肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）占原发性肝癌的90%以上，是全球癌症相关死亡的常见原因。HCC的主要危险因素包括病毒性肝炎、非酒精性脂肪肝、酗酒、黄曲霉毒素暴露等^[1]。随着医疗技术的提升，HCC患者的5 a生存期得到了一定的提高，但由于确诊较晚、化疗耐药以及癌症的频繁复发和和转移，HCC患者的预后仍然较差^[2]。因此，迫切需要开发HCC的生物标志物和治疗靶点。

锌指蛋白（zinc finger proteins，ZNFs）是人类基因组中参与转录活动和细胞过程调节的最大一类转录因子^[3]。ZNF384位于人类染色体12p13.31，是锌指蛋白家族的一员^[4]。先前的研究表明，ZNF384在乳腺癌^[5]和结直肠癌^[6]中表达升高，促进癌细胞的增殖和转移。He等^[7]报道ZNF384在HCC细胞系中高表达，但其调节HCC进展的具体机制鲜有报道，有待进一步研究阐明。谷氨酸-半胱氨酸连接酶（glutamate cysteine ligase，GCL）是催化谷胱甘肽合成的第一种限速酶。GCL由催化亚基（glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLC）和动力学调节亚基（glutamate-cysteine ligase modifier subunit，GCLM）2个亚单位组成，这些亚单位的活性受转录因子的调控^[8]。近来，研究发现GCLM在人HCC组织中表达升高^[9]。本研究通过数据库预测发现ZNF384与GCLM启动子具有结合位点，并通过实验证实ZNF384作为转录因子调控GCLM启动子，抑制HCC细胞的增殖和转移。

1.   材料与方法

1.1   细胞

人HCC细胞HepG2、HuH7以及人肾胚细胞HEK293T购自南京科佰生物科技有限公司。人正常肝细胞LO2购自安徽巨州生物科技有限公司。

1.2   主要试剂

MEM培养基购自南京科佰生物科技有限公司。DMEM培养基和RPMI-1640培养基武汉普诺赛生命科技有限公司。Lipofectamine ^TM 2000购自美国Invitrogen。蛋白质测定试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司。兔抗ZNF384、GCLM和GAPDH抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗购自Abcam。ECL发光液购自爱必信（上海）生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购自MedChemExpress。Transwell小室购自美国Coring。结晶紫染色液和胃蛋白酶购自上海Macklin。

1.3   细胞培养

HepG2细胞培养在包含10%胎牛血清（FBS）、1%非必须氨基酸以及1 mmol/L丙酮酸钠的MEM培养基内。HuH7和HEK293T细胞分别培养于含10% FBS的DMEM培养基内。LO2细胞置于含20% FBS和1%双抗的RPMI-1640培养基中。各培养基置于含5% CO₂、37 ℃的培养箱内。

1.4   细胞转染

根据试剂盒说明书，采用Lipofectamine ^TM 2000分别将si-NC、si-ZNF384#1、si-ZNF384#2、si-ZNF384#3、pcDNA-NC、pcDNA-GCLM转染至HepG2、HuH7细胞内。转染后，将细胞置于37 ℃、5% CO₂环境中培养。48 h后，利用Western blot检测细胞转染效率，转染成功后的细胞用于后续实验。实验分组为：si-NC组、si-ZNF384#1组、si-ZNF384#2组、si-ZNF384#3组、pcDNA-NC组、pcDNA-ZNF384组、si-ZNF384+pcDNA-NC组以及si-ZNF384+pcDNA-GCLM组。

1.5   Western blot

提取细胞中的蛋白质，蛋白质测定试剂盒检测蛋白质浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质，然后转移至PVDF膜上。膜经5%脱脂牛奶封闭，再与一抗（ZNF384：1∶2000，N-cadherin：1∶5000，Vimentin：1∶1000，E-cadherin：1∶1000，GCLM：1∶1000，GAPDH：1∶2500）在4 ℃环境中避光孵育，漂洗后与二抗在室温中避光孵育2 h。ECL试剂处理后，凝胶成像系统显色。Image J软件分析蛋白灰度值。

1.6   CCK-8

将成功转染的HepG2和HuH7细胞接种至96孔板中（1000个/孔），在细胞培养箱内培养48 h。向每孔中加入10%的CCK-8试剂，继续培养2 h。酶标仪检测450 nm处的吸光度值。

1.7   Transwell

HepG2和HuH7细胞经饥饿培养24 h，制成细胞悬液后分别接种至Transwell小室的上室，下室中加入含10% FBS的培养基。Transwell板置于37 ℃细胞培养箱中培养，48 h后取出Transwell小室。4%多聚甲醛固定细胞，0.1%结晶紫染色20 min，显微镜观察细胞迁移情况。

1.8   双荧光素酶报告基因实验

根据数据库预测的ZNF384与GCLM启动子的结合位点，构建GCLM的野生型载体p-GLO荧光素酶载体。同时，突变GCLM启动子的A位点和B位点，构建GCLM突变型p-GLO载体。将荧光素酶载体与PCDNA-NC和pcDNA-ZNF384共同转染至HEK293T细胞中。48 h后收集细胞，裂解后利用双荧光素酶报告基因测定系统检测相对荧光素酶活性。

1.9   荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）

Cy3标记的ZNF384寡核苷酸探针和488标记的GCLM寡核苷酸探针用于FISH实验。4%多聚甲醛固定HepG2细胞15 min，PBS漂洗后用1%胃蛋白酶处理固定细胞。70%、90%、100%浓度的乙醇对细胞脱水并风干。ZNF384探针、GCLM探针与杂交缓冲液混合后孵育2 h。玻片经柠檬酸钠生理盐水漂洗、风干，加入DAPI试剂染细胞核。荧光显微镜观察染色结果。

1.10   统计学处理

所有实验均进行3次重复。GraphPad Prism 8.0分析数据并作图，数据表示为均值±标准差（$\bar x \, \pm$ SD）。2组间数据比较采用student’ s t检验。多组间数据比较采用One-Way ANOVA，事后比较利用Tukey’ s检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   敲降ZNF384抑制HCC细胞增殖和转移

分别培养HCC细胞系HepG2和HuH7，收集细胞，检测ZNF384的表达。结果表明，ZNF384在HepG2和HuH7细胞系中的表达高于人正常肝细胞LO2（P < 0.001），见图1A～1B。随后分别在HepG2和HuH7细胞中转染si-ZNF384，检测发现转染si-ZNF384可显著降低ZNF384的表达（图1C），且si-ZNF384#2组在HepG2细胞中表达最低（P < 0.001），见图1D。si-ZNF384#3在HuH7细胞中表达最低（图1E，P < 0.001），因此，分别选择si-ZNF384#2和si-ZNF384#3组转染HepG2和HuH7细胞进行后续实验。CCK-8和Transwell结果表明，敲降ZNF384显著抑制HepG2和HuH7细胞的增殖（P < 0.001）和迁移能力（P < 0.001），见图1F～1H。Western blot检测表明，敲降ZNF384组中HepG2和HuH7细胞中N-cadherin（均P < 0.01）和Vimentin（均P < 0.01）的蛋白表达低于对照组，E-cadherin的蛋白表达显著升高（均P < 0.01），见图1I～1K。综上表明，敲降ZNF384可明显抑制HCC细胞的增殖和转移。

图  1  敲降ZNF384抑制HCC细胞增殖和转移

A～B：Western blot检测HCC细胞系中ZNF384蛋白表达，与LO2组相比，^*P < 0.05，^***P < 0.001。C～E：Western blot检测敲降ZNF384对ZNF384蛋白表达的作用；F：CCK-8检测细胞增殖活力；G～H：Transwell检测细胞迁移能力；I-K：Western blot检测EMT相关标志物的表达。与si-NC组相比，^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  1.  Knockdown of ZNF384 inhibited the proliferation and metastasis of HCC cells

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2.2   ZNF384作为转录因子调控GCLM的表达

进一步通过AnimalTFD3.0数据库预测与ZNF384启动子结合的转录因子，结果发现GCLM的转录因子与ZNF384启动子存在结合位点，见图2A。双荧光素酶报告基因实验验证，发现相比较于pcDNA-NC组，过表达ZNF384组中野生型及突变A位点的GCLM的荧光素酶活性显著升高（图2B，P < 0.001），而对突变B位点以及同时突变A位点和B位点的GCLM的荧光素酶活性无显著影响，因此证实ZNF384的转录因子与GCLM启动子的B位点结合。FISH实验表明，ZNF384和GCLM主要共定位于HepG2细胞的细胞核内（图2C）。Western blot实验检测HCC细胞中GCLM的表达，结果见图3D-F，GCLM在HepG2和HuH7细胞中高表达（图2D，均P < 0.01），敲降ZNF384组中GCLM蛋白表达低于对照组（图2E-2F，均P < 0.01）。由此可知，ZNF384作为转录因子与GCLM的启动子结合，敲降ZNF384抑制GCLM的蛋白表达。

图  2  ZNF384作为转录因子调控GCLM的表达

A：AnimalTFD3.0数据库预测ZNF384与GCLM的启动子结合位点;B：双荧光素酶报告基因实验验证ZNF384与GCLM的结合关系，与pcDNA-NC组相比，^***P < 0.001；C：FISH检测ZNF384和GCLM在HepG2细胞中的定位；D：Western blot检测HCC细胞中GCLM的蛋白表达，与LO2组相比，^**P < 0.01，^***P < 0.001；E～F：Western blot检测敲降ZNF384对GCLM蛋白表达的作用。与si-NC组相比，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  2.  ZNF384 as a transcription factor regulated the expression of GCLM

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2.3   ZNF384调控GCLM抑制HCC细胞的增殖和转移

接下来验证ZNF384调控GCLM对HCC细胞增殖和转移的调控作用。分别在HepG2和HuH7细胞系中转染si-ZNF384和pcDNA-GCLM，转染效率检测显示（图3A-3C），相比较于si-ZNF384+pcDNA-NC组，转染pcDNA-GCLM明显上调细胞中GCLM的表达（P < 0.01），而对ZNF384表达无明显作用（P > 0.05）。CCK-8（图3D）和Transwell（图3F-G）实验结果发现，敲降ZNF384且过表达GCLM组中HepG2和HuH7细胞的增殖（P < 0.01）和迁移（均P < 0.01）能力明显高于仅敲降ZNF384组。EMT相关标志物检测发现（图3H-3J），相比较于仅敲降ZNF384组，敲降ZNF384且过表达GCLM组N-cadherin（均P < 0.05）和Vimentin（均P < 0.05）高表达，E-cadherin表达明显降低（P < 0.001）。综上表明，过表达GCLM可逆转敲降ZNF384对HepG2和HuH7细胞的增殖和转移的抑制作用，促进HCC细胞的恶性生物学行为。

图  3  ZNF384调控GCLM抑制肝细胞癌细胞的增殖和转移

A～C：Western blot检测ZNF384和GCLM在HepG2和HuH7细胞中的表达；D：CCK-8检测细胞增殖活力；E～G：Transwell检测细胞迁移能力；H～J：Western blot检测EMT相关标志物N-cadherin、Vimentin和E-cadherin的蛋白表达。^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  3.  ZNF384 suppressed the proliferation and metastasis of HCC cells by regulating GCLM

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3.   讨论

HCC是消化道恶性肿瘤之一。近年来，HCC发病率明显增加，由于发病的隐匿性以及癌细胞的恶性转移，患者的5 a生存率较低^[10]。虽然手术切除、原位肝移植、放化疗等综合治疗已应用于临床，但由于肿瘤转移、排斥反应、化疗耐药以及放疗抵抗等多种因素的存在，治疗效果仍不够理想^[11-13]。因此，探索HCC发展所涉及的具体机制，对于确定治疗的靶点以及提高HCC的临床疗效十分重要。

先前的研究证明，ZNF384作为融合基因，与TCF3、EP300、CREBBP、BMP2K等基因伴侣融合重排，调控儿童B细胞前体急性淋巴细胞白血病的发生与发展^[14]。ZNF384与TAF15基因融合后重排，导致患者从前B急性淋巴系白血病转变为急性髓系白血病^[15]。ZNF384也可作为肿瘤细胞的调节因子参与调控肿瘤的发展进程。例如：Tim-3/Gal-9通过调控ZNF384，促进神经胶质瘤细胞中NLRC4炎症小体的形成和激活，引发炎症^[16]。ZNF384通过激活ZEB1的表达，促进乳腺癌细胞的侵袭、迁移和上皮间质转化^[5]。此外，在人乳头瘤病毒E6通过ZNF384的外源表达促进人用生化角质形成细胞中APOBEC3B启动子激活，促进人乳头瘤病毒诱导的癌症发生^[17]。ZNF384通过结合受损DNA和Ku70/Ku80，促进非同源末端连接修复体的构建，在DNA双链断裂的修复中具有重要作用^[4]。本研究发现ZNF384在HCC细胞系HepG2和HuH7中表达升高。敲降ZNF384显著抑制HepG2和HuH7细胞的增殖、迁移和上皮间质转化。Xiao等^[18]研究发现，ZNF384可作为DNASE1L3的上游转录因子，负调节DNASE1L3的表达，从而抑制HCC的生长并促进体内细胞凋亡。

近来，研究发现GCLM在多种疾病中具有调控作用。GCLM敲除小鼠具有强烈的氧化应激反应，高脂饮食不会促进小鼠的葡萄糖耐受不良或胰岛素抵抗^[19]。丹参素上调GCLM的表达，改善鱼藤酮诱导的帕金森小鼠运动和神经功能障碍^[20]。GCLM是铁死亡的重要调节因子，在膀胱癌中上调，与膀胱癌的免疫浸润相关，下调GCLM抑制膀胱癌细胞的克隆形成能力^[21]。抑制GCLM可改善肺小细胞癌肺癌细胞的顺铂耐药性^[22]。抑制GCLM可有效改善非小细胞肺癌细胞的顺铂耐药性^[22]。GCLM在催乳素瘤中高表达，敲降GCLM可缓解Cabergoline诱导的催乳素瘤细胞铁死亡^[23]。Cheng等^[24]报道，GCLM mRNA在HBV相关肝硬化和终末期肝病组中表达较高。本研究发现，GCLM在HCC细胞系中表达升高，GCLM的启动子受ZNF384调控，过表达GCLM可逆转敲降ZNF384对HepG2和HuH7细胞增殖、迁移和上皮间质转化的促进作用。

综上所述，ZNF384和GCLM在HCC细胞系中高表达，ZNF384作为转录因子正调控GCLM启动子。敲降ZNF384通过抑制GCLM的表达，抑制HCC细胞增殖和转移。