PCR-RFLP方法检测PARL基因Leu262Val多态性的实验研究
Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism in the Detection of Leu262Val Polymorphism of PARL Gene
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摘要: 目的 探讨聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法(PCR-RFLP)检测PARL基因Leu262Val多态性的最适实验条件.方法 在PCR实验中,运用降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)方法优化PCR条件;对引物终浓度设定0.8 μmol/L、0.6 μmol/L、0.4 μmol/L和0.32 μmol/L四个浓度梯度进行扩增;通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.在RFLP实验中,在内切酶量10 U不变的情况下,PCR产物量分别设定为5 μL、10 μL、15 μL;酶切时间分别设定为12 h、8 h、4 h、2 h、1 h酶切,反应完毕后通过2%琼脂糖凝胶电泳观察结果.结果 (1)降落PCR方法能有效降低或避免非特异性扩增;(2)引物浓度为0.4 μmol/L时,PCR产物量高且引物二聚体较少;(3)10 μL的PCR产物进行酶切,电泳结果清晰;(4)在37℃条件下酶切4 h能完全消化一个酶切体系中的PCR产物.结论 PCR实验中,TD- PCR优化了PCR条件,为扩增目的条带提供了快速、特异、可靠的方法,最适引物浓度为0.4 μm/L;RFLP实验中,最有效酶切方案为20 μL的体系中加10 μL产物和10 U内切酶,37 ℃消化4 h.
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关键词:
- 聚合酶链反应 /
- 限制性片段长度多态性 /
- PARL基因 /
- 实验条件
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