乳腺癌是世界各地女性癌症死亡的主要原因之一。人类乳腺癌发展的危险因素包括遗传易感性和暴露于性类固醇激素升高的环境^[1]。乳腺癌基因1（breast cancer gene 1，BRCA1）和BRCA2基因的胚系突变导致性类固醇激素升高、患癌风险大大增加^[2-3]。有证据表明，BRCA是否突变、性激素水平的高低与罹患乳腺癌的风险之间存在潜在关系。据报道，BRCA基因突变携带大大增加了其在绝经前患乳腺癌的风险，其中，40～49岁BRCA1、BRCA2突变基因携带者的相对风险分别为32%和10%^[4-5]。由此看来，BRCA1基因突变与乳腺癌的发生密切相关，可大大增加携带者的患癌风险。因此，近年来，针对BRCA1基因突变的靶向干预措施成为乳腺癌干预的热点之一。

定期锻炼和适量的体育活动对人类的健康状况的益处毋庸置疑，可以提高整体生活质量。世界卫生组织制订并通过了“饮食、身体活动与健康全球战略”，意味着全球都认识到体育锻炼对健康和疾病预防控制的重要性^[6]。来自流行病学的研究数据表明，体育活动与降低某些肿瘤和疾病复发的风险有关^[7-8]。而使用不同动物模型的研究揭示：自主运动对肿瘤的生长具有抑制作用^[9-10]。然而，自主运动训练是否调节BRCA1突变人乳腺癌的生长仍然未知。此外，目前还没有研究证明体育锻炼对BRCA1突变人乳腺肿瘤生长影响的分子机制。

在本研究中，笔者发现在体内和体外实验中，自主运动通过抑制肿瘤细胞增殖和刺激肿瘤细胞凋亡来抑制BRCA1突变人乳腺肿瘤在BALB/c裸小鼠中的生长。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

4～5周龄BALB/c品系裸鼠44只（动物许可证号：SCXK 2014-00053）购自江苏集萃药康生物科技股份有限公司，在昆明医科大学实验动物中心饲养并完成所有实验操作。

用0.25%胰酶（sigma，美国）、DMEM（gibco life technologies，carlsbad，CA）、10%胎牛血清（invitrogen，USA）和青霉素/链霉素（amreso，J593，USA）进行肿瘤细胞分离与培养。MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司（货号C0009S），Caspase3活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，Annexin V-Fitc流式细胞检测试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司。使用microplate多通道酶标仪（biorad，hercules，CA，美国）对MTT及Caspase3活性测定的结果进行检测。

用于自由运动训练的动物用跑轮直径为12cm，宽度为5cm（nalge nunc international，rochester，NY，USA），跑轮连接到1个监测转数的接收器（Vital viewer）并采用数据采集系统软件（mini mitter，sunriver，OR，USA）。

1.2   标本获取与伦理审批

患者资料及样本的获取遵循医学伦理相关规定，并获得了云南省第三人民医院医学科研伦理委员会的审查和许可（许可证号：KHLL2022-YJ028），从知情同意的患者中获得乳腺肿瘤标本。纳入本研究的31例BRCA1突变携带者均来自云南省第三人民医院，这些患者在2022年1月至2022年5月期间在云南省第三人民医院接受乳房切除术或乳房肿瘤切除术，未合并其他系统器官疾病、术前未接受任何药物或放射治疗。患者的一般资料及BRCA1基因突变的情况，见表1。

表  1  携带BRCA1突变基因的乳腺癌患者BRCA1的突变状况及信息

Table  1.  BRCA1 gene mutation status and clinical information of breast cancer patients

BRCA1 突变类型（n）	家庭表型（n）	患者年龄（岁）（n）	组织学分类（n）	肿瘤分期（0-Ⅳ期）（n）
K679X（5）	family BC#（16）	< 30（1）	小叶型（5）	ⅡA&（5）
185delAG（4）	family OC（2）	30～35（8）	导管型（25）	ⅡB（5）
E1353X（5）	family BC及 OC（1）	36～40（2）	混合型（1）	ⅢA（8）
5382insC（4）	无（12）	41～45（6）		ⅢB（7）
S770X（4）		46～50（7）		ⅢC（5）
S868X（3）		51～55（4）		Ⅳ（1）
231delAA（3）		56～60（2）
8548delAAGG（1）		>60（1）
335delA（1）
IVS17+2T>C（1）
#，家庭表型，包括：家族性乳腺癌（family breast cancer，family BC），家族性卵巢癌（family ovarian cancer，family OC）；&，乳腺癌分期根据国际通用的UICC （union for international cancer control） 以及AJCC （American joint committee on cancer） 标准进行[11]。

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动物使用和护理遵循动物护理指南，该指南符合国际通用的《实验动物护理和使用指南》^[12]（美国国立卫生研究院发布No. 85-23，1996修订版）并通过昆明医科大学实验动物伦理委员会的审批（许可号：KMMU 2018032）。

1.3   乳腺癌细胞培养及鉴定

本研究使用了上述BRCA1基因突变携带者的乳腺肿瘤组织进行原代肿瘤细胞的培养，由此获得BRCA1基因突变的乳腺癌细胞（BRCA1-mut细胞）。组织处理、细胞分离及培养参照文献报道进行^[13]。简述如下，用手术刀将获取的组织切碎，在冰浴下浸入含1.5%胰蛋白酶的PBS液中，超声解离细胞5 min；随后将从组织中游离下的细胞转移到Dulbecco’s 改良Eagle/F12培养基中培养，该培养基含有：DMEM、10%胎牛血清和青霉素/链霉素。在恒温37 ℃、5% CO₂培养箱中培养。每2 天半量更换细胞培养液来维持细胞。上述细胞培养后经PCR检测表达上皮细胞标志物细胞角蛋白8和18，以及BRCA-1、erbB2和EGF受体基因，具有K-ras、H-ras和p53基因，符合乳腺癌细胞的标志性特征，可以用于下一步实验操作。

1.4   动物分组及处理

裸鼠被随机分为2组，自主运动组和静坐对照组，每组22只。自主运动组中7只用于采集自主跑轮运动鼠的血清，而在静坐对照组中7只裸鼠用于制备接受静坐处理的血清；每组中其余的15只裸鼠分别接受来自自主运动组及静坐对照组血清处理过的BRCA1-mut细胞注射形成异种移植瘤。

随机取每组7只裸鼠分别用于采集自主运动或静坐对照的血清。裸鼠在进行实验前1 d先放置于安装了跑轮的笼子中观察其自主运动情况，不自行跑动转轮的裸鼠不纳入实验研究。实验动物被允许自由地在单独的笼子里运动，不受限制地进行跑步轮运动^[14]。自主跑轮运动组中的裸鼠可以自由地接触到跑轮，而饲养静坐对照组裸鼠的笼子里也安装有同样的跑轮，但处于锁定状态。收集实验期间每晚（晚上7点到早上7点，为鼠类1 d中最为活跃的时段）每个转轮的数据（用于平均转数、平均跑步距离的计算），共进行连续14 d的自主跑轮训练。训练开始日及结束日对每组裸鼠进行体重检测。

1.5   条件血清制备及细胞培养

于14 d自主跑轮训练结束后，取1.4中描述的自主运动组及静坐对照组裸鼠，每组各7只，通过斩首收集血液。每组裸鼠的血清进行组内汇集，然后在56 ℃下热失活30 min，并如文献描述^[13]进行无菌过滤，用培养基分别配制10%的条件处理血清，备用。

将1.3中来自乳腺癌患者的原代培养BRCA1-mut肿瘤细胞接种到6孔板中以100000个/孔的浓度培养后，用2.5 mL含有10%自主跑轮运动组或静坐对照组血清的条件培养基替代10%胎牛血清继续培养至对数生长期^[12]，观察细胞状态。

1.6   细胞活力与细胞凋亡检测

不同条件血清处理后0 h、24 h、48 h、72 h、96 h，使用MTT法按试剂盒说明书指示测定细胞活力。每个样品的光密度在490 nm处使用microplate酶标仪测量。

取不同条件血清处理后处于对数生长期的2组细胞，使用碘化丙啶（PI）/Annexin V-FITC流式细胞检测试剂盒，按说明书指示观察接受不同条件血清处理后的BRCA1-mut细胞凋亡率^[15]。

1.7   移植瘤动物模型构建

接受移植瘤的裸鼠于实验前适应性饲养3 d，收集对数生长阶段的经不同条件血清处理的BRCA1-mut乳腺癌细胞，使用0.25%胰酶（Sigma，美国）消化成单细胞。用不含血清的DMEM清洗细胞。将计量为1.5×10⁶ cells/mL的单细胞重悬，用套管针皮下注射至裸鼠颈后，每只注射1 mL细胞悬液。接种完成后，将裸鼠单笼安置在装有运行轮（自主跑轮运动组）或固定轮（静坐对照组）的鼠笼中常规饲养。并于BRCA1-mut乳腺癌细胞移植后第7、14、21、28、35、42、49、63、70和第77天分别测量每个肿瘤的最大直径（a）和最小直径（b） 2次，用公式V = 0.5²×a²×b估算肿瘤体积（V），用平均肿瘤体积绘制各组小鼠的肿瘤生长曲线^[16]。同时，记录每组裸鼠的体重变化。

1.8   体内外样本的Caspase 3活性测定

分别取经过条件血清处理的BRCA1-mut肿瘤细胞以及接受肿瘤细胞注射后长出的肿瘤组织进行测定。细胞收集方法：取1.5中经不同条件血清处理的BRCA1-mut肿瘤细胞，计数为每组 4×10⁶个，细胞经冷冻离心（1500 r/min）5 min，重悬，在10 μL裂解液中冰浴裂解30 min。组织获取方法：从每只小鼠身上收集约50 mg新鲜肿瘤组织，并被解剖成3 mm³的组织，浸入预冷的裂解缓冲液超声裂解10 min，直至裂解液均质无肉眼可见组织块。分别取裂解好的细胞或组织液采用比色法测定各组的Caspase3活性，比色结果在酶标仪激发光波长为405 nm处测定。

1.9   移植肿瘤标本的TUNEL检测

取各组裸鼠皮下移植瘤，常规进行石蜡包埋、切片，用一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司，货号C1089）按试剂商说明书指示进行操作，用试剂盒中提供的阴性对照液替换TUNEL反应液孵育切片作为阴性对照。DAB试剂染色，HE复染细胞核。显微镜下每张切片随机挑选5个视野，拍照、计数、统计。

1.10   免疫印迹

用Western blot法测定细胞和肿瘤组织中活化的Caspase 3（cleaved caspase-3，Asp175）蛋白表达水平。将细胞或肿瘤组织样本在CytoBuster protein extraction buffer（Novagen，USA）中冰浴30 min，取50 μg总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，并用含有5%脱脂奶粉（sigma，美国）的TBST封闭膜。随后将膜与兔抗caspase 3 （1∶1000，碧云天生物技术有限公司，货号AC033）或鼠抗GAPDH （内参；1∶1000，碧云天生物技术有限公司，货号AF0006）在4 ℃孵育过夜。在TBST中洗涤后，膜用辣根过氧化物酶偶联二抗（1∶1000，碧云天生物技术有限公司）稀释液在25 ℃孵育1 h，漂洗并用电化学发光试剂盒（碧云天生物技术有限公司）进行膜上蛋白的免疫显影，结果由伯乐凝胶成像系统（美国）拍摄，灰色密度由SensiAnsys软件（中国培青）计算。

1.11   统计学处理

采用SPSS软件（SPSS 17.0，USA）进行数据的统计分析。数据以均数±标准差（SD）报告。使用Student’s t-test来确定2组之间的差异。所有假设检验均设为0.05显著性水平，以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   自主运动对BALB/c裸鼠体重变化的影响

自主运动组的小鼠每天自由使用活动转轮的时间为24 h，在黑暗周期（晚上7点到早上7点）中，该组裸鼠的平均转轮转数为（209±3.15）次/h·只，平均跑步距离为1.71 km/只·d。在整个研究结束时，静坐对照组和自主运动组之间的体重没有差异，静坐对照组（33.21±2.14） g；自主运动组（32.18±3.09） g，P > 0.05，见图1。

图  1  自主跑轮运动对荷瘤裸鼠体重的影响

Figure  1.  Effect of voluntary wheel running on body weight of nude mice with tumor

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2.2   自主运动条件血清处理抑制了BRCA1-mut肿瘤细胞在体外的增殖、促进细胞凋亡

来自于患者的BRCA1-mut肿瘤细胞在接受运动或静坐组裸鼠条件血清处理后，表现出了不同的增殖与活力。与静坐处理组条件血清培养的细胞相比，在自主跑轮运动条件血清中培养的BRCA1-mut细胞活力下降，从48 h起差异具有统计学意义（P < 0.05），直至实验观察终止节点96 h，见图2。

图  2  自主跑轮运动鼠条件血清处理抑制了乳腺癌细胞的增殖活力

MTT检测各组条件血清处理BRCA1-mut细胞的增殖活力。自主运动鼠条件血清处理降低了肿瘤细胞在体外的增殖活力。与静坐鼠条件血清处理组相比：^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  2.  Conditioned serum treatment inhibits the proliferation of breast cancer cells

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另外，流式细胞术检测的结果显示，与静坐鼠条件血清处理组相比，自主运动鼠条件血清处理后诱导了较多的乳腺癌BRCA1-mut细胞凋亡（P < 0.05），见图3B和图3C。

图  3  自主跑轮运动鼠条件血清处理促进了乳腺癌细胞的凋亡

流式细胞术检测自主运动鼠条件血清及静坐鼠条件血清处理后BRCA1-mut细胞在体外的凋亡情况。A：2组乳腺癌BRCA1-mut细胞的凋亡率比较；B：2组经流式检测显示乳腺癌BRCA1-mut细胞呈现不同的对PI（提示细胞死亡）与Annexin V-FITC荧光染料（提示细胞凋亡）的着色比率，自主运动鼠条件血清处理后有更多的细胞发生凋亡。与静坐鼠条件血清处理组相比：^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  3.  Conditioned serum treatment promotes apoptosis of breast cancer cells

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2.3   自主运动抑制了BALB/c裸鼠人乳腺BRCA1基因突变异种移植瘤在体内的生长

自皮下注射后到第14天，静坐组和自主运动组的肿瘤大小没有差异。从第21天到第77天，与静坐对照组相比，自主运动组皮下肿瘤的体积增加较少，自第35天开始，差异有统计学意义（P < 0.05），见图4A。实验结束时，静坐组平均肿瘤重量高于自由运动组，差异具有统计学意义（P < 0.05），见图4B和图4C。

图  4  自主跑轮运动抑制了BRCA1-mut乳腺癌移植瘤在裸鼠体内的生长

A：自BRCA1-mut细胞皮下注射开始至第77天期间2组裸鼠移植瘤的体积比较；B：BRCA1-mut细胞皮下移植注射后77天分离2组裸鼠皮下肿瘤的代表性对比图；C：BRCA1-mut细胞皮下注射后第77天观察结束时2组裸鼠移植瘤的重量比较。与静坐对照组相比：^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  4.  Voluntary running wheel exercise inhibites the growth of BRCA1-mut breast cancer grafts in nude mice

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2.4   自主运动诱导了BRCA1-mut乳腺癌移植瘤的细胞凋亡

取2组裸鼠的肿瘤组织进行TUNEL染色以检测肿瘤组织的细胞凋亡情况，结果发现，自主运动组移植瘤内凋亡细胞多于静坐对照组，TUNEL阳性染色主要位于细胞核，呈现出核染色质聚集、核异型、边集，差异具有统计学意义（P < 0.05），见图5。

图  5  自主跑轮运动诱导了BRCA1-mut乳腺癌移植瘤的凋亡（×400）

自主运动对BRCA1-mut乳腺癌细胞裸鼠移植瘤细胞凋亡的检测，用TUNEL末端标记法对各组凋亡情况做检测。A：各组组织TUNEL染色着色细胞，箭头标示的为TUNEL阳性染色细胞，放大倍数为400倍；B：各组TUNEL阳性染色细胞计数结果。与静坐对照组相比：^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  5.  Voluntary running wheel induces the apoptosis of the BRCA1-mut breast cancer cells transplanted tumors in the nude mice （×400）

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2.5   自主运动增加BRCA1-mut乳腺癌移植瘤及细胞的Caspase 3活性

经不同血清处理的BRCA1-mut细胞皮下注射后第77天观察结束时，取2组裸鼠的肿瘤组织进行了Caspase 3检测，结果发现，自主运动组肿瘤Caspase 3的活性高于静坐对照组，见图6A（P < 0.05）；Caspase 3的活化水平增加，差异具有统计学意义（P < 0.05），见图6B。

图  6  自由运动激活BRCA1-mut乳腺癌细胞及移植瘤的Caspase 3

自主运动对体外培养的BRCA1-mut乳腺癌细胞及裸鼠移植瘤内Caspase 3活性及活化片段的影响。A：自主运动组与静坐对照组中移植肿瘤内Caspase 3的活性比较；B：自主运动组与静坐对照组中移植肿瘤内Caspase 3活性片段的表达检测；C：自主运动鼠条件血清及静坐鼠条件血清处理后BRCA1-mut细胞Caspase 3的活性比较；D：自主运动鼠条件血清及静坐鼠条件血清处理后BRCA1-mut细胞Caspase 3活性片段的表达检测。O.D.405，405 nm 波长下酶标仪检测到的光密度值。与静坐鼠条件血清处理组相比：^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  6.  Voluntary running wheel increases the Caspase 3 activity in either of BRCA1-mut breast cancer cells and transplanted tumorsin nude mice

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取经不同条件血清处理的BRCA1-mut细胞，进行Caspase 3相关检测，结果发现，与静坐鼠条件血清处理组相比，自由运动鼠条件血清处理组细胞内Caspase 3的活性较高（P < 0.05），见图6C；且Caspase 3的活性片段表达增加（P < 0.05），差异均具有统计学意义，见图6D。以上结果提示自主跑轮运动以及自主运动鼠血清处理均可通过激活肿瘤组织或细胞内的Caspase 3，诱导肿瘤细胞凋亡增加，从而起到了抑制肿瘤细胞快速增殖的作用。

3.   讨论

在本研究中，运用自主运动鼠血清制备的条件培养基处理BRCA1-mut乳腺癌细胞，可降低其在体外的增殖活性、并通过提高凋亡执行蛋白Caspase 3的活性，促进肿瘤细胞凋亡；将经自主运动鼠血清处理的BRCA1-mut乳腺癌细胞对BALB/c裸鼠进行异种皮下移植，笔者观察到与移植了静坐鼠血清处理的BRCA1-mut细胞鼠相比，自主运动组裸鼠皮下肿瘤生长减缓，表现为体积减小、在实验观察结束时重量显著下降，且瘤体内Caspase 3的活性增加。因此，本研究结果提示自主运动可以抑制人乳腺BRCA1基因突变细胞及其在BALB/c裸鼠中异种移植瘤的活性与生长、促进肿瘤细胞凋亡，从而起到了对抗BRCA1基因突变所致乳腺癌发生发展的作用。

本研究发现，在没有食物限制的情况下，自主运动组和静坐对照组之间没有体重减轻。异种移植瘤生长到终末阶段会影响荷瘤动物的一般状态，通常是由于组织占位性病变或肿瘤细胞在体内侵袭迁移造成其他器官或系统的功能丧失，表现为实验动物进食饮水减少、主动活动减少等。结合本研究中观察到的静坐对照组荷瘤鼠肿瘤体积与重量均较自主运动组显著增加，笔者推测，实验结束时观察到的2组动物体重无差异可能是由于运动引起的食物摄入量的增加提高了体内能量代谢^[16]。此外，Gordon等^[17]探索了遗传菌株对意志运动代谢反应的影响。来自不同实验室的数据显示，跑步引起的体重减少或增加受到压力的影响^[18-20]。因此，笔者推测静坐对照组中裸鼠的肿瘤快速生长可能部分掩盖了其总体重下降的事实，因而表现为与自主运动组裸鼠总体重差异无统计学意义。

本研究揭示自主跑轮运动鼠血清处理后可显著抑制BRCA1基因突变乳腺癌细胞的增殖活力、并促进其凋亡增加，抑制裸鼠皮下的肿瘤组织生长。自主跑轮运动对其他肿瘤的移植作用已经得到了研究证实。Reddy等^[21]发现，自主跑轮运动可以抑制雄性大鼠氧化偶氮甲烷诱导的结肠癌；并通过抑制肿瘤代谢减缓了患者来源的结肠癌在裸鼠皮下移植瘤的生长^[22]；Cohen等^[23]证明，自主运动可以抑制大鼠甲基亚硝基脲诱导的乳腺肿瘤的发展；另有研究表明^[24]，有规律的运动训练通过调节宿主体内肿瘤微环境中炎症因子的水平对抗乳腺癌的进展；运动训练通过抑制宿主体内PI3K-Akt-mTOR)轴的激活显著减弱了三阴性乳腺癌的侵袭性^[25]。本研究运用自主跑轮运动训练，在BRCA1基因突变乳腺癌细胞以及荷瘤裸鼠模型中，验证其抑制肿瘤生长、促进肿瘤细胞凋亡的保护作用，对BRCA1基因突变乳腺癌的治疗提供了有益参考。

虽然有大量研究表明，自主运动可以影响多种肿瘤的生长发育，但运动调节肿瘤生长的机制尚未不清楚。本研究接下来探讨了自主运动抑制BRCA1基因突变乳腺癌生长的可能作用机制，笔者观察到自主运动促进乳腺癌细胞凋亡的提示增强了体内外肿瘤中凋亡执行因子Caspase3的活性。此结果提示，自主运动可能通过调节Caspase信号依赖机制诱导BRCA1突变乳腺癌细胞以及异种移植瘤的凋亡。其他报告表明，自主体育活动是抵消脂肪组织对乳腺癌增殖作用的一种手段^[26]。Pedersen等^[27]的微阵列分析揭示了车轮运动诱导的与免疫功能相关的通路的自发上调，这些通路将运动、肾上腺素和IL-6与NK细胞动员和再分配联系起来，并最终控制肿瘤生长。本研究部分阐明了自主运动训练调节乳腺癌生长的内在机制，为BRCA1突变乳腺癌的治疗提供了潜在靶点依据。

值得注意的是，运动训练对乳腺癌发展的影响在不同的研究中存在争议。例如，在化学诱导的乳腺肿瘤模型中，1组研究表明^[28]，自主运动可以抑制肿瘤的发展；而在C3（1）/SV40Tag乳腺癌小鼠模型中，自主轮跑活动不能抑制肿瘤发生^[29]。此外，Welsch及其同事发现^[30]，在高脂肪饮食治疗下，自主运动降低了无胸腺裸鼠中MDA-MB231人乳腺癌异种移植细胞的生长。作者认为，在这些研究中，运动对乳腺肿瘤发展产生反向影响的一个原因可能是由于研究者用于诱导乳腺癌的不同方式以及迥异的造模方式。

综上所述，本研究结果表明，自主运动通过增强Caspase3的活性、抑制了BRCA1突变乳腺癌细胞以及其在BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤的增殖、促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制其体内、外的生长。