左心室重建术对左心室重构的影响
Effect of Left Ventricle Reconstruction on Left Ventricular Remolding
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摘要: 目的 探讨左心室重建术对左心室重构的影响.方法 结扎14只普通级杂种犬冠状动脉, 建立左心室室壁瘤模型, 取犬正常心肌组织作为正常组;建模评估后将建模成功的犬平均分为2组, 实验组犬通过左心室重建术 (闭式折叠术) 折叠室壁瘤、重建左心室, 对照组犬则只进行开胸手术;6周后, 采集对照组、实验组犬的非手术区心肌组织, 使用实时荧光定量RT-PCR检测已采集的3个组的心肌组织AT1RmRNA、AT2RmRNA含量, 并通过透射电镜观察各组心肌组织的超微结构.结果 与正常组相比, 实验组和对照组非手术区心肌组织中AT2R mRNA表达显著更高 (P<0.05) , AT1R mRNA的表达显著更低 (P<0.05) , AT2R mRNA/AT1R mRNA比值显著更高 (P<0.05) .相较于对照组, 实验组非手术区心肌组织中AT2R mRNA的表达显著更低 (P<0.05) , AT1R mRNA的表达显著更高 (P<0.05) , AT2R mRNA/AT1R mRNA的比值显著更低 (P<0.05) ;与正常组相比, 实验组和对照组非手术区心肌组织电镜下都有心室重构 (心肌间质内可见胶原蛋白沉着明显, 胶原纤维明显增多) 和心肌损害 (心肌细胞内肌原纤维间隙增大, 细胞质水肿, 线粒体部分嵴断裂) 的超微结构表现;与对照组相比, 实验组的非手术区心肌组织电镜下心室重构和心肌损害程度小于对照组.结论 左心室重建术在一定程度上可以延缓左心室重构的发生, 降低心肌组织的损害程度, 有助于预防心室重构的发生及改善心室重构的预后.
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关键词:
- 左心室重建 /
- 左心室重构 /
- 实时荧光定量RT-PCR /
- 超微结构
Abstract: Objective To investigate the effect of left ventricular reconstruction on left ventricular remolding.Methods We selected twelve common dogs as experimental animals.We ligated the aeteria coronaria and established the model of ventricular aneurysm.We seleced the normal cardiac muscle as common group.After modelling and evaluating, the dogs of successful modelling were divided into two groups.The experimental group was rebuilt by the operation of left ventricular reconstruction (linear closure operation) .The control group was disclosed chest, yet it was not rebuilt by the operation of left ventricular (linear closure operation) ;after six weeks of the operation of left ventricular reconstruction, we obtained the cardiac muscle of nonoperating field in every group.Then we detected the content of AT1R mRNA, AT2Rm RNA of the cardiac muscle of every group by RT-PCR and observed ultrastructure of the cardiac muscle of every group by electron microscope.Results Compared with normal group, the expression of AT2R mRNA was significantly higher (P<0.05) , the expression of AT1R mRNA was significantly lower (P<0.05) , and AT2R mRNA/AT1R mRNA ratio was significantly higher (P<0.05) in experimental group and the control group.Compared with control group, the expression of AT2R mRNAwas significantly lower (P<0.05) , the expression of AT1R mRNA was significantly higher (P<0.05) , and AT2R mRNA/AT1R mRNA ratio was significantly lower (P<0.05) in experimental group;Compared with the common group, ventricular remolding (collagen protein obviously deposited in the mesenchyme of cardiac muscle, collagen fibers became obviously larger) and cardiac damage (the gap of myofibrilla became larger in myocardial cell, cytoplasm dropsy, the part of mitochondria cristas was broken) ultramicrostructure took place in the cardiac muscle of the experimental group and the control group;compared with the control group, the extent of ventricular remolding and Cardiac damage of experimental group was less than the control group in the electron microscope.Conclusion Left ventricular reconstruction (linear closure operation) can delay the process of left ventricular remolding to a certain extent, lower the extent of cardiac damage and help to prevent the development of ventricular remolding and improve the prognosis of ventricular remolding. -
砷是自然界分布非常广泛的一种非金属元素，其化合物可导致心血管疾病、糖尿病、癌症等多种疾病发病率增加[1-4]。无机砷（iAs）进入人体之后被人体代谢主要生成一甲基胂酸（monomethylarsenic acid，MMA）和二甲基胂酸（dimethylarsenic acid，DMA），代谢产物主要通过尿液排出，因此尿中的砷化物常常作为砷暴露的标志物，不同代谢产物所占的比例常常用来反映个体对砷的代谢能力，发现砷代谢的能力和砷暴露导致的疾病密切相关，无机砷容易代谢为一甲基胂酸，但一甲胂酸转化为二甲基胂酸受阻的群体砷暴露后DNA损伤更高，以及砷相关疾病的发病率更高[5-7]。
EGFR编码一种跨膜糖蛋白是蛋白激酶超家族的成员，该蛋白二聚化和酪氨酸自磷酸化，从而导致细胞增殖[8]。PTEN被鉴定为一种肿瘤抑制因子[9]。Kras编码一种小GTPase超家族成员的蛋白质[10]。PIK3CA基因编码的蛋白质是作为催化磷脂酰肌醇3-激酶一个亚基而发挥功能[11]。4个基因在癌症的发生、发展中均起重要作用，在多种肿瘤组织中就发现它们存在较高频率的突变[8-11]。
砷暴露会导致基因损伤从而导致基因突变，而上述的4个基因肿瘤中均存在突变，因此砷作为一种重要的环境致癌物，是否会导致EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤值得探讨，因此本研究探索了砒霜厂职业砷暴露工人EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿砷及其代谢的关系。
1. 资料与方法
1.1 研究人群
本调查研究采用病例对照研究方式。砷暴露工人来自砒霜厂。砒霜厂主要生产纯度为99%的三氧化二砷（As2O3），因此职业暴露较为单纯。对照组的人群来源于居住在距离工厂约10～50 km的村庄的农民，没有职业砷暴露史，3个月内没有其他明显的砷暴露途径。所有受试者的生活和经济条件相似，且与周围神经系统的退行性疾病和癌症无关。访谈结束后，研究人员收集了劳动工人的流行病学资料、血样、尿样。血液样本通过EDTA管采集，尿液样本通过塑料瓶采集。样本采集过程参照文献[12]。本研究通过昆明医科大学伦理委员会批准（批号KMMU2020MEC000）。
1.2 尿中砷化物浓度检测
检测尿液样本中3种砷（DMA、iAs和MMA）的水平。本检测方法的最小阈值是2 μg。采用尿肌酐试剂盒（jaffe法）检测尿肌酐。计算DMA、iAs和MMA与总砷（tAs）的比值（DMA%、MMA%和iAs%）。通过SMI、DMA%、MMA%和iAs%评估砷甲基化的效率[12]。
1.3 DNA损伤评估
裂解外周血细胞并纯化基因组DNA。根据文卫华等[12-13]的实验方案，Q-PCR用于评估基因DNA损伤。预变性时间为10 min，其他PCR条件根据LC®96荧光定量系统的默认设置进行。在本实验方案中使用了以下寡核苷酸序列。Kras上游：GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAA，下游：AAAGAATGGTCCTGCACCAGTA； EGFR上游： CAACAGCACATTCGACAGCC，下游： GCATTTTCAGCTGTGGAGCC；PTEN 上游：AGACCATAACCCACCACAGC，下游： CACCAGTTCGTCCCTTTCCA；PIK3CA上游：GCTCAAAGCAATTTCTACACGAGA，下游： TCCATTTTAGCACTTACCTGTGAC；β-actin上游： CGGGAAATCGTGCGTGACAT， 下游：GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。-ΔCt值用于评估基因的损伤水平。
1.4 统计学处理
经检验尿砷及其代谢产物、甲基化指数均不符合正态分布，数据表示为M（P25，P75）。将各数据进行对数转换，对数转换后数据服从正态分布，数据表示为
$\bar x \pm s $ ，以此开展分析。通过Pearson相关分析DNA损伤与尿液砷含量的相关性。对照组和暴露组之间采用Student’t检验。所有统计均使用R3.4.1软件包进行。检验水准为α = 0.05。2. 结果
2.1 一般情况
暴露组和对照组工人年龄、吸烟率、饮酒率的分布差异无统计学意义（P > 0.05）。而尿中iAs、MMA、DMA、MMA%、DMA%和 SMI在2组中差异具有统计学意义（P < 0.05），见表1。
表 1 受试人群的一般特征和尿砷水平（$ \bar{x} \pm s $ ）Table 1. General characteristics and urinary arsenic levels of the test population （$ \bar{x} \pm s $ ）变量 对照组（n = 24） 暴露组（n = 78） t P 年龄（岁） 35.814 ± 3.241 36.531 ± 5.972 / / 吸烟（是/否） 14/10 46/32 / / 饮酒 （是/否） 11/13 38/40 / / iAs 0.439 ± 0.185 2.023 ± 0.464 16.291 < 0.001* MMA 0.379 ± 0.153 2.141 ± 0.489 17.355 < 0.001* DMA 1.124 ± 0.304 2.660 ± 0.516 13.824 < 0.001* iAs% 13.763 ± 11.392 17.457 ± 12.409 1.299 0.197 MMA% 8.531 ± 2.322 19.150 ± 5.071 9.921 < 0.001* DMA% 77.712 ± 12.001 63.393 ± 12.291 −5.019 < 0.001* PMI 1.166 ± 1.290 1.614 ± 1.289 1.488 0.140 SMI 10.010 ± 3.777 3.763 ± 2.126 −10.291 < 0.001* *P < 0.05。 2.2 暴露组与对照组基因损伤的比较
暴露组工人EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤高于对照组，4个基因的平均损伤也高于对照组（P < 0.05），见表2。
表 2 受试人群的4个基因的损伤和平均损伤的比较（$ \bar{x} \pm s $ ）Table 2. Comparison of damage and average damage of 4 genes in the test population （$ \bar{x} \pm s $ ）变量 对照组
（n = 24）暴露组
（n = 78）损伤变化 t P EGFR 2.299 ± 0.118 2.514 ± 0.047 0.215 2.024 0.046* PTEN 2.432 ± 0.078 2.791 ± 0.065 0.359 2.884 0.005* Kras 2.468 ± 0.124 2.818 ± 0.060 0.350 2.718 0.008* PIK3CA 2.852 ± 0.061 3.225 ± 0.038 0.373 4.856 < 0.001* 平均损伤 2.512 ± 0.075 2.837 ± 0.036 0.325 4.181 < 0.001* *P < 0.05。 2.3 尿中代谢产物含量与基因损伤的关系
分析EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿中代谢产物含量关系，发现PTEN损伤与尿中iAs和MMA含量呈正相关，Kras与尿中MMA含量呈正相关，PIK3CA和平均损伤与尿中iAs、MMA和DMA含量均呈正相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），见表3。
表 3 3种砷化物含量与所有受试者基因DNA损伤水平的相关性Table 3. Correlation between the levels of three arsenicals and the levels of genetic DNA damage in all subjectsDNA 损伤 iAs MMA DMA r P r P r P EGFR 0.160 0.109 0.157 0.116 0.112 0.263 PTEN 0.235 0.018* 0.237 0.016* 0.185 0.063 Kras 0.182 0.068 0.200 0.044* 0.137 0.170 PIK3CA 0.324 0.001* 0.319 0.001* 0.269 0.006* 平均损伤 0.296 0.003* 0.302 0.002* 0.230 0.020* 数据分析采用皮尔逊相关法，*P < 0.05。 2.4 尿中代谢产物含量与基因损伤的关系
分析EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤与尿中代谢产物百分比关系，发现iAs%与基因损伤不存在相关关系（P > 0.05），MMA%与4个基因DNA损伤和平均损伤均存在正相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），DMA%与Kras、PIK3CA、平均损伤存在负相关，且差异具有统计学意义（P < 0.05），见表4。
表 4 3种砷化物尿中的百分比与所有受试者基因DNA损伤水平的相关性Table 4. 3 Correlation between percentages of arsenic compounds in urine and levels of genetic DNA damage in all subjectsDNA损伤 iAs% MMA% DMA% r P r P r P EGFR 0.086 0.388 0.249 0.012* −0.177 0.076 PTEN 0.059 0.554 0.319 0.001* −0.185 0.063 Kras 0.110 0.269 0.354 < 0.001* −0.241 0.015* PIK3CA 0.121 0.224 0.329 0.0001* −0.240 0.015* 平均损伤 0.125 0.210 0.427 < 0.001* −0.285 0.004* 数据分析采用皮尔逊相关法，*P < 0.05。 将样本按照二级甲基化指数的中位数分为2组，发现Kras、PIK3CA、平均损伤在高SMI组中较低（P < 0.05），见表5。
表 5 所有受试者按SMI水平分层的DNA损伤比较（$ x \pm s $ ）Table 5. Comparison of DNA damage stratified at SMI level for all subjects （$\bar x \pm s $ ）变量 低SMI（n = 51） 高SMI（n = 51） t P SMI[中位数（范围）] 2.654 （1.064-3.800） 7.444 （3.848-21.840） / / EGFR 2.550 ± 0.065 2.377 ± 0.063 1.914 0.059 PTEN 2.811 ± 0.083 2.602 ± 0.070 1.932 0.056 Kras 2.874 ± 0.081 2.596 ± 0.074 2.537 0.013* PIK3CA 3.252 ± 0.055 3.022 ± 0.042 3.345 0.001* 平均损伤 2.872 ± 0.049 2.649 ± 0.047 3.282 0.001* *P < 0.05。 3. 讨论
砷暴露可以导致肺癌、膀胱癌等多种疾病发生率显著提高，因为砷进入人体可以产生多重的效应[4, 14]，其中导致DNA损伤是重要的效应之一[12-13]，DNA损伤可能导致基因突变最终导致细胞癌变[1-3]。有文献采用彗星实验和微核试验的方法研究砷暴露对DNA和染色体的损伤[15-16]，发现砷暴露导致了损伤的增强[17]。文卫华等[12-13]利用PCR的检测方法发现砷暴露导致p53基因DNA的损伤增加，笔者的研究证实砷暴露会增加EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤，结果是一致的，也再次证实砷对与癌变相关基因的影响。
之前研究显示无机砷容易代谢为一甲基胂酸，但一甲胂酸转化为二甲基胂酸受阻的群体，其DNA损伤更为严重[12-13]，基因表达变化更显著[12-13]，而且砷相关疾病的发病率更高[5-7]。高SMI和DMA百分比较高均表示对砷代谢能力强，笔者的结果显示高SMI的群体DNA损伤较低，DMA百分比与DNA损伤呈负相关，与文献一致，结合文献说明代谢能力强的个体砷的有害效应较低[5-7, 18]，对健康影响相对小。
综上所述砷暴露和代谢能力影响了EGFR、PTEN、Kras、PIK3CA 4个基因DNA损伤，可能是砷致癌机制之一。
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