砷是自然界分布非常广泛的一种非金属元素，其化合物可导致心血管疾病、糖尿病、癌症等多种疾病发病率增加^[1-4]。无机砷（iAs）进入人体之后被人体代谢主要生成一甲基胂酸（monomethylarsenic acid，MMA）和二甲基胂酸（dimethylarsenic acid，DMA），代谢产物主要通过尿液排出，因此尿中的砷化物常常作为砷暴露的标志物，不同代谢产物所占的比例常常用来反映个体对砷的代谢能力，发现砷代谢的能力和砷暴露导致的疾病密切相关，无机砷容易代谢为一甲基胂酸，但一甲胂酸转化为二甲基胂酸受阻的群体砷暴露后DNA损伤更高，以及砷相关疾病的发病率更高^[5-7]。

EGFR编码一种跨膜糖蛋白是蛋白激酶超家族的成员，该蛋白二聚化和酪氨酸自磷酸化，从而导致细胞增殖^[8]。PTEN被鉴定为一种肿瘤抑制因子^[9]。Kras编码一种小GTPase超家族成员的蛋白质^[10]。PIK3CA基因编码的蛋白质是作为催化磷脂酰肌醇3-激酶一个亚基而发挥功能^[11]。4个基因在癌症的发生、发展中均起重要作用，在多种肿瘤组织中就发现它们存在较高频率的突变^[8-11]。

砷暴露会导致基因损伤从而导致基因突变，而上述的4个基因肿瘤中均存在突变，因此砷作为一种重要的环境致癌物，是否会导致EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤值得探讨，因此本研究探索了砒霜厂职业砷暴露工人EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿砷及其代谢的关系。

1.   资料与方法

1.1   研究人群

本调查研究采用病例对照研究方式。砷暴露工人来自砒霜厂。砒霜厂主要生产纯度为99%的三氧化二砷（As₂O₃），因此职业暴露较为单纯。对照组的人群来源于居住在距离工厂约10～50 km的村庄的农民，没有职业砷暴露史，3个月内没有其他明显的砷暴露途径。所有受试者的生活和经济条件相似，且与周围神经系统的退行性疾病和癌症无关。访谈结束后，研究人员收集了劳动工人的流行病学资料、血样、尿样。血液样本通过EDTA管采集，尿液样本通过塑料瓶采集。样本采集过程参照文献^[12]。本研究通过昆明医科大学伦理委员会批准（批号KMMU2020MEC000）。

1.2   尿中砷化物浓度检测

检测尿液样本中3种砷（DMA、iAs和MMA）的水平。本检测方法的最小阈值是2 μg。采用尿肌酐试剂盒（jaffe法）检测尿肌酐。计算DMA、iAs和MMA与总砷（tAs）的比值（DMA%、MMA%和iAs%）。通过SMI、DMA%、MMA%和iAs%评估砷甲基化的效率^[12]。

1.3   DNA损伤评估

裂解外周血细胞并纯化基因组DNA。根据文卫华等^[12-13]的实验方案，Q-PCR用于评估基因DNA损伤。预变性时间为10 min，其他PCR条件根据LC®96荧光定量系统的默认设置进行。在本实验方案中使用了以下寡核苷酸序列。Kras上游：GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA，下游：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTA； EGFR上游： CAACAGCACATTCGACAGCC，下游： GCATTTTCAGCTGTGGAGCC；PTEN 上游：AGACCATAACCCACCACAGC，下游： CACCAGTTCGTCCCTTTCCA；PIK3CA上游：GCTCAAAGCAATTTCTACACGAGA，下游： TCCATTTTAGCACTTACCTGTGAC；β-actin上游： CGGGAAATCGTGCGTGACAT， 下游：GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。-ΔCt值用于评估基因的损伤水平。

1.4   统计学处理

经检验尿砷及其代谢产物、甲基化指数均不符合正态分布，数据表示为M（P₂₅，P₇₅）。将各数据进行对数转换，对数转换后数据服从正态分布，数据表示为$\bar x \pm s $，以此开展分析。通过Pearson相关分析DNA损伤与尿液砷含量的相关性。对照组和暴露组之间采用Student’t检验。所有统计均使用R3.4.1软件包进行。检验水准为α = 0.05。

2.   结果

2.1   一般情况

暴露组和对照组工人年龄、吸烟率、饮酒率的分布差异无统计学意义（P > 0.05）。而尿中iAs、MMA、DMA、MMA%、DMA%和 SMI在2组中差异具有统计学意义（P < 0.05），见表1。

表  1  受试人群的一般特征和尿砷水平（$ \bar{x} \pm s $）

Table  1.  General characteristics and urinary arsenic levels of the test population （$ \bar{x} \pm s $）

变量	对照组（n = 24）	暴露组（n = 78）	t	P
年龄（岁）	35.814 ± 3.241	36.531 ± 5.972	/	/
吸烟（是/否）	14/10	46/32	/	/
饮酒 （是/否）	11/13	38/40	/	/
iAs	0.439 ± 0.185	2.023 ± 0.464	16.291	< 0.001*
MMA	0.379 ± 0.153	2.141 ± 0.489	17.355	< 0.001*
DMA	1.124 ± 0.304	2.660 ± 0.516	13.824	< 0.001*
iAs%	13.763 ± 11.392	17.457 ± 12.409	1.299	0.197
MMA%	8.531 ± 2.322	19.150 ± 5.071	9.921	< 0.001*
DMA%	77.712 ± 12.001	63.393 ± 12.291	−5.019	< 0.001*
PMI	1.166 ± 1.290	1.614 ± 1.289	1.488	0.140
SMI	10.010 ± 3.777	3.763 ± 2.126	−10.291	< 0.001*
*P < 0.05。

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2.2   暴露组与对照组基因损伤的比较

暴露组工人EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤高于对照组，4个基因的平均损伤也高于对照组（P < 0.05），见表2。

表  2  受试人群的4个基因的损伤和平均损伤的比较（$ \bar{x} \pm s $）

Table  2.  Comparison of damage and average damage of 4 genes in the test population （$ \bar{x} \pm s $）

变量	对照组 （n = 24）	暴露组 （n = 78）	损伤变化	t	P
EGFR	2.299 ± 0.118	2.514 ± 0.047	0.215	2.024	0.046*
PTEN	2.432 ± 0.078	2.791 ± 0.065	0.359	2.884	0.005*
Kras	2.468 ± 0.124	2.818 ± 0.060	0.350	2.718	0.008*
PIK3CA	2.852 ± 0.061	3.225 ± 0.038	0.373	4.856	< 0.001*
平均损伤	2.512 ± 0.075	2.837 ± 0.036	0.325	4.181	< 0.001*
*P < 0.05。

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2.3   尿中代谢产物含量与基因损伤的关系

分析EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿中代谢产物含量关系，发现PTEN损伤与尿中iAs和MMA含量呈正相关，Kras与尿中MMA含量呈正相关，PIK3CA和平均损伤与尿中iAs、MMA和DMA含量均呈正相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），见表3。

表  3  3种砷化物含量与所有受试者基因DNA损伤水平的相关性

Table  3.  Correlation between the levels of three arsenicals and the levels of genetic DNA damage in all subjects

DNA 损伤	iAs			MMA			DMA
	r	P		r	P		r	P
EGFR	0.160	0.109		0.157	0.116		0.112	0.263
PTEN	0.235	0.018*		0.237	0.016*		0.185	0.063
Kras	0.182	0.068		0.200	0.044*		0.137	0.170
PIK3CA	0.324	0.001*		0.319	0.001*		0.269	0.006*
平均损伤	0.296	0.003*		0.302	0.002*		0.230	0.020*
数据分析采用皮尔逊相关法，*P < 0.05。

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2.4   尿中代谢产物含量与基因损伤的关系

分析EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿中代谢产物百分比关系，发现iAs%与基因损伤不存在相关关系（P > 0.05），MMA%与4个基因DNA损伤和平均损伤均存在正相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），DMA%与Kras、PIK3CA、平均损伤存在负相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），见表4。

表  4  3种砷化物尿中的百分比与所有受试者基因DNA损伤水平的相关性

Table  4.  3 Correlation between percentages of arsenic compounds in urine and levels of genetic DNA damage in all subjects

DNA损伤	iAs%			MMA%			DMA%
	r	P		r	P		r	P
EGFR	0.086	0.388		0.249	0.012*		−0.177	0.076
PTEN	0.059	0.554		0.319	0.001*		−0.185	0.063
Kras	0.110	0.269		0.354	< 0.001*		−0.241	0.015*
PIK3CA	0.121	0.224		0.329	0.0001*		−0.240	0.015*
平均损伤	0.125	0.210		0.427	< 0.001*		−0.285	0.004*
数据分析采用皮尔逊相关法，*P < 0.05。

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将样本按照二级甲基化指数的中位数分为2组，发现Kras、PIK3CA、平均损伤在高SMI组中较低（P < 0.05），见表5。

表  5  所有受试者按SMI水平分层的DNA损伤比较（$ x \pm s $）

Table  5.  Comparison of DNA damage stratified at SMI level for all subjects （$\bar x \pm s $）

变量	低SMI（n = 51）	高SMI（n = 51）	t	P
SMI[中位数（范围）]	2.654 （1.064-3.800）	7.444 （3.848-21.840）	/	/
EGFR	2.550 ± 0.065	2.377 ± 0.063	1.914	0.059
PTEN	2.811 ± 0.083	2.602 ± 0.070	1.932	0.056
Kras	2.874 ± 0.081	2.596 ± 0.074	2.537	0.013*
PIK3CA	3.252 ± 0.055	3.022 ± 0.042	3.345	0.001*
平均损伤	2.872 ± 0.049	2.649 ± 0.047	3.282	0.001*
*P < 0.05。

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3.   讨论

砷暴露可以导致肺癌、膀胱癌等多种疾病发生率显著提高，因为砷进入人体可以产生多重的效应^{[4, 14]}，其中导致DNA损伤是重要的效应之一^[12-13]，DNA损伤可能导致基因突变最终导致细胞癌变^[1-3]。有文献采用彗星实验和微核试验的方法研究砷暴露对DNA和染色体的损伤^[15-16]，发现砷暴露导致了损伤的增强^[17]。文卫华等^[12-13]利用PCR的检测方法发现砷暴露导致p53基因DNA的损伤增加，笔者的研究证实砷暴露会增加EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤，结果是一致的，也再次证实砷对与癌变相关基因的影响。

之前研究显示无机砷容易代谢为一甲基胂酸，但一甲胂酸转化为二甲基胂酸受阻的群体，其DNA损伤更为严重^[12-13]，基因表达变化更显著^[12-13]，而且砷相关疾病的发病率更高^[5-7]。高SMI和DMA百分比较高均表示对砷代谢能力强，笔者的结果显示高SMI的群体DNA损伤较低，DMA百分比与DNA损伤呈负相关，与文献一致，结合文献说明代谢能力强的个体砷的有害效应较低^{[5-7, 18]}，对健康影响相对小。

综上所述砷暴露和代谢能力影响了EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤，可能是砷致癌机制之一。