肺癌是威胁人类生命健康的首要恶性肿瘤，患者5 a生存率仅为21%^[1]，随着胸部影像技术的进步及肺癌筛查项目的普及，肺癌多结节病灶检出日益增加。据报道，肺癌多结节的发生率约为0.2%～20.0%^[2-3]，在非吸烟、女性、腺癌中尤为常见。持续存在的磨玻璃结节影像可是早期肺腺癌的表现之一，结节内实性密度成分增加更倾向发展为具有侵袭性的病理亚型^[4]。第8版美国癌症联合委员会分期手册（AJCC分期手册）^[5]首次将多发肺结节描述为4种疾病类型，其中第二原发肺癌和多灶磨玻璃结节/贴壁样成分（GG/L）肺腺癌归类为独立多原发肿瘤。目前，临床肿瘤分子检测主要应用于进展期肺癌患者，表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）仍是最常见的突变类型，针对敏感突变的酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-tyrosine kinase inhibitors，EGFR-TKIs）可改善患者的生存预后^[6]。然而，多结节肺腺癌的相关分子研究却鲜有报道，同时性多结节病灶在相同遗传背景和环境暴露条件下，可能叠加不同的基因组改变过程^[7]。本研究应用NGS测序技术，检测云南地区79例多结节肺腺患者的111枚同时性多结节肿瘤组织中EGFR基因突变情况，分析其与临床病理特征间的关系，探讨影响该基因突变的危险因素。

1.   资料与方法

1.1   病例资料

收集2018年1月至2020年5月，云南省分子诊断中心检测的79例云南地区多结节肺腺癌患者的111枚肿瘤组织样本，以NGS法检测EGFR突变情况。纳入标准：（1）参照第8版AJCC分期手册诊断为多结节肺腺癌患者，术后组织类型均为肺腺癌；（2）术前胸部CT提示同时性肺部多发肿瘤病灶，最大直径均≤3 cm；（3）医院信息系统（HIS）存档完整的临床、病理及影像学资料，获得所有患者知情同意。排除标准：（1）术前接受过放、化疗或其他抗肿瘤治疗；（2）胸膜侵犯转移或恶性胸腔积液；（3）病理结果提示为转移性肿瘤；（4）已证实有远处转移；（5）合并其他肿瘤。

1.2   组织病理学及影像学特征记录

病理类型参照2015年世界卫生组织肺肿瘤分类标准^[8]：非典型腺瘤样增生（AAH）、原位腺癌（AIS）、微浸润腺癌（MIA）、浸润性腺癌包括附壁型（Lepidic predominant adenocarcinoma，LPA）、微乳头型（Micropapillary predominant adenocarcinoma，MPPA）、乳头型（Papillary predominant adenocarcinoma，PPA）、实体型（Solid predominant adenocarcinoma，SPA）、腺泡型（Acinar predominant adenocarcinoma，APA）。高分辨胸部CT记录结节位置，数目，根据实性成分比值（consolidation tumor ratio，CTR）将结节密度分为3类^[9]:纯磨玻璃结节（pure ground-grass nodules，pGGNs），0≤CTR < 0.5；混合性磨玻璃结节（mixed ground-grass nodules，mGGNs），0.5≤CTR < 1.0；实性结节（solid nodule），CTR = 1.0。

1.3   肿瘤组织核酸提取

所有标本经10%中性福尔马林固定，常规HE染色，筛选出肿瘤成分 > 50%的肿瘤组织蜡块切片。二甲苯脱蜡后用肿瘤组织石蜡样本DNA分离试剂盒提取DNA，满足吸光度OD260/OD280值在1.8～2.1之间，核酸定量仪（Qubit 4.0）测定DNA浓度，所有操作根据试剂说明书及实验室规范进行。

1.4   文库构建及测序

采用Bio-rad S1000 PCR 仪测定预文库产量及终文库浓度、文库片段化（2100生物分析仪）、依据Miseq的文库和测序准备及Miseq系统使用手册使用Illumina Miseq测序仪对构建的DNA文库进行测序，测序读长为150 bp左右。

1.5   统计学处理

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计学分析。采用卡方检验分析多结节肺腺癌患者EGFR基因突变状态与临床病理特征的相关性。采用Logistic回归对EGFR基因突变与影响因素的关系进行验证。以P < 0.05表示差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   多结节肺腺癌患者临床特征

79例多结节肺腺癌患者中，男性26例，女性53例，男女比例约为0.51∶1；年龄32～73岁，中位年龄56岁。79例多结节肺腺癌患者送检111枚多结节病灶，其中32例患者同时送检术中切除的2枚配对结节病灶，47例患者仅送检1枚主要病灶，临床特征见表1。

表  1  多结节肺腺癌患者组织样本中 EGFR突变与临床病理特征关系分析

Table  1.  Analysis of the relationship between EGFR mutations and clinicopathological characteristics in tissue samples from patients with multinodular lung adenocarcinoma

病理特征	总数（n = 79）	EGFR 突变		χ2	P
		突变数（n）	突变率（%）
性别				5.097	0.024
男	26	14	53.84
女	53	39	73.58
年龄（岁）				6.980	0.008
< 56	35	18	51.42
≥56	44	35	79.54
吸烟状态
无吸烟	57	45	78.94	13.037	< 0.001
吸烟	22	8	36.36
地区				5.126	0.024
高发	53	40	75.47
非高发	26	13	50.00
病理分期				1.853	0.176
Ⅰ～Ⅱ	42	31	73.80
Ⅲ～Ⅳ	37	22	59.45
位置				0.244	0.176
右肺	58	38	65.51
左肺	21	15	71.42
浸润程度				1.871	0.171
浸润前AAH+AIS	12	6	50.00
浸润性 67		47	70.14
密度				1.806	0.405
pGGNs	33	22	66.67
mGGNs	28	28	64.28
Solid	18	13	72.22

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.2   EGFR基因突变检测结果

送检的111枚肺结节中共检出65枚EGFR突变，总突变率58.55%（65/111），其中敏感突变率31.53%（L858R: 21枚、19del：14枚）；罕见突变率27.02%（30/111），其中G719C-S768I最常见，突变率9.90%（11/111）；单点突变率37.84%（42/111），复合突变率20.72%（23/111）。多结节病灶EGFR稀有突变发生率较高（54%，27/50），主要来自云南区域性肺癌高发地区，各类型突变比例见图1。

图  1  肺结节组织样本EGFR基因不同位点突变情况分布

Figure  1.  EGFR mutation rate at different loci in lung nodule samples

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   多结节肺腺癌患者EGFR基因突变与临床病理特征的关系

统计学结果分析显示，EGFR突变在不同性别、年龄、是否吸烟、是否云南区域性高发肺癌地区等特征中差异具有统计学意义（P = 0.024、P = 0.008、P < 0.001、P = 0.024）；与病理分期、浸润程度、肺结节影像学密度、位置等因素差异无统计学意义，P值 > 0.05，见表1。

表  2  多结节肺腺癌患者EGFR基因突变的多因素分析

Table  2.  Multivariate analysis of clinicopathological characteristics of multi-nodular lung adenocarcinoma patient

病理特征	Exp（β）	OR （95%CI）		P
		Low	Upper
年龄（岁）	3.673	1.368	9.864	0.010
云南区域性高发肺癌地区	3.007	1.142	8.291	0.026
吸烟状态	0.152	0.052	0.447	0.001
性别	0.419	0.157	1.120	0.083

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.4   EGFR基因突变的多因素分析

对多结节肺腺癌患者的性别、年龄、是否吸烟、是否来自云南区域性高发肺癌地区等因素行Logistic回归分析，发现EGFR基因突变与年龄、吸烟史、是否云南区域性高发肺癌地区相关（P < 0.05），而与其他临床病理特征无关（P > 0.05）。因此，老年、无吸烟史、来自云南区域性高发肺癌地区是多结节肺腺癌患者的EGFR基因突变独立危险因素，见表2。

2.5   配对结节组织的EGFR突变状态差异

79例多结节肺腺癌患者中，有 32例送检术中同期切除的配对双结节肿瘤组织样本。 EGFR基因突变结果提示，同一患者配对结节之间的 EGFR 基因表达不一致率高达75%（24/32），见表3。

表  3  32例多结节肺腺癌患者配对结节的EGFR突变状态

Table  3.  EGFR mutation status of paired nodules in 32 patients with multinodular lung adenocarcinoma

病人编号	结节1	结节 2	病人编号	结节1	结节 2
1	L858R	WT	17	L858R	WT
2	20-INS	L858R	18	G719C-S768I	WT
3	L861Q	19del	19	WT	WT
4	G719C-S768I	WT	20	G719A/G719C	L858R
5	G719A-S768I	G719A	21	L858R	WT
6	L858R	19del	22	G719C-S768I	WT
7	G719C	G719C-S768I	23	WT	G719A/G719C -S768I
8	G719C-S768I	WT	24	19del-S768I	19del-S768I
9	G719C-L861Q	19del	25	L858R	L858R
10	G719A-L861I	L858R	26	L858R	L858R
11	WT	G719C-S768I	27	G719C-S768I	19del
12	WT	G719C	28	WT	G719A
13	19del	WT	29	19del	WT
14	G719A/C-L861Q	WT	30	WT	WT
15	WT	WT	31	L858R	WT
16	WT	WT	32	L858R	L858R

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

随着影像技术的进步和癌症筛查的普及，肺癌多发结节的检出比例日益增加^[10]。EGFR敏感突变、ALK或ROS1融合在晚期非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）分子分型与靶向治疗中的意义已经在临床实践中得到充分证实，但多结节肺腺癌的相关研究却少见报道。

EGFR突变是肺腺癌发生发展的重要驱动事件，19号外显子缺失突变（19del）和21号外显子L858R点突变为EGFR最常见的突变类型，且均为EGFR-TKIs的重要治疗靶点。EGFR基因突变率与种族相关，亚裔人群和我国EGFR基因突变率约在30%～50%，高于北美及欧洲人群^[11-12]。Fan和Chen的两项研究发现多发磨玻璃结节的EGFR突变率较高，分别为45.8%和52.4%^[13-14]。本研究中多结节组织样本EGFR总突变率较高，于课题组前期报道的云南区域性高发肺癌地区患者高突变率较一致^[15]。这可能与本组对象以老年、非吸烟、女性人群为主、且病理类型均是肺腺癌等因素有关。

随着年龄增长EGFR呈现出更高的突变率^[16-17]，本研究中多结节肺腺癌患者（年龄≥56岁）EGFR突变率较高，提示临床中更应重视中老年患者的分子检测。病灶从不典型增生发展到浸润性腺癌的过程中，EGFR的突变率逐渐增高^[18]，Liu等^[19]发现多发GGN病理亚型为腺泡型或乳头型为主的浸润性肺腺癌的EGFR基因19del和L858R突变率更高。但在本研究中浸润性腺癌的EGFR突变率与浸润前病变无明显统计学差异，这可能与样本数量有限及腺癌病理亚型分布不均有关。云南省区域性肺癌高发地区，广义包括云南省宣威、富源、麒麟和沾益，贵州省盘县、水城、六枝等地区，肺癌发病率和死亡率较高^[20]。值得笔者注意的是，与非高发地区患者相比，来自高发地区的多结节肺腺癌患者具有EGFR稀有突变和联合突变发生率较高的特点，如G719A/C、G719A/C+L861Q、G719A/C+S768I、S768I等。这可能与不同地区肺癌发生发展的主要驱动基因存在差异及宣威肺癌的发病机制可能与室内烟煤燃烧有关^{[15, 21]}。

肺腺癌是高度异质性肿瘤，组织形态学相同或相似的多发病灶可能具有完全不同的分子遗传学标志，从而有助于客观分析各多发病灶的克隆起源关系^[22-23]。本研究的结果提示，多结节肺腺癌患者同时送检的配对结节组织样本EGFR突变差异率高达75%。这与既往报道一致^{[14, 24]}，多GGN病灶间驱动基因突变存在高度异质性，支持NSCLC的多发GGNS往往起源于独立原发肿瘤的假设。因此，建议多结节肺腺癌患者术后切除的多发肿瘤组织尽量分别送检相关癌症基因检测。在临床组织病理学的形态标准基础上，结合分子遗传学依据助于提高鉴别多结节病灶起源性质的准确性。

本研究存在一些局限性：样本量相对较小，且回顾性研究可以诱导选择性偏差，未来需要对云南地区多结节肺腺癌患者进行更大样本量的前瞻性研究。仅使用单个或多个驱动基因联合检测获得的遗传信息有限，相较于全基因组或全外显子组测序，可能低估了多结节肿瘤间克隆转移的真实频率。

综上所述，云南地区多结节肺腺癌患者中，老年、无吸烟史、来自云南区域性肺癌高发地区是EGFR基因突变的独立危险因素。多结节肺腺癌患者病灶间驱动突变的高水平异质性提示多发结节倾向多原发肿瘤起源，这将为多结节肺腺癌的诊疗策略提供更多的选择。