导的治疗为临床治疗提供了全新的药物治疗靶点依据。而本研究发现miR-219-5p通过特异性与SOX5基因的3′-UTR区互补结合，在转录水平实现了对SOX5的表达沉默，在人口腔癌中靶向调控了SOX5的表达。
值得注意的是，miR-219-5p做为新的肿瘤相关miRNA被证实参与了多种肿瘤的发生与进展。miR-219-5p在包括卵巢癌、胃癌以及结直肠癌等癌组织中的表达下调[15-19]。miR-219-5p通过调节Twist/Wnt/β-catenin信号通路来抑制表皮卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程[15]；而在胃癌中，miR-219-5p通过调节LRH-1/Wnt/β-catenin信号通路来抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭过程[16]；在结直肠癌中，miR-219-5p通过下调calcyphosin和PDGF受体的表达来抑制癌细胞的增殖和侵袭过程[17-18]，同时可以通过下调LEBF1的表达来抑制结直肠癌上皮-间质转化及癌细胞转移过程[19]。
结合本研究结果，miR-219-5p在人口腔癌细胞株中的表达水平显著下降、而SOX5的表达增加，miR-219-5p表达水平下降与SOX5的表达水平增加呈现负相关，miR-219-5p模拟物处理后可诱导人口腔癌细胞中SOX5的表达增加，而将SOX5 mRNA上miR-219-5p靶向调控的潜在区域进行突变处理后可以消除miR-219-5p对SOX5的表达调控。这些结果提示miR-219-5p可能通过特异性靶向结合SOX5基因的3′非编码区调控了SOX5的表达；在口腔癌中miR-219-5p的表达缺失，导致SOX5表达失控而异常增加，可能与口腔癌的发生发展密切相关。本研究结果为口腔癌靶点基因的甄选及开展临床靶向治疗奠定了基础。
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图 2 各组PPARγ免疫荧光染色（标尺为50 μm）
A：CON组PPARγ表达的免疫荧光图； B：POP组PPARγ表达的免疫荧光图； C：INR组PPARγ表达的免疫荧光图。
Figure 2. Immunofluorescence staining for PPARγ in each group （scale bar: 50 μm）
图 4 各组ALP染色（中性红染色，标尺为50 μm）
A：CON组ALP染色；B：POP组ALP染色；C：INR组ALP染色。
Figure 4. ALP staining for each group （Neutral red staining，scale bar: 50 μm）
图 5 基因相对表达量
A：BMSCs中OCN基因相对表达量；B： BMSCs中OPN基因相对表达量；C： BMSCs中Osterix基因相对表达量；D： BMSCs中Runx2基因相对表达量。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 5. Relative mRNA expression
图 6 蛋白相对表达量
A：BMSCs中OCN蛋白相对表达量；B：BMSCs中OPN蛋白相对表达量；C：BMSCs中Osterix蛋白相对表达量；D：BMSCs中Runx2蛋白相对表达量。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 6. Relative protein expression
表 1 免疫荧光半定量方差分析（$ \bar x \pm s $，n = 3）
Table 1. The ANOVA for semi-quantification of immunofluorescence （$ \bar x \pm s $，n = 3）
组别 平均荧光强度 CON组 27.65±3.93 POP组 105.98±13.95 INR组 40.72±13.20 F 41.229 P <0.001* *P < 0.05。 
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表 2 各组基因相对表达量（$ \bar x \pm s $，n = 3）
Table 2. Relative expression of genes in each group（$ \bar x \pm s $，n = 3）
组别 OCN OPN Osterix Runx2 CON组 0.95±0.07 1.21±0.20 1.20±0.17 1.23±0.20 POP组 0.40±0.07 0.46±0.03 0.58±0.11 0.48±0.04 INR组 0.66±0.05 0.80±0.03 0.85±0.12 0.86±0.16 F 59.832 31.647 15.947 19.007 P <0.001* 0.001* 0.004* 0.003* *P < 0.05。
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表 3 各组蛋白相对表达量（$ \bar x \pm s $，n = 3）
Table 3. Expression levels of each group of proteins（$ \bar x \pm s $，n = 3）
组别 OCN OPN Osterix Runx2 CON组 0.74±0.07 0.44±0.06 0.55±0.02 0.54±0.16 POP组 0.51±0.11 0.3±0.03 0.22±0.03 0.31±0.08 INR组 0.89±0.28 0.51±0.03 0.38±0.06 0.52±0.02 F 7.189 37.672 93.211 9.690 P 0.006* <0.001* <0.001* 0.002* *P < 0.05。
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