人鼻病毒（human rhinovirus，HRV）是由Pelon等^[1]于19世纪50年代首次从普通感冒患者中分离出，属于小角鼻病毒科的ssRNA病毒，是一种小型非包膜病毒，直径约27 nm，主要根据VP4/VP2衣壳蛋白基因序列分为HRV-A、HRV-B、HRV-C三大类，目前一共发现有171个血清型，是引起儿童呼吸道感染的最主要病原体之一。近年来国内外许多学者对不同国家、不同地区的HRV的流行病学作了相关研究，但针对昆明地区的研究较少。因此，本研究重点了解昆明地区急性下呼吸道感染（acute lower respiratory tract infection，ALRTI）住院患儿的HRV感染情况，并随机抽取部分阳性标本，测定VP4/VP2基因片段，进行基因分型。

1.   资料与方法

1.1   一般资料

1.1.1   研究对象

收集2019年1月至2019年12月在昆明市儿童医院住院的ALRTI病例共2260例，其中男1398例，女862例，男女比例为1.6∶1.0。纳入标准：（1）年龄29 d～14岁的患儿；（2）符合《诸福棠实用儿科学》（第8版）^[2]ALRTI诊断标准；（3）其他临床资料完整，如姓名、年龄、发病日期、临床症状、HRV检测结果等。排除标准：既往有免疫缺陷性疾病、慢性肺部疾病、先天性心脏病的患儿。

1.1.2   标本及临床资料收集

在患者住院24 h内采集鼻咽抽吸物或痰液，将标本装入专用痰液收集器放-70°留存待检。病例资料的收集由经过培训的临床医师完成。样本的采集过程及临床资料的获取均具备知情同意书。

1.2   方法

1.2.1   核酸提取

使用Geneaid公司的Viral Nucleic Acid Extraction Kit VR100V 试剂盒提取核酸，严格按照说明书进行操作。

1.2.2   病毒检测

使用Bio-Rad公司的iScript TM Cdna Synthesis Kit逆转录试剂盒进行逆转录反应。将之前提取的核酸作为模板，采用Tiangen公司的TaqDNA聚合酶以及PCR反应体系，巢式PCR扩增HRV-5′NCR基因，引物设计及基因扩增条件参考文献^[3]。选取HRV-5′NCR阳性标本扩增VP4/VP2基因片段，VP4/VP2引物设计参考文献^[4]。

1.2.3   结果观察

PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，全自动凝胶成像仪观察结果。

1.2.4   核苷酸序列测定及HRV分型

VP4/VP2基因扩增产物经电泳观察，阳性扩增产物由擎科生物公司进行纯化和测序。将测序结果采用NCBI网站上的Nucleotide Blast进行比对区分亚型。

1.3   统计学处理

采用SPSS 23.0软件进行统计学分析，计数资料用率（%）表示，采用χ²检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   HRV感染的性别分布

检出HRV阳性患儿共147例，感染率为6.50%，其中男性患儿90例，占阳性患儿中的61.22%，女性患儿57例，占阳性患儿中的38.78%。

2.2   HRV感染年龄分布

< 1岁、1～2岁、3～5岁及≥6岁患儿的HRV检出率分别为6.70%、6.88%、7.14%、3.92%。不同年龄ALRTI患儿HRV检出率，差异无统计学意义（χ² = 3.240，P = 0.356），见表1。

表  1  不同年龄ALRTI患儿HRV检出情况[n（%）]

Table  1.  HRV detection in children with ALRTI in different age groups [n（%）]

年龄（岁）		< 1	1～2	3～5	≥6	χ2	P
RV检测结果	阳性	72（6.704）	40（6.885）	25（7.143）	10（3.922）	3.24	0.356
	阴性	1002（93.296）	541（93.115）	325（92.857）	245（96.078）
合计		1074（100.000）	581（100.000）	350（100.000）	255（100.000）

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.3   HRV感染季节分布

不同季节病毒检出率存在差异，以夏季最高，其次为秋季（χ²= 37.674，P < 0.05），见 表2。

表  2  不同季节ALRTI患儿HRV检出情况[n（%）]

Table  2.  HRV detection in children with ALRTI in different seasons[n（%）]

季节		春（3月～5月）	夏（6月～8月）	秋（9月～11月）	冬（12月～2月）	χ2	P
RV检测结果	阳性	33（5.622）	56（10.000）	49（8.673）	9（1.642）	37.674	P < 0.001
	阴性	554（94.378）	504（90.000）	516（91.327）	539（98.358）
合计		587（100.000）	560（100.000）	565（100.000）	548（100.000）

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   HRV感染的分型

随机抽取40份阳性标本进行基因分型，结果23份为HRV-A型，5份为HRV-B型，12份为HRV-C型。其中HRV-A型最多，占57.50%（23/40）；其次为HRV-C型，占30.00%（12/40）；HRV-B型最少，仅占12.50%（5/40）。部分凝胶电泳结果，见图1。

图  1  VP4/VP2 2%凝胶电泳结果图

Figure  1.  VP4/VP2 2% gel electrophoresis

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.5   HRV检测阳性与HRV检测阴性患儿的临床表现比较

HRV检测阳性与HRV检测阴性患儿的临床表现在发热、咳嗽方面，差异无统计学意义（P > 0.05），但在喘息方面，差异有统计学意义（ P < 0.05），见 表3。

表  3  HRV检测阳性与HRV检测阴性患儿的临床表现比较[n（%）]

Table  3.  Comparison of clinical manifestations of children with positive HRV test and negative HRV test [n（%）]

临床表现		HRV检测		合计	P
		阳性	阴性
发热	有	62（42.177）	704（33.318）	766（33.894）	0.301
	无	85（57.823）	1409（66.682）	1494（66.106）
咳嗽	有	20（13.605）	331（15.665）	351（15.531）	0.712
	无	127（86.395）	1782（84.335）	1 909（84.469）
喘息	有	23（15.646）	104（4.922）	127（5.619）	0.030
	无	124（84.354）	2 009（95.078）	2133（94.381）

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

HRV是引起儿童呼吸道感染的最主要病原体之一，在世界各地都会引起呼吸道疾病。来自巴西^[5]、芬兰^[6]、俄罗斯^[7]等多地均有类似报道，检出率分别是35.4%、55%、41.7%、26%、10.7%。本组ALRTI患儿HRV检出率为6.50%，与青海相近^[8]，比北京（34.0%）^[9]低。不同地区HRV的检出率不同，可能与地域不同、纳入标准不同、研究方法不同、检测方法不同有关。

本组 < 1岁、1～2岁、3～5岁患儿的HRV检出率相似，≥6岁稍低，但不同年龄ALRTI患儿HRV检出率没有明显差异（ P > 0.05）。但国内外不同学者的研究结果不一致。赵梦川 ^[10]等的研究显示河北省在1 ～3 岁年龄组HRV检出率最高，而法国的Freymuth等^[11]的研究显示 < 6月（34.2%）及6月～2岁（37.8%）患儿的检出率相似，2～5岁（19.5%）患儿检出率稍低。还有研究指出在儿童中年龄较小的患儿更容易感染RV，急性下呼吸道感染住院的RV阳性儿童比RV阴性儿童年龄更小，早产儿童被发现特别容易受到RV感染 ^[6]。本研究的对象主要纳入的是ALRTI患儿，而上诉研究纳入的研究对象与本研究不一致，考虑研究结果不同与此有关。

HRV感染全年均有发生，但最常见于秋季和春季^[6]。自20世纪60年代开始，研究者对温带气候中RV感染的流行病学进行纵向研究，发现HRV感染率在初秋达到高峰，在春季出现较小的高峰^[12]，这与笔者的研究结果一致。但不同地区HRV流行高峰存在差异，有研究表明上海地区HRV流行高峰在冬季^[13]，而兰州地区HRV流行高峰为春季、秋季和冬季三个季节^[14]。不同地区HRV流行高峰存在差异考虑与不同地区气候不同、人体免疫力不同有关。

本研究显示在昆明地区ALRTI患儿中HRV-A型最多，其次为HRV-C型，HRV-B型最少。这与我国兰州地区Jin Y^[14]、重庆地区Lu QB^[15]、意大利Piralla等^[16]的研究结果相似，说明昆明地区HRV流行趋势与国内外基本一致。

有研究^[17]表明儿童在HRV感染后，可以出现不同的临床表现，从轻微的普通感冒和急性中耳炎扩展到严重的喘息。喘息性疾病（细支气管炎、反复喘息或哮喘加重）常与HRV有关，婴儿期HRV引起的喘息可能是儿童哮喘的第一个症状^[6]。本研究结果显示HRV感染后的患儿更容易出现喘息的临床表现，与之前的研究结果一致^[17]。出现此现象的原因，考虑与支气管上皮细胞在HRV感染后嗜酸性粒细胞的募集、诱导血管生成和促炎介质的产生有关^[18]。

本研究初步了解2019年昆明地区ALRTI住院患儿HRV感染的流行病学特征，为临床监测及疾病防控补充基础数据。但现有研究观察时间短、病例数少，有待延长研究时间、纳入更多病例进行进一步分析。且12%～22%的无症状人群可检出HRV感染^[19]，故在以后的研究中应注意加入对昆明地区无症状人群HRV的监测，有利于更准确、更有效的了解HRV的流行病学特征。