实时定量PCR检测白色念珠菌方法学的建立
Establishment of Detection Methodology of C.albicans by Real-time PCR
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摘要: 目的 采用Taq Man MGB探针技术, 建立白色念珠菌实时荧光定量PCR (RQ-PCR) 检测方法, 为临床白色念珠菌的检测提供快捷的方法.方法 以真菌D1/D2区基因的一段高度保守序列为扩增靶序列, 合成白色念珠菌特异性引物和探针, 提取白色念珠菌标准菌株的DNA, 构建含有靶基因片段的重建质粒, 扩增后DNA作为标准品, 建立白色念珠菌RQ-PCR的标准曲线, 并对其重复性、敏感性及特异性等方面进行方法学评价.结果 对构建好的克隆质粒测序, 插入片段与预期片段序列一致, 相似性达100%.白色念珠菌标准曲线为Y=-3.824x+41.36, R2=0.990, 该扩增曲线形态良好.结论 成功建立了实时荧光定量PCR检测白色念珠菌的方法, 其敏感性和特异性较好.Abstract: Objective To use TaqMan MGB probe technology to establish a detection methodology of Candida albicans (C.albicans) by real-time fluorescence quantitative PCR (RQ-PCR) and to provide a quick method for the detection of candida infection in clinical settings. Methods D1/D2 region of candida species which is a highly conserved sequence gene was selected as amplification target sequence and specific primers and probes for C.albicans were synthesized. The DNA of standard strains of C.albicans was extracted and rebuilt plasmid containing the target gene fragment was constructed. The DNA was amplified as a standard to establish the standard curve of C.albicans and methodological evaluation was conducted to identify the linear range, repeatability, sensitivity, specificity and so on. Results After sequencing the recombinant cloning vector, the sequence of the fragment inserted was consistent with the expected sequence, with the similarity of 100%. C.albicans standard curve Y =-3.824 x +41.36, R2= 0.990, which was in good shape and illustrated the detection method of C.albicans by real-time PCR had successfully established. Conclusion The detection method of C.albicans by real-time PCR has better sensitivity and specificity.
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Key words:
- Real-time quantitative PCR /
- Candida albicans /
- Methodology
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青少年特发性脊柱侧弯（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）是脊柱的三维畸形，不仅表现在冠状面上脊柱偏离中线，呈现出“S”或“C”型外观，同时在水平面上椎体也会发生旋转并伴随矢状面脊柱前凸和后凸的变化，目前还没有明确病因[1]。AIS总体发病率约为3%，女性患病率更高，约是男性的7倍[2]。国际脊柱侧凸研究学会根据Cobb角的大小将AIS分为轻度：10°～25°，中度：25°～45°，重度：>45°[3]。AIS早发现、早诊断、早治疗可以有效减少其并发症，延缓或防止脊柱畸形，及时纠正脊柱的生物力学不平衡，减轻患者疼痛，改善形态，提高患者的功能和生活质量[4]。脊柱的移位和旋转对胸廓和邻近内脏的形态有着深远的影响。正常的胸腔肺脏容积以及维持胸腔容积变化的膈肌和肋间肌的舒缩活动是维持呼吸功能所具备的，肋膈角距越大，膈肌和肺越发达，肺容量也就越大[5]。未治疗的脊柱侧弯可能导致肺部症状，其患病率可高达22%～33%[6]。无论患者骨骼是否成熟，侧弯角度都可能以不同的速度发展，并随着肺功能的进行性损害而变严重，可能出现胸部活动度降低，呼吸模式改变。
目前临床肺功能测试（pulmonary function test，PFT）研究多聚焦于重度AIS患者肺活量检查相关指标的改变，而肺功能的评估手段除了肺活量检查，呼吸肌力量的评估也有重要意义。研究发现Cobb角>40°的主胸弯患者可出现中度至重度肺功能损害，腰弯患者仅表现出轻度肺功能障碍[7]。因此，轻、中度AIS患者肺功能是否存在障碍和严重程度需要进一步研究。人体主要的吸气肌是膈肌，主要呼气肌是腹横肌，肋间肌、颈部肌、肩带肌也参与呼吸过程。呼吸肌强度可以通过测量呼吸系统产生的最大静压来评估[8-9]，通过测量最大吸气压力（maximum inspiratory pressure，MIP）和最大呼气压力（maximum expiratory pressure，MEP）来实现。因此本研究采用多维度指标研究轻、中度AIS患者肺功能和呼吸肌力，并探索Cobb角、侧弯类型与肺功能、呼吸功能变化的相关性。同时，在临床上为AIS患者肺功能相关的评估和干预提供科学依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2022年6月至10月在昆明医科大学第二附属医院骨科的50名AIS患者，其中轻度AIS患者20名（Cobb角度10°～ 25°），中度AIS患者30名（Cobb角度26°～ 45°），并招募了50名同年龄段健康青少年。AIS组纳入标准[10]：（1）确诊为AIS患者；（2）年龄10～18岁；（3）10°≤Cobb角≤45°；（4）无认知障碍，具有配合完成肺功能检查的能力；（5）未做过手术治疗；（6）签署知情同意书。排除标准：（1）伴有先天性心脏疾病；（2）近3个月内有肺部感染或其他肺部疾病；（3）伴有神经系统发育异常。健康组纳入标准：（1）年龄10～18岁；（2）0°≤Cobb角 < 10°；（3）无神经骨骼肌肉系统疾病等其他系统疾病和手术史；（4）签署知情同意书。AIS组与健康组性别构成比、年龄、身高、体重差异无统计学意义（ P > 0.05），其中AIS患者的Cobb角范围为（29.720±11.875）°，见 表1。本研究通过昆明医科大学伦理委员会申请（批件号：KMMU2021MEC093）。
表 1 2组一般资料比较（ $\bar x \pm s $）Table 1. Comparison of two groups of general data （ $\bar x \pm s $）组别 n 性别（n） 年龄
（岁）身高
（cm）体重
（kg）BMI（kg/m2） 男/女 侧弯组 50 5/45 14.920 ± 2.183 1.610 ± 0.075 47.536 ± 7.279 18.264 ± 2.009 健康组 50 6/44 14.240 ± 2.543 1.580 ± 0.099 46.930 ± 11.032 18.601 ± 3.186 χ2/t 0.090 1.696 1.694 0.324 −0.632 P 0.764 0.093 0.094 0.094 0.746 1.2 呼吸肌功能评估
MIP指在功能残气位时，气道阻断情况下的最大吸气口腔压，受试者先最大程度呼气，再最大程度吸气，可评估吸气肌肌力；MEP指在肺总量位时，气道阻断情况下的最大呼气口腔压，受试者先最大程度吸气，再最大程度呼气，可评估呼气肌肌力[11]。采用Micro RPM数字呼吸肌力计测量呼吸肌的力量，由同一位物理治疗师对全部受试者进行测试。受试者在坐位下完成用力吸气和呼气测试，重复3～5次，取最大值。
1.3 肺功能测试
PFT是无创伤性的物理检查方法，包含肺活量检查、支气管舒张试验、支气管激发试验、弥散功能检查等。肺活量检查最常见，被广泛应用于肺功能的评估[12]。用力肺活量（forced vital capacity，FVC）指最大吸气至肺总量位后以最大的努力、最快的速度呼出至残气量的呼出气量；第1秒用力呼气容积（forced expiratory volume in one second，FEV1）：指最大吸气至肺总量位后1秒内的最快速呼气量，常用来判断肺通气功能的损害程度；第1秒最大呼气率（FEV1/FVC）指第1秒用力呼气容积与用力肺活量或肺活量的比值，常用以区分阻塞性还是限制性通气功能障碍。肺功能指南推荐FEV1 pred%、FVC pred%、PEF pred%正常值应>80%， FEV1 /FVC %pred正常值应大于>92%[13]。本研究测定指标包括：FEV1 pred%、FVC pred%、PEF pred%、FEV1/FVC%。所有受试者均采用中国康泰医学系统（秦皇岛）股份有限公司的肺活量计（产品编号：SP10）进行肺功能评估，由同一位物理治疗师对全部受试者进行肺功能测试。
1.4 统计学处理
采用SPSS 25.0软件包对原始数据进行处理。计量数据以 $\bar x \pm s $表示，2组年龄、身高、体重、BMI、肺功能指标以及呼吸肌力指标采用独立样本 t 检验，5组侧弯类型间肺功能指标以及呼吸肌力指标采用单因素方差分析，Cobb角与肺功能指标以及呼吸肌力指标的相关性采用Pearson 相关性分析；计数数据（率）进行χ2检验分析。检验水准为α= 0.05，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 AIS组与正常对照组肺功能
AIS患者与健康人FEV1/FVC%、PEF pred%比较差异无统计学意义（P > 0.05），而AIS患者的FVC pred%、FEV1 pred%差于同年龄健康人（ P < 0.05），见 表2。
表 2 2组肺功能比较（ $\bar x \pm s $）Table 2. Comparison of lung function between two groups （ $\bar x \pm s $）组别 n FVC pred%（%） FEV1 pred%（%） FEV1 /FVC %pred（%） PEF pred%（%） 侧弯组 50 79.920 ± 9.733 80.740 ± 10.743 101.180 ± 8.270 78.440 ± 22.032 健康组 50 89.440 ± 15.602 88.980 ± 14.289 100.080 ± 9.341 86.140 ± 21.393 t −3.702 −3.274 0.638 −1.773 P < 0.001* 0.001* 0.525 0.079 *P < 0.05。 2.2 呼吸肌力情况比较
AIS患者相比健康人的吸气肌力与呼气肌力有所下降（P < 0.05），见 表3。
表 3 2组呼吸肌力比较（ $\bar x \pm s $）Table 3. Comparison of respiratory muscle strength between two groups （ $\bar x \pm s $）组别 n MIP MEP 侧弯组 50 52.740 ± 17.073 64.940 ± 12.838 健康组 50 62.580 ± 16.970 74.120 ± 16.923 t −2.890 −3.056 P 0.005* 0.003* *P < 0.05。 2.3 AIS患者最大Cobb角与肺功能、呼吸肌力的相关性
AIS患者肺功能参数、呼吸肌力与最大Cobb角之间没有相关性（P > 0.05），见 表4。
表 4 Cobb角与肺功能、呼吸肌力间的相关性Table 4. Correlation of Cobb Angle with lung function and respiratory muscle strength参数 Cobb角 r P FVC pred% −0.059 0.682 FEV1 pred% 0.029 0.844 FEV1 /FVC% pred 0.276 0.052 PEF pred% 0.077 0.594 MIP −0.079 0.587 MEP −0.096 0.507 2.4 AIS患者侧弯类型与肺功能、呼吸肌力的相关性
按胸弯型、腰弯型、以胸弯为主的双弯型、以腰弯为主的双弯型、胸腰弯5种分型将AIS患者分组，5种类型患者的肺功能参数与呼吸肌力差异无统计学意义（P > 0.05），见 表5。
表 5 不同类型侧弯肺功能比较（ $\bar x \pm s $）Table 5. Comparison of function of different types of lateral curved lung （ $\bar x \pm s $）组别 n FVC pred%（%） FEV1 pred%
（%）FEV1 /FVC pred%（%） PEF pred%
（%）MIP MEP 胸弯型 6 77.330 ± 13.018 79.000 ± 13.416 102.000 ± 3.847 78.830 ± 23.676 44.500 ± 13.397 72.666 ± 11.775 腰弯型 11 79.360 ± 6.789 44.500 ± 13.397 104.730 ± 5.746 88.090 ± 23.696 53.545 ± 19.511 61.454 ± 10.957 以胸弯为主的双弯 13 79.080 ± 11.565 104.730 ± 5.746 101.070 ± .6.498 74.210 ± 20.599 52.428 ± 23.889 64.500 ± 18.529 以腰弯为主的双弯 14 78.830 ± 23.676 79.150 ± 9.512 100.690 ± 10.483 77.920 ± 22.232 54.538 ± 10.038 66.615 ± 7.794 胸腰弯型 6 81.000 ± 8.485 76.830 ± 12.952 95.170 ± 11.974 71.330 ± 21.621 56.333 ± 9.114 61.000 ± 8.555 F 0.328 1.077 1.365 0.802 0.438 0.942 P 0.858 0.379 0.261 0.531 0.780 0.448 3. 讨论
本研究结果表明AIS会影响患者的肺功能，主要表现在与健康同龄人相比FVC pred%、FEV1 pred%的下降，但FEV1/FVC、PEF pred%与健康同龄人无差异。AIS患者Cobb角的大小与肺功能之间没有相关性，且胸弯型、腰弯型、以胸弯为主的双弯型、以腰弯为主的双弯型、胸腰弯的AIS患者之间的肺功能无差异。临床上FVC可作为呼吸道有无阻力的重要指标，在FEV1/FVC% pre正常的前提下，FVC%pred <80%是限制性通气功能障碍的定性诊断标准，本研究中AIS患者的FEV1/FVC% pre>92%，FVC%pred 平均值为79.920%，因此此类患者存在限制性通气障碍。轻、中度AIS患者的FEV1 pred%平均值为80.74%，说明此类患者尚未出现肺功能损害。PEF能较好的反映气道通畅性，本研究中AIS患者的PEF pred%平均值为78.440%，提示有轻度的呼气气流受限。过去的研究发现AIS患者存在肺功能障碍，但肺功能与侧弯类型、性别、Cobb角之间没有相关性 [14-15]，这与本研究的结果一致。Johari等[16]分析发现胸弯较大的患者肺功能较低，年龄每增加一岁，FVC就会降低1.092个单位，Cobb角的度数与FVC以及FEV1成反比关系，但无统计学意义，这也与本研究结果一致。脊柱侧弯会导致胸廓畸形、容积下降、膈肌运动受限，限制肺扩张，阻碍呼吸运动，从而影响肺的通气功能[17]。研究发现在AIS中，凹侧的膈肌运动少于胸部脊柱侧弯凸侧的运动[18]，胸弯患者膈肌向凸侧的偏移比凹侧更大，膈肌活动度可能是影响轻中度AIS患者肺功能的独立因素[19]。在1项631例AIS患者的PFT发现受试者的胸廓大小、胸弯椎骨数量、胸椎后凸畸形和冠状失衡具有统计学意义，但这4个因素占肺功能测试的变异性不到20%[20]，尚未有研究明确PFT的准确预测因子。因此，早期识别有肺功能受损风险的AIS患者对于患者的治疗和管理有重要意义。
本研究发现轻、中度AIS患者的吸气肌力和呼气肌力较同年龄健康青少年差，MIP、MEP与Cobb角呈负相关，但结果没有统计学差异，不同轻、中度患者的侧弯类型的呼吸肌力也无差异。MIP是在压力测量的封闭系统中完全自主吸气时产生的力量，力量是呼吸肌功能的评估指标之一，呼吸肌力量的变化表明肌肉组织功能的主要改变。MIP反映所有吸气肌群的功能，不能反应某一肌肉的功能，这些吸气肌群可能因胸壁和脊柱的畸形而发生改变[21]。MIP降低与成人脊柱侧弯患者的二氧化碳潴留和呼吸衰竭直接相关，MEP降低会导致咳嗽无力无效，气道黏液清除率降低，甚至可能导致肺炎和肺不张[22]。Lin等[23]在对44名特发性脊柱侧弯患者进行MIP和MEP检查，发现MIP和MEP与脊柱侧凸角度和顶椎旋转度呈负相关。Koumbourlis等[24]在分析AIS的病理机制时指出，脊柱的侧向位移和旋转会阻碍肋骨和呼吸肌的运动，并且改变胸廓的位置，最终可能导致呼吸障碍。因此，应尽早进行常规肺部的检查，并持续到骨骼发育结束。研究表明轻、中度AIS患者在8周的物理治疗后，肺功能参数和呼吸肌力得到改善[25]，因此对AIS患者进行矫正脊柱侧弯和改善呼吸功能的康复治疗，有利于患者肺功能的恢复[26-27]。Boyer等[28]对10至18岁的AIS患者进行了检查，指出仅进行肺活量测定，而不进行运动测试，不足以评估AIS患者的肺功能特征。本研究仅测试了受试者静态下的肺功能和呼吸肌力，未来将进一步观察此类患者的运动能力是否有受限，运动功能与患者Cobb角度、肺功能是否具有相关性。
综上所述，轻、中度AIS患者存在肺功能和呼吸肌力受限的情况，侧凸类型、Cobb角度与肺功能、呼吸肌力受限无相关性，建议早期对侧凸较轻的患者及时行保守治疗和长期随访，防止呼吸功能进一步恶化，同时有必要关注患者进行功能活动时的肺功能情况。
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