肌酸激酶和血红蛋白在湿热环境训练监控中的意义
Significance of Blood Creatine Kinase and Hemoglobin Monitoring in Physical Training under Humid-heat Environment
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摘要: 目的通过人体湿热环境下的体能训练与测试,检测人员血清中肌酸激酶和血红蛋白的水平,研究其与运动能力强弱、运动潜力大小和对外界环境的适应习服程度的相关性.方法选取某军校45名青年男性学员为受试对象,随机分为训练组和常规对照组,对训练组进行8周湿热环境负重跑训练,训练结束后行负重跑测试,测定其运动后血肌酸激酶和血红蛋白,同时记录运动成绩和运动后的肛门温度,分析计算两组的生理、生化指标的变化趋势和相关关系.结果训练后训练组的12 min负重跑成绩明显好于对照组,而运动后肛温则明显低于对照组;训练结束时两组的血红蛋白水平无明显差别,但训练组的运动后血肌酸激酶升高程度明显低于对照组.结论在相同海拔下,血红蛋白对环境习服和运动水平不具有指示意义,而运动后的血肌酸激酶水平可作为指示运动能力、习服程度和运动损伤的有益监控指标.Abstract: Objective To detect serum creatine kinase and hemoglobin level,and to study the correlation between those parameters and physical ability,state of fatigue,tissue damage and acclimation of the environment during training.Methods 45 young male cadets of a military university were recruited and divided randomly into training group and control group,cadets in the training group underwent a 8-week weight carrying running train in humid-heat environment.After training,cadets in both groups were performed running ...
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Key words:
- Humid-heat environment /
- Training /
- Acclimation /
- Rectal temperature /
- CK /
- Hb
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脂质体 （liposome，Lip）具备良好的生物相容性、靶向性和增强药物稳定性作用，是近年来较为前沿的一种颗粒型疫苗佐剂和靶向药物载体[1-2]，利用脂质体包裹药物可以提高其稳定性并且产生靶向作用。但是，普通脂质体极易从体内清除[3-4]，PEG是聚乙二醇英文名polyethylene glycol的简称，安全性和水溶性高，与生物组织有良好的相容性[5-7]。PEG6000修饰的脂质体能有效降低吞噬细胞识别摄取作用，从而延长其在体内的循环时间，有利于药物靶向浓集于病灶组织[8]，极大地提高目标药物的治疗指数和疗效[9-12]。除此之外，阳离子脂质体实际上也是一种很好的免疫佐剂，可以增强机体免疫应答。本文通过实验探究，筛选出PEG6000修饰流感疫苗脂质体中PEG6000的最佳用量和制备工艺，并且对所制备的脂质体进行初步的稳定性考察，探究其储存的时效性。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 流感疫苗
H1N1（批号：SA2018002），血凝素含量：225.0 μg/mL；H3N2（批号：SB2018002），血凝素含量：166.5 μg/mL；B（V）（批号：SC2018001），血凝素含量：369.1 μg/mL；B（Y）（批号：SC2018006 ），血凝素含量：326.1 μg/mL。（江苏沃森生物技术有限公司提供）。
1.1.2 实验动物
SPF级KM小鼠，雌性，标准体重（18～22g），昆明医科大学实验动物中心提供，[合格证号为SCXK9（滇）2005-0008]。本研究通过昆明医科大学伦理委员会审核批准。
1.1.3 主要试剂
大豆卵磷脂（北京美亚斯磷脂技术公司）；胆固醇（北京鼎国昌盛生物技术优先责任公司）；PEG6000（美国Sigma公司）；Folin酚蛋白定量试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）。
1.2 方法
1.2.1 PEG6000用量与处方筛选
冻融-冻干法制备脂质体[13]，将小鼠分为6组（n = 5），PEG6000剂量（摩尔百分比）：2%、4%、6%，PBS阴性对照组、中性组、疫苗原液组，通过脾淋巴细胞增殖实验，免疫7 d后的刺激指数（SI值）确定最佳的PEG6000的用量。以PEG6000的最佳剂量为基础，将小鼠分为5组（n = 5），PEG后修饰组、PEG共成膜组、PBS阴性对照组、中性组、疫苗原液组，免疫7 d后通过测定脾淋巴细胞增殖实验的刺激指数（SI值），筛选出PEG6000的最佳制备方法（共成膜法和后修饰法）。实验以疫苗原液组为阳性对照组，PBS为阴性对照组。
1.2.2 PEG6000修饰的流感疫苗脂质体稳定性研究
（1）PEG6000修饰的流感疫苗脂质体物理稳定性研究：将最佳工艺制备的PEG6000流感疫苗脂质体混悬液、冻干粉分别放置于不同温度[4 ℃、（25±2） ℃和（37±2） ℃]环境下进行温度加速实验。在规定时间点（0、1、2、6个月）取样，PBS复溶脂质体冻干粉，与混悬液分别于4 ℃、45000 r/min高速离心1h，用Lowry法[14]测定其包封率。考察 PEG6000流感疫苗脂质体混悬液和冻干粉包封率在不同时间点的变化情况，初步考察其物理稳定性。（2） PEG6000修饰的流感疫苗脂质体生物稳定性研究：①PEG6000修饰的流感疫苗脂质体免疫小鼠后免疫器官指数。不同温度[4 ℃、（25±2） ℃]条件下对最佳工艺制得的PEG6000脂质体冻干粉和中性脂质体冻干粉进行温度加速实验，疫苗原液组作为阳性对照始终储存于4 ℃。小鼠分为4组（n = 5），即PBS组、PEG冻干粉组、中性冻干粉组和疫苗原液组。在设定的时间点（1、2、3个月）[15]取样腹腔注射免疫小鼠，免疫7 d后称重，脱颈处死，取胸腺称重，计算胸腺指数。（指数 = 器官重量/体重g×10）[16]。②体液免疫。不同温度[4 ℃、（25±2） ℃]条件下对PEG6000流感疫苗脂质体冻干粉和中性脂质体冻干粉进行温度加速实验，疫苗原液组作为阳性对照始终储存于4 ℃。在不同时间点（1、2、3个月）取样腹腔注射免疫小鼠，免疫7 d后取血清，以微量血凝抑制法（HI）测定小鼠血清抗体滴度比，评价其免疫原性。
1.3 统计学处理
采用 SPSS18.0 统计软件进行分析，统计结果以均值±标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示，多组间比较选择单因素方差分析，组间两两比较选择LSD法进行，P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 PEG6000用量和制备工艺筛选结果
PBS阴性对照组与其他各组间SI值差异均有统计学意义（P < 0.05），PEG6000百分摩尔比4%组SI值与其他组差异均有统计学意义 （P < 0.01），且PEG6000百分摩尔比4%组的SI值高于其他各组。表明PEG6000百分摩尔比为4%时，PEG6000流感疫苗脂质体具有较好的免疫原性，见表1。
表 1 7 d 时的刺激指数[n = 5，（$ \bar x \pm s $ ）]Table 1. SI on 7 d [n = 5，（$ \bar x \pm s $ ）]分组 刺激指数SI值 F P PEG6000占磷脂的百分摩尔比 2% 1.3317 ± 0.0364△# 119.404 < 0.001* PEG6000占磷脂的百分摩尔比4% 1.5943 ± 0.0184△ PEG6000占磷脂的百分摩尔比 6% 1.4141 ± 0.0257△## PBS 阴性对照组 1.0458 ± 0.8870## 中性脂质体 1.3307 ± 0.0946△## 疫苗原液组 1.2421 ± 0.0459△## *P < 0.05。与PBS阴性对照组比较，△P < 0.05；与PEG6000占磷脂的百分摩尔比4%比较，##P < 0.05。 PBS阴性对照组与其他各组间SI值差异均有统计学意义（P < 0.01）；PEG6000后修饰组SI值与其他各组差异均有统计学意义（P < 0.01），且PEG6000后修饰组的SI值明显高于其余各组，表明 PEG6000后修饰为最佳制备工艺，见表2。
表 2 7 d 时的刺激指数[n = 5，（$ \bar x \pm s $ ）]Table 2. SI on 7 d [n = 5，（$ \bar x \pm s $ ）]分组 刺激指数SI值 F P PEG6000共成膜组 1.2629 ± 0.0350△## 7.643 < 0.001* PEG6000后修饰组 1.3407 ± 0.0210△ 疫苗原液组 1.0808 ± 0.0410△## 中性脂质体组 1.1647 ± 0.0450△## PBS阴性对照组 1.0335 ± 0.0070## *P < 0.05。与PBS阴性对照组比较，△P < 0.05；与PEG6000后修饰组比较，##P < 0.05。 2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的稳定性
2.2.1 PEG6000修饰流感疫苗脂质体的物理稳定性
在不同温度[4 ℃、（25±2） ℃、（37±2） ℃]放置，于设定的时间点取样测定PEG6000流感疫苗脂质体冻干粉和混悬液的包封率，可以看出冻干粉包封率明显高于混悬液，见表3。
表 3 PEG6000修饰的流感疫苗脂质体的包封率（%）Table 3. The encapsulation rate of PEG-modifed influenza vaccine liposome温度（℃） 时间（月） PEG6000冻干粉r PEG6000混悬液 4 0 95.51 62.40 1 91.17 67.02 2 86.54 60.35 6 82.20 28.18 25 ± 2 0 95.69 68.08 1 95.38 55.16 2 95.27 42.27 6 86.54 35.02 37 ± 2 0 97.43 70.86 1 95.65 65.81 2 93.12 65.69 6 83.83 0.14 2.2.2 PEG6000修饰流感疫苗脂质体生物稳定性研究
（1） PEG6000修饰流感疫苗脂质体免疫小鼠后免疫器官指数。不同温度[4 ℃、（25±2） ℃]中对脂质体冻干粉进行温度加速试验，在不同时间点取样腹腔注射免疫小鼠，疫苗原液始终贮藏于4 ℃。PEG6000脂质体冻干粉与中性脂质体冻干粉的胸腺指数相比具有差异，PEG6000脂质体冻干粉的胸腺指数明显高于中性脂质体，说明PEG6000脂质体冻干粉刺激小鼠免疫器官增大，反应其稳定性较好，见表4。（2）体液免疫。不同温度[4 ℃和（25±2） ℃]条件下对PEG6000脂质体冻干粉和中性脂质体冻干粉进行温度加速试验，疫苗原液始终贮藏于4 ℃，在不同时间点取样腹腔注射免疫小鼠7 d。结果表明PEG6000脂质体冻干粉的抗体滴度比高于中性脂质体， PEG6000脂质体冻干粉抗体滴度低于疫苗原液组但是却始终具有免疫原性（抗体滴度 > 4），表明PEG6000脂质体冻干粉的生物学稳定性较好，时效性较长，见表5。
表 4 PEG修饰的流感疫苗脂质体的胸腺指数（%）Table 4. The thymus index of PEG-modified influenza vaccine liposome （%）温度（℃） 时间（月） PBS 中性脂质体组 PEG6000脂质体组 疫苗原液组 4 1 4.98 6.04 6.14 4.77 2 4.49 5.69 5.99 5.13 3 4.22 5.29 5.32 5.07 6 3.89 4.62 4.90 5.16 25 ± 2 1 4.98 6.04 - 4.77 2 4.49 5.69 - 5.13 3 4.22 5.29 5.33 5.06 6 3.89 4.62 4.85 5.16 表 5 PEG 修饰的流感疫苗脂质体的抗体滴度比Table 5. The antibody titer ratio of PEG-modified influenza vaccine liposome温度
（℃）时间
（月）原液 中性脂质
体组PEG6000脂
质体组4 1 5.78 4.44 4.44 2 5.54 3.98 4.19 3 5.71 4.14 4.46 25 ± 2 1 5.78 4.17 4.37 2 5.54 4.06 4.34 3 5.71 3.98 4.05 免后免前抗体滴度 > 4表明具有免疫效应。 3. 讨论
PEG修饰的脂质体已经成为新一代疫苗佐剂和长循环给药系统[17-19]。状内皮系统细胞可轻松识别和摄取普通脂质体和免疫脂质体，以致药物在到达靶器官前即被清除，导致药效降低，维持时间变短[6, 20-21]。大量临床前研究表明，PEG作为水溶性材料，可以覆盖疏水性结合位点，阻止血浆成分接近进而降低识别和摄取，延长循环时间[22-25]。经修饰的脂质体在表面形成水化层能减弱与细胞表面配体的相互作用，以减慢磷脂双层膜的溶蚀融合作用，降低药物释放速度，因此，选择PEG修饰以期实现脂质体长循环作用[26]。
本实验通过筛选PEG6000的用量以及制备工艺，制备出的脂质体冻干粉在不同的温度下放置的各个时间段内，均表现出良好的物理及生物稳定性。已有大量研究围绕着其作为长循环药物载体展开，本实验通过免疫学方法将其作为佐剂研究，考察方法有所不同。只对工艺和稳定性进行考察并不全面，未来仍需对其免疫原性以及安全性方面进行考察，结合各方面，对PEG6000脂质体作为疫苗佐剂进行全面评价。
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