外伤性视神经损伤后大鼠视网膜中细胞因子的变化和来源
The Changes and Sources of Cytokines in the Retina of Rats after Traumatic Optic Nerve Injury
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摘要: 目的 利用大鼠视神经夹持损伤模型,观察视网膜中小胶质细胞和星形胶质细胞在不同时间点的激活水平,炎性介质和神经营养因子的时空表达变化情况,探讨这2种胶质细胞在大鼠视神经夹持损伤后在视网膜中可能的免疫调控机制.方法 建立SD大鼠视神经夹持模型,分别在建模后1 d、3 d、5d和7 d处死模型大鼠并取材.Western blot检测分析各时间点视网膜IL-1β和TNF-α及iNOS的表达变化情况;免疫荧光组织染色法标记检测各时间点视网膜小胶质细胞和星形胶质细胞的激活情况并检测相应组织中IL-1β、TNF-α、iNOS以及Nestin的表达及分布情况.结果 夹持组与对照组相比Western blot法检测发现IL-1β蛋白在损伤后3 d表达量最高,差异与对照组相比有统计学意义(P<0.05),5 d后表达下降,差异与对照组相比无统计学意义(P>0.05).TNF-α在损伤后各时间点表达均升高(P<0.05),损伤后3d表达量达到峰值,与对照组相比差异有显著统计学意义(P<0.01).iNOS水平在损伤后1d显著上升(P<0.05),且表达量最高,在损伤后3 d出现下降,差异与对照组相比无统计学意义(P>0.05).免疫组织荧光化学染色法显示手术组视网膜中小胶质细胞及星形胶质细胞出现了活化.在小胶质细胞中和星形胶质细胞中检测到了IL-1β,iNOS的表达,但在所有时间点都未能观察到星形胶质细胞中TNF-α的表达.在损伤后7d,在星形细胞中观察到了Nestin表达.结论 视神经夹持损伤后,视网膜内活化的星形胶质细胞和小胶质细胞是IL-1β、iNOS的主要来源.星形胶质细胞在该模型中随着时间的推移可能展现出神经保护作用.Abstract: Objective To explore the immunoregulatory mechanisms of glial cells in retina after optic nerve injury in rats by using rats with traumatic optic nerve injury as TON model to detect the activation of microglia,astrocyte,and observe the temporal and spatial expression of inflammatory mediators and neurotrophic factors in retina at different time points after TON. Methods We established an animal model of rat optic nerve traumatic and draw materials from the rats at 1d, 3d, 5d and 7d after injury.Western-blot was used to dectect the expression levels of IL-1β, TNF-α and iNOS at all time points after injury. Immunofluorescence staining was used to detect microglia, astrocytes and the specific lesions expression and distribution of IL-1β,TNF-α,iNOS,Nestin inthe retina. Results Compared with the control group, the expression of IL-1β protein was peaked at 3 days after injury, and the difference was statistically significant(P <0.05), the expression declined at 5 days, the difference was not statistically significant(P>0.05). The expression of TNF-α increased at all time points after injury(P<0.05), and the expression level of TNF-α reached the peak at 3 days after injury. Compared with the control group, the difference was a statistical significant(P <0.01). The level of iNOS was significantly up-regulated at 1 day after injury, and the expression level of iNOS was significantly higher than the control group,and the difference was statistically significant(P<0.05), the expression declined at 3 days, the difference was not statistically significant(P>0.05). Immunohistochemical staining showed that after the injury,we can observe the activation of microglia and astrocytes. IL-1β and iNOS were expressed in activated microglia and astrocytes.But we were unable to observe the expression of TNF-α in astrocytes at all time points. Nestin expression was observed in astrocytes at 7 days after injury. Conclusions The activated astrocytes and microglia in retina are the main sources of IL-1β and iNOS after traumatic optic nerve injury. The activated astrocytes may have neuroprotective effects in the model.
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Key words:
- Optic nerve injury /
- Retina /
- Microglia /
- Astrocyte /
- Activation /
- IL-1β /
- TNF-α /
- iNOS /
- Nestin
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腰椎间盘突出（lumbar disc herniation，LDH）是临床常见疾病，主要以退行性病变为病理基础，该病常因外力外伤、久坐劳损等诱发，造成椎间盘纤维环破裂，压迫局部神经，导致患者产生不同程度腰腿部疼痛[1]。LDH易反复发作、病程迁延，好发于25～50岁群体，据调查数据显示，其发病率约占腰腿痛的60%[2]。
维生素D人体中比较重要的脂溶性维生素，可维持正常骨骼内环境稳定，一些研究报告发现，维生素D缺乏可增加发生LDH风险性[3-4]。维生素D以活性形式存在，包括25-羟基维生素D（25-hydroxyvitamin D，25-OH-D）、25-OH-D3、1，25-二羟基维生素D等，25-OH-D是维生素D主要循环形式，是诱发骨代谢、骨发育的主要因素[5]。基于此，本研究选取我院高海拔地区200例初治LDH患者作为研究对象，首次分析LDH人群血清25-OH-D水平的临床意义及预测价值，旨在为临床诊疗提供参考。
1. 材料与方法
1.1 研究对象选取
选取2021年8月至2022年7月我院200例初治LDH患者作为研究组，另选同期、同年龄段100例健康志愿者作为对照组。
诊断标准：均符合《腰椎间盘突出症防治指南》中LDH诊断标准[6]：腰背部疼痛反复发作，腰部活动受限，且有下肢放射；有局限性压痛点；直腿抬高试验和加强试验呈阳性；皮肤感觉、肌力和腱反射改变；腰椎CT显示椎间盘。
纳入标准：均符合以上诊断标准；均为初治患者，未接受相关药物治疗。
排除标准：合并风湿性关节炎、强直性脊柱炎、腰椎滑脱等腰椎疾病者；妊娠期或哺乳期女性；内分泌系统疾病；骨质疏松；恶性肿瘤；既往存在腰椎手术史者；精神、意识异常者；自身免疫性疾病；严重肝肾等脏器功能异常；急慢性感染疾病；先天性脊柱畸形者。
1.2 方法
1.2.1 血清25-OH-D水平
收集2组入选次日空腹静脉血5 mL，3500 r/min离心10 min取上清液，采用高效液相色谱-质谱联用法检测血清25-OH-D水平。
1.2.2 病情程度评估
研究组患者入院当天，由专业医师通过视觉模拟（visual analogue scales，VAS）评分法评估病情，包括疼痛部位、疼痛频次、疼痛性质、伴随症状、食欲和睡眠6个维度，总分10分，无痛0分；轻度：1～3分（睡眠不受影响）；中度：4～6分（睡眠受影响）；重度：7～10分（严重影响睡眠）。
1.2.3 椎间盘退变程度评估
参照改良Pfirrmann分级法[7]分为轻度退变（Ⅰ～Ⅱ级）、中度退变（Ⅲ级）、重度退变（Ⅳ～Ⅴ级）。
1.3 治疗及疗效评估
研究组患者常规行康复综合训练给予针灸、中频、腰椎间盘突出推拿治疗，1次/d。
治疗3个月后评估疗效[8]，优：腰疼等临床完全消失，直腿抬高 > 90°，Oswestry功能障碍指数（oswestry disability index，ODI）评分为0～12分；良：临床症状有所减轻，直腿抬高70°～90°，ODI评分为13～37分；差：未达以上标准。其中优、良视为疗效良好（n = 116），差视为疗效不良（n = 84）。
1.4 观察指标
（1）比较2组一般资料（性别、年龄、体重指数、职业类型、吸烟、饮酒）、25-OH-D水平。（2）比较研究组不同临床特征（年龄、体重指数、性别、职业类型、病变部位、病情程度、椎间盘退变程度）患者25-OH-D水平。（3）分析研究组血清25-OH-D水平与临床特征的相关性。（4）单因素分析初治LDH患者疗效。（5）多因素分析初治LDH患者疗效。（6）比较不同疗效患者治疗后血清25-OH-D水平变化。（7）分析治疗后血清25-OH-D水平与疗效的相关性。
1.6 统计学处理
用统计学SPSS 25.0软件处理数据，计量资料以n（%）表示，χ2检验，等级资料用Ridit检验；计量资料用S-W正态性和Bartlett方差齐性检，确认近似服从正态分布且满足方差齐性检验，以（
$\bar x \pm s $ ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，事后比较用LSD-t检验，两组间比较采用配对样本t检验；相关性分析采用Pearson/Spearman；多因素分析用Logistic；不同组间、时间、组间-时间交互作用采用重复测量方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 2组一般资料、25-OH-D水平比较
2组一般资料比较均差异无统计学意义（P > 0.05）；研究组血清25-OH-D水平较对照组低（P < 0.05），见表1。
表 1 2组一般资料、25-OH-D水平对比[（$\bar x \pm s $ ）/n（%）]Table 1. General data and comparison of 25-OH-D levels between the two groups [（$\bar x \pm s $ ）/n（%）]项目 研究组
（n = 200）对照组
（n = 100）t/χ2 P 性别 0.817 0.366 男 115（57.50） 52（52.00） 女 85（42.50） 48（48.00） 年龄（岁） 47.26 ± 8.13 45.91 ± 7.86 1.371 0.171 体重指数（kg/m2） 23.46 ± 2.17 23.20 ± 1.95 1.011 0.313 职业类型 0.440 0.507 脑力劳动 120（60.00） 56（56.00） 体力劳动 80（40.00） 44（44.00） 吸烟 1.085 0.298 是 53（26.50） 21（21.00） 否 147（73.50） 79（79.00） 饮酒 0.629 0.533 是 33（16.50） 13（13.00） 否 167（83.50） 87（87.00） 25-OH-D（ng/ml） 20.41 ± 6.18 33.56 ± 8.24 15.488 < 0.001 2.2 研究组不同临床特征患者25-OH-D水平比较
研究组不同性别、年龄、体重指数、职业类型、病变部位患者血清25-OH-D水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；随着病情程度、椎间盘退变程度加重，血清25-OH-D水平逐渐降低（P < 0.05），见表2。
表 2 研究组不同临床特征患者25-OH-D水平对比（$\bar x \pm s $ ，ng/mL）Table 2. Comparison of 25-OH-D levels in patients with different clinical characteristics in the study group （$\bar x \pm s $ ，ng/mL）指标 n 25-OH-D t P 年龄（岁） < 40 86 21.19 ± 6.79 1.504 0.134 ≥40 114 19.82 ± 6.05 体重指数（kg/m2） < 24 126 21.03 ± 6.56 1.794 0.074 ≥24 74 19.35 ± 6.10 性别 男 115 20.86 ± 6.53 1.166 0.245 女 85 19.80 ± 6.11 职业类型 脑力劳动 120 20.79 ± 6.48 1.048 0.296 体力劳动 80 19.84 ± 5.97 病变部位 L3～4 58 20.79 ± 6.32 0.321 0.726 L4～5 65 20.58 ± 6.20 L5～S1 77 19.98 ± 6.04 病情程度 轻度 76 23.51 ± 6.39 21.770 < 0.001 中度 65 20.29 ± 6.02 重度 59 16.55 ± 5.43 椎间盘退变程度 轻度 82 23.74 ± 6.41 28.789 < 0.001 中度 70 19.83 ± 5.97 重度 48 15.57 ± 5.16 2.3 血清25-OH-D水平与临床特征的相关性
相关性分析显示LDH患者血清25-OH-D水平与性别、年龄、体重指数、职业类型、病变部位无明显相关性（P > 0.05），与病情程度、椎间盘退变程度呈负相关关系（P < 0.05），见表3。
表 3 血清25-OH-D水平与临床特征的相关性Table 3. Correlation between serum 25-OH-D level and clinical features指标 年龄 体重指数 性别 职业类型 病变部位 病情程度 椎间盘退变程度 25-OH-D r 0.216 0.225 0.193 0.171 0.154 −0.527 −0.584 P 0.103 0.097 0.125 0.184 0.216 < 0.001 < 0.001 2.4 初治LDH患者疗效的单因素分析
研究组治疗3个月后，疗效良好116例，疗效不良84例。单因素分析显示，年龄、体重指数、病情程度、椎间盘退变程度、治疗前血清25-OH-D水平与初治LDH患者疗效存在关联性（P < 0.05），见表4。
表 4 初治LDH患者疗效的单因素分析[（$\bar x \pm s $ ）/n（%）]Table 4. Univariate analysis of curative effect of initial treatment of LDH patients [（$\bar x \pm s $ ）/n（%）]项目 疗效良好（n = 116） 疗效不良（n = 84） t/χ2/u P 性别 0.9 男5 0.339 男 70（60.34） 45（53.57） 女 46（39.66） 39（46.43） 年龄（岁） 44.19±7.25 51.50±8.09 6.702 < 0.001 体重指数（kg/m2） 23.09±1.83 23.97±2.14 3.124 0.002 职业类型 2.494 0.114 脑力劳动 75（64.66） 45（53.57） 体力劳动 41（35.34） 39（46.43） 文化水平 0.560 0.576 初中及小学 21（18.10） 17（20.24） 高中及中专 46（39.66） 35（41.67） 大专及以上 49（42.24） 32（38.10） 吸烟 1.470 0.225 是 27（23.28） 26（30.95） 否 89（76.72） 58（69.05） 饮酒 2.554 0.110 是 15（12.93） 18（21.43） 否 101（87.07） 66（78.57） 治疗期间是否正常工作 1.946 0.163 是 92（79.31） 73（86.90） 否 24（20.69） 11（13.10） 病变部位 0.639 0.523 L3～4 31（26.72） 27（32.14） L4～5 39（33.62） 26（30.95） L5～S1 46（39.66） 31（36.90） 病情程度 3.000 0.003 轻度 54（46.55） 22（26.19） 中度 36（31.03） 29（34.52） 重度 26（22.41） 33（39.29） 椎间盘退变程度 2.593 0.010 轻度 56（48.28） 26（30.95） 中度 39（33.62） 31（36.90） 重度 21（18.10） 27（32.14） 治疗前25-OH-D（ng/m） 22.18±6.28 17.97±5.63 4.885 < 0.001 2.5 初治LDH患者疗效的多因素分析
以初治LDH患者疗效为因变量（疗效良好赋值1，不良赋值2），以年龄、体重指数、病情程度、椎间盘退变程度、治疗前血清25-OH-D水平为因变量，考虑到血清25-OH-D水平与病情程度、椎间盘退变程度存在相关性，因此将病情程度、椎间盘退变程度排除，仅将年龄（赋值：连续变量，原值代入）、体重指数（赋值：连续变量，原值代入）、治疗前血清25-OH-D水平（赋值：连续变量，原值代入）纳入Logistic进行多因素回归分析，结果显示显示年龄、体重指数、治疗前血清25-OH-D水平为初治LDH患者疗效的影响因素（P < 0.05），见表5。
表 5 初治LDH患者疗效的多因素分析Table 5. Multi-factor analysis of curative effect of initial treatment of LDH patients变量 β S.E. Wald χ2 OR 95%CI P 下限 上限 年龄 1.493 0.402 13.790 4.450 2.103 9.415 < 0.001 体重指数 1.206 0.386 9.767 3.341 1.637 6.820 < 0.001 25-OH-D −1.335 0.451 8.762 0.263 0.116 0.597 < 0.001 2.6 不同疗效患者治疗后血清25-OH-D水平变化
疗效良好患者治疗1个月、2个月、3个月后血清25-OH-D水平较疗效不良患者高（P < 0.05），见表6。
表 6 不同疗效患者治疗前后血清25-OH-D水平（$ \bar x \pm s$ ，ng/mL）Table 6. Serum 25-OH-D levels in patients with different therapeutic effects before and after treatment （$\bar x \pm s $ ，ng/mL）疗效 n 治疗1个月后 治疗2个月后 治疗3个月后 良好 116 22.63 ± 6.42 23.21 ± 6.37 23.58 ± 6.26 不良 84 18.02 ± 5.71 17.86 ± 5.83 18.24 ± 5.77 t 5.247 6.073 6.151 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 2.7 治疗后血清25-OH-D水平与疗效的相关性
相关性分析显示，研究组治疗1个月、2个月、3个月后血清25-OH-D水平与疗效呈正相关关系（P < 0.05），见表7。
表 7 治疗后血清25-OH-D水平与疗效的相关性Table 7. Correlation between serum 25-OH-D level and therapeutic effect after treatment指标 治疗1个月后 治疗2个月后 治疗3个月后 疗效 r 0.468 0.491 0.523 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 3. 讨论
正常情况下椎间盘富有弹性和韧性，具有吸收震荡、缓冲和分散外力，有强大的抗压能力，可有效保护椎体的稳定和平衡，从而维系脊柱正常的生理载荷[9]。但受到某些内因或外因刺激可导致椎间盘退行性改变和椎间盘内压异常升高，常见的内因有营养因素，椎间盘主要通过软骨终板途径进行营养代谢，经弥散通透作用营养髓核和纤维环，一旦体内营养摄入或供应不足可引起椎间盘退变[10]；此外，血液在椎体纤维环、松质骨与不含血管的髓核间相互贯通，骨量减少、骨折等力学因素改变可影响软骨板和骨的通透性，阻碍髓核的营养供给，造成LDH，从而引起腰腿部疼痛等症状[11]。
近年研究显示，骨量减少、骨密度降低及骨组织结构退化是诱发骨质疏松症的基础，也是影响LDH的主要因素[12-13]。随着我国老龄化进展加快，LDH患病率逐年上升，严重影响人们日常生活水平[14]。维生素D及其活性产物生理作用是促进小肠、肾脏对钙磷吸收，促进骨对矿物质吸收，从而保证电解质平衡和骨发育[15]。25-OH-D是维生素D的活性形式，临床上将25-OH-D水平 < 20 ng/mL定义为缺乏，20～30 ng/mL定义为不足[16]，一项随机观察研究显示，低水平25-OH-D可减少肠钙吸收，从而导致甲状腺功能亢进，进一步激活破骨细胞骨量减少，加快骨骼疾病发展[17]；Kim等[18]研究发现，维生素D缺乏与腰椎退变性椎管狭窄密切相关。还有研究发现，在大鼠椎间盘纤维环细胞中25-OH-D水平较低，可加快椎间盘外基质降解，还可破坏线粒体功能，进而诱导椎间盘纤维坏细胞氧化损伤和凋亡，加重疾病发展[19]。王俊武等[20]研究发现，腰椎间盘退变程度越严重，维生素D水平越低，可见，维生素D及其活性形式与腰椎间盘退变发展密切相关。本研究发现，LDH患者血清25-OH-D水平低于健康志愿者，患者病情程度、椎间盘退变程度越重，血清25-OH-D水平就越低；相关性分析显示，血清25-OH-D水平与与病情程度、椎间盘退变程度呈负相关，提示血清25-OH-D水平变化可能与LDH疾病发展密切相关。笔者推测：患者营养不能及时供应髓核和纤维环，营养供应不足导致患者椎间盘退变，导致血清中25-OH-D水平降低，可进一步加重患者病情程度、腰椎间盘退变程度。
目前临床LDH治疗方法主要包括物理疗法、药物治疗、康复治疗等[21]，有研究发现，超声波联合牵引治疗LDH患者疗效明显，可明显减轻患者腰痛、行走等临床症状[22]。本研究LDH患者采用超声波和牵引治疗3个月后，发现116例疗效良好，且年龄、体重指数、治疗前血清25-OH-D水平与初治LDH患者疗效密切相关，可能是因为患者血清25-OH-D水平较低，且年龄越大，骨脆性增加、骨流失严重，加上体重指数越大，患者椎间盘营养供给失衡严重，可加快腰椎间盘退变进展。本研究还发现，疗效良好患者治疗1个月、2个月、3个月后血清25-OH-D水平高于疗效不好患者，且与疗效呈正相关。提示治疗期间动态监测血清25-OH-D水平水平变化有助于反应疗效。
综上所述，高原海拔地区LDH人群血清25-OH-D水平较低，且与病情程度、椎间盘退变程度呈负相关，还具有一定临床适用性，为高海拔地区LDH诊治提供参考依据。
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