慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常见的慢性呼吸系统疾病，是基因易感患者在接触有害的气体或颗粒后出现气道和/或肺泡异常，最终出现呼吸道症状，如慢性咳嗽、咳痰、胸闷、气促；胸部CT影像提示肺部肺气肿征象；肺功能检测提示阻塞性通气功能障碍；最终导致患者生活质量下降、致残致死等不良结局，目前COPD已成为全球死亡和住院的主要原因 ^[1]。目前研究报道人类基因中只有1.5%左右的基因编码蛋白质，其它大量基因转录为非编码RNA。长链非编码RNA （long non-coding RNA，lncRNA）本身不具有编码蛋白质的功能，但可以抑制或增强蛋白质编码基因的表达^[2]，从多个层面参与调节细胞分化和个体发生的生理过程，也可参与炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等病理过程^[3]。

lncRNAs已经被证实在COPD发病过程中扮演了重要的角色^[4-6]，但其在COPD中的具体表达及其生物学功能仍未完全诠释清楚，本课题组前期基因芯片的结果发现lncRNA RP11-521C20与BMF mRNA有负相关关系，可能在BMF的基因转录和翻译上有重要作用。另采用RT-qPCR技术检测吸烟COPD合并肺癌及无COPD肺癌的远癌肺组织中基因表达量，结果显示吸烟COPD并肺癌患者肺组织中的BMF mRNA表达量高于无COPD肺癌者，相反lncRNARP11-521C20.3表达下调，同时大鼠COPD模型的肺组织检测结果也证实了该表达关系，通过mRNA和lncRNA基因芯片的结果，分析lncRNA RP11-521C20.3与BMF的共表达关系，结果显示两者存在负相关^[7]。据既往研究BMF在细胞凋亡通路中发挥重要作用^[8]，而lncRNA RP11-521C20.3则是调控其表达的重要分子，这提示lncRNA RP11-521C20.3可能在COPD的细胞凋亡机制中起重要作用。肺泡上皮细胞是肺的主要结构细胞，具有分泌肺表面活性物质、进行气体交换等作用。肺泡上皮细胞凋亡在COPD的发生、发展过程中起到了关键的作用，肺泡间隔内肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞进行性凋亡、细胞外基质丢失可导致肺泡腔扩大、肺泡间隔变薄，形成了COPD的肺气肿表现^[9-13]。本研究拟构建lncRNA RP11-521C20.3慢病毒过表达及敲减质粒，包装病毒后构建lncRNA RP11-521C20.3过表达及敲减A549稳转细胞株，为进一步研究lncRNA RP11-521C20.3在COPD 肺泡上皮细胞凋亡的分子生物学机制提供开展体外细胞实验的细胞模型。

1.   材料与方法

1.1   实验材料及试剂

A549和293T细胞购自赛百慷上海生物技术股份有限公司；TriQuick Reagent 总RNA提取试剂购自Solarbio公司；Ham's F-12K购自于Procell公司；胎牛血清购自于Sigma公司；嘌呤霉素购自于Beyotime公司；PBS 1×、0.25%胰蛋白酶消化液（含EDTA）、2xSYBR Green qPCR Master mix、Servicebio RT First Strand cDNA Synthesis Kit 购自于Serivicebio公司；TriQuick Reagent 总RNA提取试剂购自Solarbio公司；FastQuant RT Kit购自TIANGEN公司；异丙醇、无水乙醇、氯仿购自西陇化工公司；限制性内切酶SbfI/EcoRI、限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ购自天根生化科技（北京）有限公司；RP11-521C20抗体购自ABCAM公司；GAPDH抗体购自ABCAM公司；PCR仪购自Applied Biosystems公司；凝胶成像分析仪购自培清科技公司；冷冻高速离心机购自ThermoFisher公司；倒置显微镜购自Questar公司；倒置荧光显微镜购自Mshot公司；台式低速离心机购自可成仪器公司。

1.2   实验方法

1.2.1   LncRNA RP11-521C20.3过表达慢病毒质粒载体构建

（1）PCR扩增引物序列。在NCBI数据库中检索目的基因的mRNA序列，选择其CDS序列采用Primer 5.0引物设计软件按照引物设计原则进行引物设计。获得目的基因的上下游引物后在NCBI数据库中应用Primer-BLAST在线工具进行引物特异性检测，检测合格的引物用于后续实验。LncRNA RP11-521C20.3 PCR扩增引物序列步骤，见表1。

表  1  LncRNA RP11-521C20.3 PCR扩增引物序列步骤

Table  1.  LncRNA RP11-521C20.3 PCR amplification primer sequence

步骤	引物与试剂
扩增引物Forward	5′-CCCTGCTTTGGGGTTGTGA-3′
Reverse	5′-GGAGGCTTTGTGGCTTGCT-3′
PCR扩增体系	5×PrimeSTAR®Buffer 10 µL，dNTP Mixtur 4 µL，正、反向引物各1 µL，模板 DNA < 200 ng，PrimeSTAR® HS DNA Polymerase 0.5 µL，灭菌蒸馏水加至50 µL
反应条件	98℃ 10sec，55℃ 5sec，72℃ 1 min/kb，30个循环
扩增产物凝胶电泳	1.5%琼脂糖凝胶电泳
胶回收	TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0

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（2） LncRNA RP11-521C20.3过表达慢病毒重组载体构建。采用SbfI/EcoRI限制性内切酶对过表达载体进行酶切，酶切反应体系，见表2。

表  2  过表达重组载体构建酶切反应体系

Table  2.  Enzyme digestion reaction system for construction of overexpressed recombinant vectors

试剂	体积
质粒	2 μg
10 x反应Buffer	5 µL
SbfI	1 µL
EcoRI	1 µL
ddH2O	Up to 50 µL

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将上述试剂及材料混合，水浴锅（37℃）孵育2 h以上。琼脂糖凝胶电泳用于检测酶切产物的效果，琼脂糖凝胶电泳后将目标载体条带从凝胶上切下，回收凝胶。构建重组质粒（并设计1组不含lncRNA RP11-521C20.3片段的质粒作为对照组）。反应体系，见表3，过表达质粒图谱，见图1。

表  3  过表达重组质粒反应体系

Table  3.  Overexpressed recombinant plasmid reaction system

试剂	体积
5x反应Buffer	4 µL
插入片段	2 µL
线性化体	1 µL
无缝克隆酶	2 µL
CCH2O	Up to 20 µL

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图  1  LncRNA RP11-521C20.3过表达质粒图谱

Figure  1.  LncRNA RP11-521C20.3 overexpression plasmid

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将上述试剂混合均匀，37℃孵育30 min，置于冰上5 min。将适量反应液转移至DH5α感受态细胞，培养结束后，取适量菌液均匀涂抹于含氨苄青霉素的平板上，倒置于恒温培养箱中培养12～16 h。挑取1 µL作为模板进行菌落PCR鉴定。鉴定引物：Forward：5′-CCAGATCTGTTGACCAACTTTCAAGAGAAGTTGGTCAACAGATCTGG-3′，Reverse：5′-CCAGATCTGTTGACCAACTTCTCTTGAAAGTTGGTCAACAGATCTGG-3′。鉴定反应体系，见表4。PCR反应（94℃ 3sec；55℃ 30sec；72℃ 1 min/kb，循环30次）。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，选取阳性克隆转化子转化，挑菌，质粒抽提，并测序。目的质粒转染293T细胞后，RT-qPCR检测表达。

表  4  过表达重组质粒鉴定体系

Table  4.  Identification system of overexpressed recombinant plasmid

试剂	体积
Premix Tag	25 µL
模板	1 µL
引物1（20 µM）	1 µL
引物2（20 µM）	1 µL
超纯水	Up to 50 µL

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（3）慢病毒包装及滴度测定。转染前24 h，将293T细胞以5×10⁶细胞数/15 mL接种到10 cm培养皿中，待细胞密度达到70%后，在灭菌的离心管中加入试剂，见表5。室温温育15 min，然后将上述混合液加至293 T细胞的培养基中，充分混匀后，细胞培养箱（5% CO2，37 ℃）6 h，换新鲜培养基转染48 h，收集上清液，进行离心（半径5 cm，4000 r/min，4 ℃，10 min），采用0.45 µm滤器过滤上清液后，于40 mL超速离心管中进行离心（25000 r/min，离心半径12 cm，离心120 min），弃上清液，加病毒保存液，充分溶解后再次离心（10000 r/min，离心半径10 cm，离心5 min），上清液分装于试管中，-80℃保存。

表  5  慢病毒包装试剂

Table  5.  Lentivirus packaging reagent

试剂	体积
载体质粒	20 μg
pHelper 1. 0载体质粒	15 μg
pHelper2. 0载体质粒	10 μg
转染试剂	Up to 1mL

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1.2.2   LncRNA RP11-521C20.3慢病毒敲减重组载体构建

（1） 合成lncRNA RP11-521C20.3 shRNA序列。根据lncRNA RP11-521C20.3（Gene ID：NM_005082.5）序列设计了shRNA序列并进行合成设计，序列信息，见表6。

表  6  shRNA序列

Table  6.  shRNA sequence

名称	序列（5′-3′）
Y16185-F	CcggCCAGATCTGTTGACCAACTTTCAAGAGAAGTTGGTCAACAGATCTGGTTTTTTg
Y16185-R	aattcaaaaaaCCAGATCTGTTGACCAACTTCTCTTGAAAGTTGGTCAACAGATCTGG
GL427NC2-F	CcggCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGGTTTTTTg
GL427NC2-R	aattcaaaaaaCCTAAGGTTAAGTCGCCCTCGCTCGAGCGAGGGCGACTTAACCTTAGG

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（2）LncRNA RP11-521C20.3 shRNA载体构建

设计好siRNA靶点，进行引物合成。用寡糖退火缓冲液将合成的寡核苷酸溶解于20 μM溶液中，每条互补单链30 µL。然后将低聚核苷酸混合物在95℃的水浴锅中加热5 min，打开并在室温下自然冷却，形成双链低聚核苷酸片段。载体pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 进行AgeI和EcoRI双酶切，酶切反应体系，见表7，敲减表达质粒图谱，见图2。

表  7  敲减载体构建酶切反应体系

Table  7.  Enzyme digestion reaction system for knockdown vector construction

试剂	体积
质粒	2 μg
10x反应Buffer	5 μL
AgeI	1 μL
EcoRI	1 μL
ddH2O	Up to 50 μL

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图  2  LncRNA RP11-521C20.3敲减表达质粒图谱

Figure  2.  LncRNA RP11-521C20.3 knockdown expression plasmid map

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将上述试剂混合，37℃水浴锅孵育2 h以上。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳后将目标载体条带从凝胶中切断，进行胶回收。敲除片段连接到表达载体上，在16℃下连接过夜。连接产物转化至DH5α感受态细胞。挑取平板上长出的转化子于10 µL LB培养液中，取1 µL进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件，见表8。进行PCR反应（94℃ 3sec；55℃ 30sec；72℃ 1 min/kb。共30个循环）。对菌落鉴定得到的阳性克隆进行测序和验证。

表  8  敲减重组体PCR鉴定体系

Table  8.  Knock-down recombinant PCR identification system

试剂	体积
Premix Tag	2 μg
模板	1 μL
引物1（20 μM）	1 μL
引物2（20 μM）	1 μL
ddH2O	Up to 50 μL

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（3）慢病毒包装。将目的质粒转染至293T细胞并接种于10 cm培养皿，6 h后换液，继续培养72h。将上清液离心（4000 r/min，4 ℃，离心半径5 cm）。对浓缩病毒溶液进行过滤、收集和包装。将包装好的慢病毒转染293T细胞后检测病毒滴度。

1.2.3   慢病毒感染A549细胞及稳转细胞株建立

在6孔板中接种约1×10⁵个细胞/孔（次日细胞融合达到30%～40%）。本次实验MOI（感染复数推荐值w为5。根据公式：病毒体积（µL）=细胞数×MOI/滴度（TU/mL）×1000，即慢病毒添加量为：2.5/孔。加入病毒后混匀，继续培养。感染后12 h细胞形态良好，未发生不良反应，感染后24 h后更换新鲜培养基，继续培养。分别于感染48 h、72 h、96 h后在荧光显微镜下观察并作图。根据分子实验结果确认过表达/敲减慢病毒。在转染细胞中加入2 μg/mL嘌呤霉素清除未转染的细胞及已转染表达不正常的细胞。

1.2.4   RT-qPCR检测lncRNA RP11-521C20.3的表达

取细胞样品，按照说明提取总RNA，反转录得到cDNA，进行RT-qPCR检测，PCR体系为：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 µL，正反义链均各0.4 µL，cDNA 2 µL，加水至20 µL，95℃ 30sec，1个循环进行预变性；95℃ 15sec，60℃ 30sec，40个循环。数据采用仪器自带软件分析：ABI Prism7300 SDS Software。lncRNA RP11-521C20.3正向引物为5′CCCTGCTTTGGGGTTGTGA-3′，反向引物为 5′-GGAGGCTTTGTGGCTTGCT-3′。

1.3   统计学处理

采用SPSS 20.0处理分析数据，组间均数比较采用t检验。P < 0.05认为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   LncRNA RP11-521C20.3重组载体构建及鉴定

以人胚肾293细胞cDNA为模板进行PCR扩增得到全长lncRNA RP11-521C20.3片段。载体pcSLenti-pA-MCS-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE用SbfI/EcoRI内切酶酶切后与lncRNA RP11-521C20.3目的基因构建重组质粒，测序结果显示，质粒基因序列与目的基因序列一致，见图3。

图  3  lncRNA RP11-521C20.3过表达重组质粒测序结果

Figure  3.  Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 overexpressed recombinant plasmid

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设计并合成了siRNA核苷酸序列。将载体pSLenti-U6-shRNA-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE用AgeI和EcoRI双酶切，与经过退火获得的目的片段shRNA连接并过夜，转化DH5α感受态细胞，涂板，挑菌，质粒抽提，测序鉴定，结果显示插入的片段序列与设计合成的靶向lncRNA RP11-521C20.3核苷酸序列一致，见图4。

图  4  lncRNA RP11-521C20.3敲减重组质粒测序结果

Figure  4.  Sequencing results of lncRNA RP11-521C20.3 knockdown recombinant plasmid

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2.2   慢病毒包装及滴度测定

对构建好的lncRNA RP11-521C20.3重组载体进行包装，包装后的慢病毒转染293T细胞后，进行病毒滴度检测。结果显示：转染72 h，100×荧光显微镜下可观察到293T细胞荧光数量明显增加，见图5。计算转染时的细胞数、病毒稀释倍数、稀释后的病毒体积和每个基因组整合的平均病毒拷贝数，并计算病毒滴度。其中pcSLenti-pA-RP11-521C20.3-CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE（RP11-521C20.3过表达）滴度为：5.91E + 08（Tu/mL），pcSLenti-pA-MCS–CMV-SFH-EGFP-P2A-Puro-WPRE（RP11-521C20.3过表达对照）滴度为：6.64E + 08（Tu/mL），pSLenti-U6-shRNA（RP11-521C20.3）-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE（RP11-521C20.3敲减）滴度为：5.34E + 08（Tu/mL）。各慢病毒的滴度均大于1.0E + 08（Tu/mL），能满足后续实验要求。

图  5  293T细胞中慢病毒滴度检测荧光图片（100×）

Figure  5.  Fluorescent image of lentivirus titer detection in 293T cells （100×）

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2.3   稳转细胞株的筛选及鉴定

2.3.1   LncRNA RP11-521C20.3过表达稳转细胞株的筛选及鉴定

将过表达lncRNA RP11-521C20.3的慢病毒载体感染A549细胞，在感染后24 h、48 h、72 h在100×荧光显微镜下观察转染效率，并收集明场图像和荧光图像。结果表明lncRNA RP11-521C20.3过表达的慢病毒感染A549细胞72 h后，细胞转染效率大于90%，可以验证lncRNA RP11-521C20.3表达水平，见图6。

图  6  LncRNA RP11-521C20.3过表达慢病毒载体转染A549细胞明场图像和荧光图像（100×）

Figure  6.  LncRNA RP11-521C20.3 overexpressed lentiviral vector transfected A549 cells with bright field image and fluorescence image （100×）

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为了验证转染后RP11-521C20.3表达水平，转染96h后收集细胞样品进行RT-qPCR检测。结果表明，OV- lncRNA RP11-521C20.3组的lncRNA RP11-521C20.3基因mRNA表达量高于NC-lncRNA RP11-521C20.3组（P < 0.001），差异倍数为（20.43±0.69），见图7。

图  7  RT-qPCR检测A549稳转株中lncRNA RP11-521C20.3表达量

^*** P<0.001。

Figure  7.  The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain was detected by RT-qPCR

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2.3.2   LncRNA RP11-521C20.3敲减稳转细胞株的筛选及鉴定

分别用构建好的lncRNA RP11-521C20.3敲减的慢病毒载体，感染A549细胞，感染后24 h、48 h、72 h在100×荧光显微镜下观察转染效率并采集明场图像和荧光图像。结果表明：lncRNA RP11-521C20.3敲减的慢病毒感染A549细胞72 h后，细胞转染效率大于90%，可以进行一步验证lncRNA RP11-521C20.3表达水平，见图8。

图  8  RP11-521C20.3敲减慢病毒载体转染A549细胞明场图像和荧光图像（100×）

Figure  8.  RP11-521C20.3 knockdown virus vector transfected A549 cells bright field image and fluorescence image（100×）

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为了验证转染后lncRNA RP11-521C20.3表达水平，转染96 h后收集细胞样品进行RT-qPCR检测。结果表明，sh-lncRNA RP11-521C20.3组的lncRNA RP11-521C20.3基因mRNA表达量低于sh-NC组（P < 0.001），差异倍数为（0.21±0.08），见图9。

图  9  RT-qPCR检测A549稳转株中lncRNA RP11-521C20.3表达量

^***P < 0.001。

Figure  9.  The expression of lncRNA RP11-521C20.3 in stable A549 strain detected by RT-qPCR

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3.   讨论

lncRNAs因其在调节多种生物过程中的作用而备受关注，其可以通过靶向mRNAs调节不同的细胞过程，如增殖、凋亡、炎症、迁移和上皮-间质转化等，借此来调节慢性气道疾病的发生和进展^[14-15]。多研究^[16-18]提示COPD患者较健康者存在大量lncRNAs差异表达，且在COPD的相关发病机制如细胞增殖、细胞凋亡、炎症、肺功能受损中具有重要作用。Tang等^[16]对COPD和健康对照肺组织进行lncRNAs基因芯片分析发现，差异表达的lncRNAs有5，094个，其中TUG1、BC038205、MEG3、LOC646329和BC13059显著增加，SNHG5、LOC729178、LINC00229、LOC339529和PLAC显著减少，敲除lncRNA TUG1可通过抑制纤维连接蛋白和α-SMA的表达水平促进HFL1和BEAS-2B细胞增。Gu等^[19]发现lncRNA可能通过介导SIRT1/FoxO3a和SIRT1/p53信号通路，调控COPD患者AEC II的细胞衰老。CNVR_3425.1通过抑制lncRNA FENDRR水平，从而增加中国人群肺癌和COPD的罹患风险^[20]。lncRNA在COPD病理生理过程中的炎症反应和肺功能受损中发挥重要关键作用，研究发现lnc-IL7R表达降低不仅与气道上皮细胞的炎症有关，且能够预测肺功能受损、COPD恶化/加重^[6]。Bi等^[17]选取非COPD吸烟者、COPD吸烟者和健康不吸烟者的肺组织行全基因组lncRNAs分析，发现诱导RNA175876|ENST00000554946的表达可能影响炎症反应的过程。运动对COPD引起膈肌功能障碍的防治具有积极作用，刘等^[21]对其进行进一步研究发现，运动可以降低COPD诱导的lncRNA H19表达，从而抑制lncRNA H19通过靶向miR-181/PDCD4 轴促进与烟雾相关的慢性阻塞性肺病的进展。lncRNA CASC2过表达可减轻香烟烟雾提取物诱导的细胞凋亡和炎症反应，血清CASC2在重度COPD患者中过表达，且与非COPD吸烟者相比，COPD患者血清中CASC2降低，与FEV1呈正相关^[22]。Lnc-NEAT1的表达与GOLD分期及IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α水平呈正相关，在COPD急性加重期患者中最高，其次是COPD期患者和健康人群^[18]。

慢病毒载体可以有效地将外源shRNA或外源基因整合到宿主染色体中，长期表达目的基因序列，显著提高目的shRNA或目的基因的转导效率，从而实现目的shRNA或目的基因的稳定、长期表达^[23]。本课题组前期发现，与非COPD吸烟组相比，COPD组的lncRNA RP11-521C20.3表达下调，因此本研究拟构建lncRNA RP11-521C20.3过表达及敲减的A549细胞株，为研究lncRNA在COPD的凋亡机制中的具体机制作用做准备。AEC II的凋亡，在COPD的发病中具有重要作用，AEC II的凋亡可造成肺泡正常结构破坏，肺气肿形成^[24-25]，本研究采用的A549细胞为体外常用II型肺泡上皮细胞模型，通过重组质粒载体制备了lncRNA RP11-521C20.3过表达和敲减慢病毒，转染A549细胞后，成功获得了lncRNA RP11-521C20.3过表达和敲减的稳转细胞株，最终用RT-qPCR证明过表达组lncRNA RP11-521C20.3表达量较对照组上升，敲减组lncRNA RP11-521C20.3则较对照组下降。为后续感染AECⅡ凋亡细胞模型，观察lncRNA RP11-521C20.3过表达或敲减对肺泡上皮细胞存活与凋亡的影响，从而进一步研究阐明lncRNA RP11-521C20.3-BMF信号通路调控COPD中AEC Ⅱ凋亡的作用及机制提供部分实验依据。