反复种植失败（repeated implantation failure，RIF）目前多将其定义为在辅助生殖治疗中移植3次以上或移植高评分卵裂期胚胎数4～6个或高评分囊胚数3个及以上均失败者^[1]。因为RIF涉及病因种类多、范围广是体外受精-胚胎移植术（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治疗中的难题，胚胎的着床依赖于优质的胚胎和具有容受性的子宫内膜。目前随着辅助生殖胚胎实验室技术的发展和胚胎种植前遗传学检测（preimplantation genetic testing，PGT）的广泛应用，在选择优质胚胎方面已获得较大进展。但对于子宫内膜容受性的评估尚缺乏有效手段。国内亿康基因公司于2019年开发的子宫内膜容受性检测（endometrial receptivity test，ERT）技术，是基于RNA-seq的子宫内膜容受性检测，通过分析子宫内膜组织中万余个基因的表达量，结合AI机器学习的大数据分析方法，区分容受前期、容受期、容受后期3个时期的样本，在患者下一个月经周期按照ERT结果制定个性化移植方案时间，得到胚胎最佳的移植时期，指导在种植窗移植胚胎，以期提高移植成功率^[2]。通过该技术能否确实提高RIF患者的成功率，内膜种植窗口期发生移位的患者有什么临床特点？是否能通过临床信息挖掘找寻种植窗移位的相关原因从而预防RIF的发生？目前此方面研究尚少，本研究首先通过分析RIF患者行ERT后胚胎移植的妊娠结局了解该技术的有效性，其次分析胚胎种植窗移位患者的临床特点。

1.   资料与方法

1.1   一般资料

回顾性分析2020年12月至2021年11月在云南省第一人民医院生殖医学科诊断为反复种植失败后再次接受冷冻胚胎移植病例。入选标准：（1）取卵年龄小于40岁；（2）反复种植失败的患者，即既往≥3次的移植（包括新鲜胚胎移植和冷冻胚胎移植）失败，累积移植：①优质D3胚胎4～6个②高评分囊胚（4BB及以上囊胚）3个及以上均失败；（3）诊断RIF后再次行冷冻胚胎移植。排除标准：（1）男女双方染色体核型异常；（2）有子宫内膜病变者（包括宫腔粘连、子宫内膜增殖症、子宫内膜息肉、子宫内膜炎、子宫内膜结核等）未治疗；（3）有输卵管积水且未行输卵管近端结扎者；（4）有粘膜下肌瘤未处理。根据是否接受ERT并完成个性化移植分为接受组和未接受组。本研究已通过医院伦理委员会审批，受试者均签署知情同意书。

1.2   研究方法

1.2.1   内膜监测及手术时间安排

月经来潮8～10 d，B超监测卵泡及内膜厚度，若有优势卵泡发育监测至排卵，排卵+5d或出现LH峰+7 d安排内膜取材；若无优势卵泡发育，予激素替代周期，口服戊酸雌二醇（补佳乐，德国拜耳）4 mg/d，激素使用10～14 d，内膜≥8 mm时给予黄体酮软胶囊（安i琪坦，法国Capsugel）400 mg/d、地屈孕酮片（达芙通，荷兰Abbott，）20 mg/d，转化内膜6 d后安排内膜取材。

1.2.2   内膜取材

手术当天行阴道分泌物、血常规检查。手术室患者取膀胱截石位，常规消毒铺巾，宫颈钳钳夹宫颈上下唇固定宫颈，探针探查宫深，顺子宫位置方向轻柔插入内膜取材取样器，待取样器底部达宫底处，左手握住并固定管套，右手握住手柄，快速向外拉管芯使宫腔形成负压吸取内膜组织。将取样管中的子宫内膜组织排除至无菌纱布上，挑选干净无血污染的内膜组织直接放入装有RNA保存液的保存管，放入-20℃保存，联系送检取样。

1.2.3   再次冷冻移植

根据ERT结果安排再次冷冻移植，依照取内膜周期内膜准备方式再次行冷冻移植内膜准备，根据ERT结果安排患者个性化移植时间。

1.2.4   妊娠判定

移植后2周测定血β-人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG），若β-hCG≥10 mIU/mL为生化妊娠，于移植后28～35 d行经阴道腔内B超检查是否有宫内孕囊，有孕囊者判定临床妊娠。

1.2.5   研究变量

患者的一般资料包括年龄、BMI、不孕类型、合并多囊卵巢综合症、合并子宫内膜异位症、移植胚胎个数、移植胚胎类型、移植日内膜厚度、临床结局包括临床妊娠率 = 临床妊娠周期数/移植周期数×100%；种植率 = 孕囊数/移植胚胎胚胎数×100%（若单胚移植出现多孕囊，记为1）。纳入种植窗移位多因素回归分析的研究变量参考目前研究显示与胚胎种植相关的临床因素。

1.3   统计学处理

本研究统计分析采用R语言（Version 3·6·3;）。采用$\bar x \pm s $表示符合正态分布的计量资料。当方差齐时，采用独立样本t检验比较组间差异，当方差不齐时采用Cochran矫正t检验比较组间差异。计数资料用百分率表示，采用卡方检验或Fisher 确切概率法进行分析。不符合取自然对数变换再行t检验，仍不符合正态分布，应用Mann-WhitneyU检验。针对建模人群，采用单因素/多因素Logistic模型分析影响种植窗移位的因素。P < 0.05为差异有统计学意义。回归分析中将原发不孕赋值为“1”，继发不孕赋值为“2”；将宫外孕史、合并多囊卵巢综合征、合并子宫内膜异位症中不合并赋值为“0”，合并赋值为“1”；将发生卵泡不破裂黄素化赋值为“1”，未发生赋值为“0”。

2.   结果

2.1   2组病例一般临床资料比较

接受ERT组43例，未接受组29例，2组间患者的年龄、BMI、不孕类型、多囊卵巢综合征占比、子宫内膜异位症占比、移植胚胎数、囊胚占比、移植日子宫内膜厚度相比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。

表  1  2组病例一般资料的比较[（$\bar x \pm s $）/n（%）]

Table  1.  Comparison of general data of two groups of cases [（$\bar x \pm s $）/n（%）]

项目	接受组	未接受组	χ2 /t	P
年龄（岁）	33.60 ± 2.84	33.34 ± 2.78	0.385	0.701
BMI（kg/m2）	22.40 ± 2.50	21.92 ± 2.29	0.842	0.402
不孕类型（原发不孕占比）	22（51.16）	13（44.83）	0.278	0.598
多囊卵巢综合征占比	6（13.95）	5（17.24）	0.145	0.704
子宫内膜异位症占比	4（9.30）	2（7.00）	0.131	0.717
移植胚胎数（个）	1.40 ± 0.50	1.59 ± 0.50	−1.597	0.115
囊胚占比	20/43（46.51）	14/29（48.28）	0.022	0.883
移植日内膜厚度（mm）	9.21 ± 1.57	9.14 ± 1.34	0.201	0.841

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2.2   2组病例临床妊娠率和胚胎种植率比较

接受ERT并完成个性化移植的病例临床妊娠率及胚胎种植率均明显高于未接受组，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表2。

表  2  2组病例临床妊娠率和胚胎种植率比较n[（%）]

Table  2.  Comparison of clinical pregnancy rate and embryo implantation rate between two groups [n（%）]

项目	接受组	未接受组	x2 /t	P
临床妊娠率	23（53.39）	7（24.14）	6.138	0.013*
胚胎种植率	28（46.67）	9（20.00）	8.013	0.005*
*P < 0.05。

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2.3   内膜种植窗移位相关因素多因素分析

接受ERT检测的43例病例中有16例ERT结果为内膜容受性发生移位。其余29例ERT检测结果提示内膜位于容受期内。

纳入既往研究发现与胚胎种植相关的影响因素包括：年龄、BMI、不孕类型、有无宫外孕史、合并多囊卵巢综合征（ploycystic ovary syndrome，PCOS）、合并子宫内膜异位症、是否发生卵泡未破裂黄素化（luteinized unruptured follicle，LUF）、移植（取材）日子宫内膜厚度、移植（取材）日血孕酮水平。单因素Logistic回归分析结果显示，合并PCOS、发生LUF以及取材日血孕酮水平会影响内膜种植窗；多因素模型检验，合并PCOS、发生LUF是内膜种植窗移位的影响因素，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表3。

表  3  影响种植窗移位的多因素回归分析结果

Table  3.  Regression analysis results of multiple factors affecting the displacement of planting window

变量	单因素分析				多因素分析
	OR	95%CI	P		OR	95%CI	P
年龄	0.908	0.720～1.146	0.417
BMI	1.211	0.958～1.533	0.109
不孕类型	0.722	0.208～2.504	0.608
宫外孕史	0.383	0.039～3.700	0.411
PCOS	11.818	1.233～113.233	0.032*		14.114	1.265～157.496	0.031*
子宫内膜异位	0.383	0.039～3.770	0.411
LUF	7.500	1.290～43.608	0.025*		8.244	1.180～57.589	0.033*
内膜厚度	1.120	0.707～1.775	0.628
血孕酮水平	0.607	0.396～0.931	0.022*		0.731	0.462～1.154	0.179
*P < 0.05。

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3.   讨论

子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎植入的能力，也是指内膜的一种状态也称为胚胎着床“窗口期”。一般认为在正常的月经周期中，只有在周期的第20～24天或黄体生成素峰（luteinizing hormone，LH）后第7天（LH+7）或P + 5子宫内膜具备对胚胎的接受能力^[3]。既往认为种植窗是恒定的，然而越来越多的研究发现并非在所有患者中都成立，有的表现为种植窗提前退后或缩短^[4-5]。目前临床上检测内膜容受状态最常用的是超声指标，根据内膜厚度、分型、血流，同时参考雌激素及LH等激素指标。此外还有形态学标志物：胞饮突；分子生物学标志物；整合素等，可以一定程度评估子宫内膜容受性，但是因其存在局限性且重复性差故存在争议。寻求一种全面客观的检测方法以评估子宫内膜容受性显得尤为迫切和重要

本研究分析既往因RIF接受ERT检测并进行个体化移植的病例资料提示，相比较同期未接受ERT移植组，临床妊娠率（53.49% vs 24.14%）和胚胎种植率（46.67% vs 20.00%）均有显著提高，具有统计学意义（P < 0.05）。这与既往国内研究结果相符^{[2, 6]}，这个结果验证了对于RIF人群，ERT准确识别种植窗对于改善这类患者结局具有重要意义，为生殖领域引入个体化种植窗及个体化移植概念，打破以往种植窗恒定的想法，能够使RIF患者达到更有利的生殖结局，这也为生殖医学中的精准医疗提供了新的思路。

多囊卵巢综合征（ploycystic ovary syndrome，PCOS）是一种以排卵功能障碍和雄激素过多为特征的内分泌代谢紊乱疾病。生理情况下女性排卵后，子宫内膜在雌孕激素的作用下向分泌期转换，子宫内膜基质细胞在分泌中期发生自发性蜕膜化，这是进入内膜种植窗的标志，雌孕激素对于子宫内膜的作用是前提^[7]。目前有研究已证实PCOS患者子宫内膜容受性下降与孕激素抵抗效应有关^[8-9]。Savaris等^[10]通过微阵列比较正常妊娠女性和PCOS接受人工激素替代周期或接受克罗米芬药物促排的子宫内膜基因表达发现，PCOS患者子宫内膜中受孕激素调控基因如GRB2相关结合蛋白1（GAB1）、MIG6、白血病抑制因子（LIF）等表达明显低于正常妊娠女性。PCOS患者内膜发生孕激素抵抗的机制可能为孕激素缺乏、孕激素受体表达改变、孕激素受体信号通路异常及胰岛素抵抗^[8]。另外，在胚胎移植内膜准备方案中，因为PCOS患者稀发排卵或无排卵的原因需采用激素替代方案准备内膜，孕激素均由外源药物天然孕酮提供，相较于自身发育卵泡形成黄体的内源性孕激素，用药后血药浓度不稳定以及孕激素作用内膜时间缩短可能是这类患者发生种植窗移位的潜在因素。这为临床中对于合并PCOS的RIF患者的诊疗提供了新的思路：孕前充分的生活方式干预和药物治疗改善胰岛素抵抗是改变这类患者妊娠结局的基石，此外对于重复相同激素替代周期方案的PCOS患者，再次移植可选择促进卵泡发育的促排周期或诱导排卵周期改善黄体功能以降低孕激素抵抗对种植窗移位产生的影响。

1975年首次报道发育正常的成熟卵泡不破裂而黄素化（luteinized unruptured follicle，LUF），提示黄体形成并非所有经过排卵过程^[11]，部分卵泡未完成排卵即形成黄素化囊肿。而孕激素水平较低是LUF的激素变化特点。Xu等^[12]发现相较于正常排卵对照组女性，两者血清雌二醇水平无显著差异，但LUF患者血清孕酮水平明显降低，LUF患者子宫内膜整合素αvβ3表达强度显著低于对照组，且与血清孕酮水平相关。整合素αvβ3表达具有细胞周期特异性，与子宫内膜容受性密切相关，被认为是最具代表性的黏附分子和内膜容受性的标志物。虽然LH 峰出现至排卵的时间有个体差异，但LUF 周期 LH 峰低且较正常排卵者出现晚，这可能导致子宫内膜转型不充分蜕膜化程度低，从而影响胚胎种植窗。但余兰等^[13]通过比较冻融胚胎在自然排卵周期和LUF周期的临床结局认为对于LUF周期以明确的LH峰降低为依据来确定解冻移植周期以及加强LUF周期的黄体支持能使LUF周期获得与自然排卵周期相似的临床结局。

同时，本研究存在一定的局限性，由于研究样本例数的限制，有部分结果缺乏统计学差异，后期拟进一步扩大研究范围，完善相关参数的比较。

综上所述，ERT结合个性化移植方案对于改善RIF助孕结局具有肯定意义；合并PCOS和发生LUF是子宫内膜种植窗移位的危险因素。