A Two Sample Mendelian Randomization Study on Nut Intake and Chronic Obstructive Pulmonary Disease
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摘要:
目的 以两样本孟德尔随机化方法探讨坚果摄入量和慢性阻塞性肺疾病之间的因果关系。 方法 从汇总的欧洲大样本openGWAS数据库提取与坚果摄入量紧密关联的SNP位点作为工具变量，分别运用MR-Egger回归、加权中位数及逆方差加权、Simple mode、Weighted mode 5种方法进行孟德尔随机化分析，以OR值及95%CI评价坚果摄入量与慢性阻塞性肺疾病是否存在因果关系。采用mr_pleiotropy_test法检验水平多效性，leave-one-out法进行敏感性分析。 结果 从ukb-b- 16576 数据集共提取49个SNPS作为工具变量，MR-Egger回归、加权中位数、逆方差加权法、Simple mode、Weighted mode计算得OR值和95%可信区间分别为[0.91，95%CI （0.82～1.01），P = 0.084]，[0.92，95%CI （0.89～0.95），P = 0.001]，[0.94，95%CI （0.92～0.96），P = 0.001]，[0.91，95%CI （0.85～0.95），P = 0.001]，[0.91，95%CI （0.86～0.96），P = 0.001]，所有b值结果方向均小于0，由于存在异质性（Q=67.36，P=0.012），故关注随机效应IVW模型。mr_pleiotropy_test检验显示MR-Egger截距为3.50E-04，截距接近于0，P = 0.591，所选的工具变量不存在水平多效性。leave-one-out敏感性分析未发现对结果有显著影响的SNP位点，提示结果稳定可靠。结论 两样本孟德尔随机化分析表明坚果摄入量与慢性阻塞性肺疾病的发病风险呈负向因果关系，但需要更大样本量和不同种族背景的人的数据来进一步验证。 Abstract:Objective To explore the causal relationship between nut intake and chronic obstructive pulmonary disease by two-sample Mendelian randomization method. Methods SNP loci closely related to nut intake was extracted from the summarized large sample open GWAS database as instrumental variables, and Mendelian randomization analysis was performed using MR-Egger regression, weighted median, inverse variance weighting, Simple mode and Weighted mode respectively. OR value and 95%CI were used to evaluate whether there was a causal relationship between nut intake and chronic obstructive pulmonary disease. The mr_pleiotropy_test method was used to test the level of pleiotropy, and the leave-one-out method was used for sensitivity analysis. Results A total of 49 SNPS were extracted from the ukb-b- 16576 data set as instrumental variables. The OR values and 95% confidence intervals were calculated by MR-Egger regression, weighted median, inverse variance weighting method, Simple mode, and Weighted mode, respectively [0.91, 95%CI （0.82～1.01）, P = 0.084], [0.92, 95%CI （0.89～0.95）, P = 0.001], [0.94, 95%CI （0.92～0.96）, P = 0.001], [0.91, 95%CI （0.85～0.95）, P = 0.001], [0.91, 95%CI （0.86～0.96）, P = 0.001]. All b values were less than 0. Due to the heterogeneity （Q = 67.36, P = 0.012 ）, the random effect IVW model was concerned. The mr_pleiotropy_test showed that the MR-Egger intercept was 3.50E-04, the intercept was close to 0, P = 0.591, and the selected instrumental variables did not have horizontal pleiotropy. Leave-one-out sensitivity analysis did not find SNP loci that had a significant effect on the results, suggesting that the results were stable and reliable.Conclusion The two-sample Mendelian randomization analysis shows a negative causal relationship between nut intake and the risk of chronic obstructive pulmonary disease, but larger sample size and data of people with different ethnic backgrounds are needed for further verification. -
Key words:
- Nuts /
- Chronic obstructive pulmonary disease /
- Mendel randomization /
- Causal inference
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慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是1种慢性炎症性肺部疾病，主要特征是气流受限和呼吸困难，通常表现为气短、喘息、咳嗽等症状，具有慢性和进行性的特点[1]。坚果是指一类植物果实的种子，作为植物的精髓部分通常富含蛋白质、油脂、矿物质、维生素，目前已被纳入2022年中国居民膳食指南[2]，其对预防心血管疾病[3]、2型糖尿病[4] 、阿尔兹海默病[5]，及延缓衰老[6]有一定的功效[7]。在两项基于人群的大型研究中，坚果的消费量与原发性肺癌罹患风险呈负相关关系[8]。因原发性肺癌与慢性阻塞性肺疾病有共同的危险因素及发病机理，如早衰、氧化应激和炎症、遗传易感性和表观遗传学改变[9]，故摄入坚果能否降低COPD的罹患风险值得探讨。因此，本研究采用两样本MR法计算坚果摄入量与慢性阻塞性肺疾病的因果效应值大小，评价两者是否存在因果关系，为COPD的防治提供理论参考依据。
1. 资料与方法
1.1 数据来源
通过IEU openGWAS数据库（http://www.mrbase.org）[10]获取近年来样本量较大的COPD及坚果摄入量的GWAS数据，2组数据均为欧洲人群，其中坚果摄入量数据集ukb-b-
16576 样本数为421 764，共9 851 867个SNP位点。COPD样本数据集ukb-d-COPD_EXCL的总样本量为361 194，包含26 710例患者及334 484例对照人群，13 586 589个SNP位点。1.2 工具变量筛选
通过R语言TwoSampleMR包[11]extract instruments函数获取工具变量，设置p1参数为5×10-8，clump参数为TRUE去掉连锁不平衡LDA的工具变量，设置KB和r2参数分别为
1000 和0.001，去掉在1Mb范围内与最显著SNP的r2大于0.001的SNP，并删除与COPD发病混杂因素如支气管哮喘[12]、体重指数[13]相关的SNP和反向因果关系位点，然后与结局变量COPD的SNP汇总取交集，构建SNPs-暴露因素-结局因素关系。采用弱工具变量可能引起相应偏倚，因此通过计算F值评估工具变量与暴露因素的关联强度计算公式为：F=[R2×（N-1-K）]/[K×（1-R2）]，R2=β2×2×MAF×（1-MAF）式中N为暴露的样本量；K为纳入的 SNP 个数；R2为筛选SNP 所解释的变异比例；β为肺结核相关SNP的效应值；MAF为最小等位基因频率。F < 10 提示可能存在弱工具变量偏倚，值越大表示工具变量是弱工具变量的可能性越小。1.3 因果效应估计
MR-Egger回归、加权中位数及逆方差加权法、Simple mode、Weighted mode检验坚果摄入量与COPD之间的因果关联。由于两样本随机化的暴露和结局分别来自于不同的样本，可能存在人群不同等异质性，因此需要通过Cochrans Q异质性检验说明，若P < 0.05说明存在异质性。
1.4 可靠性评价
水平多效性是指当暴露因素为0时，工具变量对结局仍有效应，即通过混杂因素起作用，如果水平多效性检验显著，说明工具变量不仅与暴露相关，同时还与其他混杂因素相关。采用MR-Egger回归的截距项是否接近于0时检验水平多效性，在截距项接近于零时则表示工具变量并不具有水平多效性，因此可以认为水平排他性假设成立；反之，则说明存在基因多效性。可以使用Leave-one-out方法进行敏感性分析，依次逐个切除每个SNP，以对残余的SNPs和IVs作两样本的MR分析，以确定某个SNP的有无对结果产生显著的变化。
2. 结果
2.1 工具变量信息
经过首次筛选，ukb-b-
16576 数据集共得到49个SNP位点，删除支气管哮喘、体重指数混杂因素相关的rs2071627、rs9273453、rs17175518、rs4800488等位点及反向因果关系位点，经过与COPD数据集匹配后最终纳入41个工具变量，SNP位点F值分布范围之间29.74～81.23，中位数40.52，表明不存在弱工具变量，见表1。表 1 工具变量SNP信息表Table 1. Instrumental variable SNP information tableSNPs CHR EA OA EAF β SE P F rs1413952 1 T C 0.48 9.83E-03 1.67E-03 4.30E-09 34.46 rs75641275 1 C A 0.14 −1.42E-02 2.39E-03 2.90E-09 35.25 rs261809 1 G A 0.54 −9.63E-03 1.68E-03 9.80E-09 32.88 rs11586016 1 C G 0.37 9.88E-03 1.73E-03 1.10E-08 32.59 rs72720396 1 G A 0.22 1.14E-02 1.99E-03 8.70E-09 33.12 rs11811826 1 A T 0.22 1.32E-02 2.01E-03 4.40E-11 43.42 rs7599488 2 T C 0.42 −1.04E-02 1.69E-03 6.70E-10 38.12 rs7582086 2 T G 0.46 −9.63E-03 1.67E-03 8.80E-09 33.08 rs4149513 2 A G 0.49 1.17E-02 1.67E-03 2.20E-12 49.25 ............................................. ............................................. rs1622515 11 G A 0.48 9.92E-03 1.67E-03 2.90E-09 35.23 rs3764002 12 T C 0.26 1.31E-02 1.90E-03 5.10E-12 47.65 rs61937394 12 G T 0.19 −1.30E-02 2.20E-03 3.20E-09 35.04 rs12890531 14 G A 0.21 1.12E-02 2.04E-03 4.50E-08 29.91 rs4140799 14 A G 0.53 9.46E-03 1.68E-03 1.80E-08 31.74 rs10129747 14 G A 0.53 9.36E-03 1.68E-03 2.60E-08 30.98 rs34162196 14 T C 0.1 −2.24E-02 2.77E-03 7.10E-16 65.09 rs270816 15 T A 0.12 −1.40E-02 2.51E-03 2.80E-08 30.83 rs1797235 15 C G 0.37 −1.00E-02 1.74E-03 8.90E-09 33.07 rs1582322 16 G A 0.6 9.94E-03 1.72E-03 6.80E-09 33.58 rs862227 16 G A 0.45 −9.16E-03 1.67E-03 4.30E-08 30.03 2.2 两样本孟德尔随机化结果
本次研究的结果显示，MR-Egger回归、加权中位数、逆方差加权法、Simple mode、Weighted mode计算的坚果摄入量与COPD之间的OR值和95%CI分别为[0.91，95%CI （0.82～1.01），P = 0.084]，[0.92，95%CI （0.89～0.95），P = 0.001]，[0.94，95%CI （0.92～0.96），P = 0.001]，[0.91，95%CI （0.85～0.95），P = 0.001]，[0.91，95%CI （0.86～0.96），P = 0.001]，见表2及图1，CochanceQ检验结果均显示P < 0.05，表明工具变量间存在异质性，故主要采用随机效应模型IVW法计算结果。IVW法计算的结果显示P < 0.05，其它4种方法的效应b值方向与IVW的b值方向相同均为负数，随机效应IVW模型结果表明坚果摄入量是罹患COPD的保护因素，结果存在统计学意义，见图2。
表 2 5种MR分析方法OR估计值及95%CITable 2. OR estimates and 95% CI of five MR analysis methods方法 β SE P OR（95%CI） Q Q_pval MR Egger −0.09 0.05 0.084 0.91（0.82，1.01） 66.81 0 加权中位数法 −0.08 0.01 0.001 0.92（0.89，0.95） 67.36 0 逆方差加权 −0.06 0.01 0.001 0.94（0.92，0.95） 简单众数法 −0.1 0.03 0.001 0.90（0.85，0.95） 加权众数法 −0.09 0.03 0.001 0.91（0.86，0.95） 2.3 可靠性分析结果
MR-Egger回归的截距intercep为3.504E-04，截距接近于0，标准误为6.26E-04，P = 0.581，见图2。利用留一法对IVW法结果进行敏感性分析，黑点连线流畅，无明显偏倚位点，说明逐步删除每个SNP后，剩余的40个SNP与IVW法合并的效应OR值相近，未发现IV中存在对结果有强烈影响的SNP，表明之前IVW法得出的效应OR值较稳定，见图3。
3. 讨论
COPD患者因需要长期治疗会导致劳动力的丧失，从而导致医疗费用和社会经济成本的增加，寻求其预防措施对于减少其经济负担具有重要意义。本研究采用大规模的GWAS总数据，应用2样本MR探究坚果摄入量与COPD风险之间的因果关系，结果表明坚果摄入量与COPD罹患风险之间存在显著负向因果关系，随着坚果摄入量每增加1个标准差，COPD的发病风险下降6%。
目前研究认为，COPD的发病机制主要包括炎性机制、免疫学机理、氧化应激反应、胰蛋白酶-抗胰蛋白酶假说学等几个方面，其中细胞因子反应介导的慢性炎症是COPD的主要致病机制，其可导致肺组织结构变化，气道狭窄[14]。空气中的颗粒物暴露仍然是COPD的主要环境风险因素之一[15]，PM特别是柴油机尾气颗粒（diesel exhaust particles，DEP）可诱导促炎细胞因子白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-8（IL-8）及血管收缩剂内皮素-1（ET-1）的释放，体外试验表明ω-3多不饱和脂肪酸（ω-3 PUFA），二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）的油剂均在体外缓解DEP诱导人脐静脉内皮细胞中的IL-6，IL-8和ET-1释放，表明ω-3多不饱和脂肪酸可以减弱炎症反应的程度[16]，而油性坚果如核桃恰好富含此类不饱和脂肪酸，佐证本文观点，另外近期研究表明不饱和脂肪酸可以增加细胞内脂质滴和过氧化物酶体的数量，过氧化物酶体可以利用脂质滴内大量的单不饱和脂肪酸激活一系列抗氧化应激响应机制，保护细胞免受损伤和老化的影响[17]。国外1项临床研究表明定期服用推荐量的ω-3脂肪酸，可减少支气管舒张剂的消耗量，减轻病情恶化可能，延长6 min步行距离，提示多不饱和脂肪酸的摄入量可能与改善COPD患者的生活质量[18]，此结论同样与本文观点吻合。杏仁中微量元素锌含量最高，其作为金属酶和金属蛋白的辅助因子参与广泛的生物学过程，涉及抗炎、抗氧化、免疫和代谢调节，以及免疫球蛋白和细胞因子的产生，血清锌水平与总IgE呈负相关，与FEV1呈正相关[19]。有关血清铜/锌比与COPD的队列研究[20]表明在调整年龄、体重指数、吸烟、饮酒、2型糖尿病史、哮喘病史、慢性支气管炎病史、社会经济地位等混杂因素后，COPD的HR风险与血锌呈现负相关关系。部分坚果富含黄酮类化合物，当小气道受到刺激时，中性粒细胞被激活后释放弹性蛋白酶从而降解外源蛋白，破坏弹性纤维蛋白、纤连蛋白等细胞外间质，引起肺气肿改变，黄酮类化合物被证明可用于中性粒细胞相关炎症疾病的治疗[21]，是最有效的弹性蛋白酶释放抑制剂。1项针对
55413 名无COPD者随访研究表明类黄酮可减轻慢性阻塞性肺疾病风险，目前吸烟和既往吸烟者食用富含类黄酮饮食患COPD的获益更大[22]。总之，坚果中的多种营养成分可能对COPD具有预防作用.孟德尔随机化研究利用等位基因在减数分裂时独立分配，且在配子形成和受精过程中不发生重组这一原理使得遗传变异在个体间随机分配，从而模拟天然的随机对照试验来探究暴露因素与疾病之间的因果关系，能够有效减少偏倚，因此本研究结论相对可靠[23]，但本研究存在相对不足之处，首先因openGWAS数据库主要争对欧洲人群，缺乏其他人种数据，结论外推性可能欠佳；其次两样本MR分析方法本质上仍属于线性模型，无法拟合非线性关系，而真实世界中营养摄入量与疾病发生风险往往为非线性关系，另外因无个体特征数据，MR分析只能得到平均因果效应（average treatment effect，ATE），无法进行亚组分析，更难以推断个体因果效应（individual treatment effect，ITE）[24]。
本研究为接下来的研究供了流行病学调查基础，坚果摄入量与COPD的因果关联有待于大样本随机对照试验及不同种族背景人群数据来进一步证实。此外，未来的研究还需继续探究坚果预防COPD的作用机制，需要强调的是，坚果最佳用量尚不明确，也是未来研究的重要着眼点。简而言之，本研究采用两样本孟德尔随机化方法对坚果摄入量和COPD之间的因果关系进行初步探究，结果表明增加坚果摄入量可能降低COPD的罹患率，而我国居民平均年度坚果摄入量仅为3.6 g/d，不足推荐摄入量的一半，且远低于发达国家的摄入水平[25]，故而值得宣传推广。
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表 1 工具变量SNP信息表
Table 1. Instrumental variable SNP information table
SNPs CHR EA OA EAF β SE P F rs1413952 1 T C 0.48 9.83E-03 1.67E-03 4.30E-09 34.46 rs75641275 1 C A 0.14 −1.42E-02 2.39E-03 2.90E-09 35.25 rs261809 1 G A 0.54 −9.63E-03 1.68E-03 9.80E-09 32.88 rs11586016 1 C G 0.37 9.88E-03 1.73E-03 1.10E-08 32.59 rs72720396 1 G A 0.22 1.14E-02 1.99E-03 8.70E-09 33.12 rs11811826 1 A T 0.22 1.32E-02 2.01E-03 4.40E-11 43.42 rs7599488 2 T C 0.42 −1.04E-02 1.69E-03 6.70E-10 38.12 rs7582086 2 T G 0.46 −9.63E-03 1.67E-03 8.80E-09 33.08 rs4149513 2 A G 0.49 1.17E-02 1.67E-03 2.20E-12 49.25 ............................................. ............................................. rs1622515 11 G A 0.48 9.92E-03 1.67E-03 2.90E-09 35.23 rs3764002 12 T C 0.26 1.31E-02 1.90E-03 5.10E-12 47.65 rs61937394 12 G T 0.19 −1.30E-02 2.20E-03 3.20E-09 35.04 rs12890531 14 G A 0.21 1.12E-02 2.04E-03 4.50E-08 29.91 rs4140799 14 A G 0.53 9.46E-03 1.68E-03 1.80E-08 31.74 rs10129747 14 G A 0.53 9.36E-03 1.68E-03 2.60E-08 30.98 rs34162196 14 T C 0.1 −2.24E-02 2.77E-03 7.10E-16 65.09 rs270816 15 T A 0.12 −1.40E-02 2.51E-03 2.80E-08 30.83 rs1797235 15 C G 0.37 −1.00E-02 1.74E-03 8.90E-09 33.07 rs1582322 16 G A 0.6 9.94E-03 1.72E-03 6.80E-09 33.58 rs862227 16 G A 0.45 −9.16E-03 1.67E-03 4.30E-08 30.03 
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表 2 5种MR分析方法OR估计值及95%CI
Table 2. OR estimates and 95% CI of five MR analysis methods
方法 β SE P OR（95%CI） Q Q_pval MR Egger −0.09 0.05 0.084 0.91（0.82，1.01） 66.81 0 加权中位数法 −0.08 0.01 0.001 0.92（0.89，0.95） 67.36 0 逆方差加权 −0.06 0.01 0.001 0.94（0.92，0.95） 简单众数法 −0.1 0.03 0.001 0.90（0.85，0.95） 加权众数法 −0.09 0.03 0.001 0.91（0.86，0.95）
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