熊果酸诱导甲状腺乳头状癌细胞TPC-1凋亡的实验
Thyroid Papillary Carcinoma Cells TPC-1 Apoptosis Induced by Ursolic Acid
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摘要: 目的 研究熊果酸 (ursolic acid UA) 在体外对人甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1增殖的抑制作用.方法采用不同浓度的UA干预细胞 (对照组0μM, 实验组3μM、6μM、12μM) ;MTT法观察同一时间不同浓度的UA和不同时间同一浓度的UA对TPC-1细胞生长情况的影响;流式细胞术 (FCM) 检测应用UA后TPC-1细胞凋亡情况及细胞周期分布情况;QRT-PCR检测UA干预后TPC-1细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9 m RNA的表达情况;Western blot检测UA干预后TPC-1细胞中Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白的表达情况.结果 MTT实验结果显示UA对TPC-1细胞增殖的抑制呈现出浓度和时间的依赖性, 24 h、48 h、72 h的IC50分别为14.21μM、10.56μM、10.39μM;流式Annexin V-FITC/PI双染检测显示UA呈浓度依赖性诱导TPC-1细胞凋亡, 且将TPC-1细胞的生长阻滞在S期;QRT-PCR实验发现, 对照组与实验组均有Bcl-2、Bax、Caspase-9 m RNA的表达, UA呈浓度依赖性下调Bcl-2 m RNA的表达, 上调Bax和Caspase-9 m RNA的表达;Western blot结果显示, 对照组与实验组均有Bcl-2、Bax、Caspase-9蛋白的表达, UA呈浓度依赖性下调Bcl-2的表达, 上调Bax和Caspase-9的表达.结论 熊果酸可显著抑制人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的增殖并诱导其凋亡, 为甲状腺癌治疗提供一定思路.Abstract: Objective To study the inhibitory effect of ursolic acid on the proliferation of human papillary thyroid carcinoma cell line TPC-1 in vitro. Method TPC-1 cells were treated with different concentrations of ursolic acid (control group:0μM, experimental group:3μM, 6μM, 12μM) ; MTT assay was used to observe the effect of the growth of TPC-1 cells on different concentrations of ursolic acid at the same time; Apoptosis and cell cycle distribution of TPC-1 cells were treated with ursolic acid by flow cytometry; The expression of Bcl-2, Bax and Caspase-9 mRNA in TPC-1 cells were treated with ursolic acid by QRT-PCR; The expression of Bcl-2, Bax and Caspase-9 protein in TPC-1 cells were treated with ursolic acid by Western blot. Results MTT assay showed that ursolic acid inhibited the proliferation of TPC-1 cells in a concentration and time-dependent manner, and the IC50 at 24 h, 48 h and 72 h was 14.21 μM, 10.56 μM, 10.39 μM; Flow cytometry showed that ursolic acid inhibited the apoptosis of TPC-1 cells in a concentration-dependent manner, and the growth of TPC-1 cells was arrested in S phase; QRT-PCR showed that Bcl-2, Bax and Caspase-9 mRNA were expressed in the control and experimental groups, ursolic acid inhibited the expression of Bcl-2 mRNA in a concentration-dependent manner and up-regulated the expression of Bax and Caspase-9 mRNA; Western blot results showed that Bcl-2, Bax and Caspase-9 were expressed in the control and experimental groups, ursolic acid inhibited the expression of Bcl-2 protein in a concentration-dependent manner and up-regulated the expression of Bax protein and Caspase-9 protein.Conclusion Ursolic acid can significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of human papillary thyroid TPC-1 cells, providing some ideas for the treatment of thyroid cancer.
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Key words:
- Thyroid papillary carcinoma /
- Ursolic acid /
- Apoptosis /
- Cycle /
- Bcl-2 /
- Bax /
- Caspase-9
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蒽环类化疗药物（anthracyclines，AC）有确切临床疗效：抗肿瘤作用强且抗肿瘤谱广，在实体肿瘤和恶性肿瘤疾病治疗得以广泛应用，尽管免疫和靶向等新疗法层出不穷，迄今为止AC仍是血液淋巴系统恶性肿瘤等基础性治疗药物[1]。但其心脏毒性是主要药物不良反应（adverse drug reaction，ADR）[2]，且患者预后有可能受其影响[3]。尽管大多数急性白血病患儿ALCP（acute leukemia child patient ，ALCP），有望成为长期幸存者，但对于患儿而言，其各器官处于发育阶段，仍可能经历与化疗相关的不良晚期反应[4]。在长期接受AC治疗的患儿（尤其是使用过阿霉素和柔红霉素），心脏毒性的高发率已得到充分证明[5]。甚至部分ALCP在治愈后会出现心脏毒性的药物不良反应，且随着药物剂量增加，毒副作用出现几率也增加，影响患儿预后生活质量和无病生存率；即便低剂量使用AC在临床心功能下降可能无明显表现，也可引起亚临床心功能减退[6-7]，高达65%的幸存者在成年后会经历左室亚临床异常[8]。蒽环类药物可通过诱导心肌细胞形态、功能改变、心肌肌浆网损伤、线粒体空泡化等途径促进心肌损伤，从而对左心室功能和顺应性产生负面影响[9]。预防AC的ADR：如心脏毒性，早期监测其ADR显得尤为重要[10]。本文应用Tei指数研究AC化疗后ALCP的心功能改变，提示Tei指数可作为患儿亚临床心功能改变的较敏感指标。
1. 资料与方法
本研究已获昆明市儿童医院医学伦理委员会批准（20180223）， 获得了参与者或其监护人的知情同意。
实验组研究对象为2018 年 3月至 2020 年 12 月入住昆明医科大学附属儿童医院血液科的0～14岁ALCP，所有患儿诊断均经骨髓穿刺和MICM分型确诊[11-12]。其中实验组分为用药前，累积量为100 mg/m2、200 mg/m2和250 mg/m2 4组。纳入和排除标准叙述如下[9]。
1.1 纳入标准
（1）首次诊断ALCP；（2）无心脏疾病史；（3）按指南或专家共识等使用AC，且无损害心脏药物史。
1.2 排除标准
（1）复发ALCP；（2）有遗传代谢性疾病史；（3）有先天性和后天性心脏疾病史：房间隔或室间隔缺损等、心律失常、心肌炎等。
对照组为2018 年 3月至 2020 年 12 月入住昆明医科大学附属儿童医院0～14岁排除ALCP的患儿。
1.3 仪器与方法
仪器：心脏超声诊断仪来自GE和PHIPIS公司，探头的频率为5～6 MHz。
1.3.1 超声指标（常规）
测量左室内径（舒张和收缩末期）和厚度（室壁）后计算左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）；短轴缩短率（fractional shortening，FS）、每搏输出量（stroke volume，SV）、舒张末容积（end-diastolic volume，EDV）。
1.3.2 组织多普勒（tissue doppler imaging，TDI）
在左右室侧壁和室间隔基底段，分别置于取样容积，减小取样线与心肌运动方向夹角。舒张早期运动速度峰值（e'M）、二尖瓣环收缩期运动速度峰值（s'M）、和舒张晚期运动速度峰值（a' M）应用左室侧壁及室间隔基底段数据计算；右室侧壁和室间隔基底段数据计算s'T、e'T、a'T。测量ICTLL、ICTS、ICTRL、ETLL、ETS、ETRL、IRTLL、IRTS、IRTRL，用公式计算Tei=（心室等容收缩时间+等容舒张时间）/射血时间。
1.4 方法
超声心动图（常规指标、TDI和Tei指数）监测对照组和实验组（用药前）心功能；用药后实验组按照累积剂量100 mg/m2、200 mg/m2、250 mg/m2研究心功能，见图1、图2。
图 1 TDI条件下测得的室间隔的 Tei 指数、s’、e’和 a’Figure 1. Measurement of interventricular septum Tei index，s’，e’ and a’
图 2 TDI条件下测得的右室侧壁的 Tei 指数、s’、e’和 a’Figure 2. Measurement of right ventricular lateral wall Tei index，s’，e’ and a’1.5 统计学处理
使用SPSS 22.0软件进行分析。符合正态分布计量资料采用均值±标准差（$\bar x \pm s $）表示，组间比较采用t检验，偏态分布采用四分位数表示，组间采用非参数秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 患者一般资料
对照组和实验组分别入组21例和15例。其中实验组包含19例男童和11例女童，男女比例为1.72∶1；实验组包括21例急性淋巴细胞白血病和9例急性髓系白血病患儿。但随访到累积剂量为及250 mg/m2 时，实验组病例脱落了15例，见表1。
表 1 基线资料比较统计表 （$\bar x \pm s $）Table 1. Baseline data comparison statistical table （$\bar x \pm s $）项目 组别 χ2/t P 对照组（n=21） 病例组（n=15） 性别[n（%）] 男 14（66.7） 10（66.7） 0 1 女 7（33.3） 5（33.3） 年龄（岁） 8.49±2.631 6.887±3.4303 1.589 0.121 BSA 1.112±0.219 1.136±0.2234 −0.318 0.752 2.2 对照组与用药前实验组研究结果
常规心脏超声指标中LVEF 的均值都在 60%以上，FS、SV及EDV均在正常范围，常规指标、TDI和Tei指数比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
表 2 对照组与实验照组用药前常规超声指标统计表 [（$\bar x \pm s $）/M （Q1，Q3）]Table 2. Statistical table of routine ultrasound indexes between control group and before medication of experimental group [（$\bar x \pm s $）/M （Q1，Q3）]项目 组别 t/t’/z P 对照组（n=21） 实验组（n=15） LVEF（%） 69.119±6.09431 67.8133±5.45957 0.661 0.513 FS（%） 38.0571±4.82779 36.82±4.44574 0.783 0.439 SV（mL）# 50（25～75） 30.7（23.5～39.4） −0.546 0.585 EDV（mL） 48.1952±14.13147 48.9933±15.13621 −0.162 0.872 s’M（m/s）# 30.8（25.75～40.45） 0.05（0.045～0.06） −1.816 0.069 e’M（m/s） 0.1133±0.02266 0.116±0.02063 −0.361 0.72 a’M（m/s）# 0.06（0.05～0.0725） 0.05（0.05～0.07） −0.05 0.96 e’T（m/s）# 0.06（0.05～0.06） 0.13（0.115～0.145） −0.147 0.883 TeiS# 0.07（0.06～0.0725） 0.38（0.37～0.41） −0.766 0.444 TeiRL# 0.4（0.375～0.4） 0.42（0.395～0.42） −0.492 0.622 TeiM 0.3881±0.01806 0.384±0.02473 0.575 0.569 TeiT 0.4±0.02408 0.3967±0.0216 0.427 0.672 #表示经过SK正态性检验得出非正态分布。 2.3 实验组用药前后研究结果
实验组用药前与各累计剂量的LVEF 的均值都在 60%以上，FS、SV及EDV均在正常范围，差异无统计学意义（P>0.05），见表3。
表 3 实验组用药前与各累计剂量的常规超声指标统计表 [（$\bar x \pm s $）/M （Q1，Q3）]Table 3. Statistical table of routine ultrasound indexes of the experimental group before medication and each cumulative dose [（$\bar x \pm s $）/M （Q1，Q3）]项目 组别 χ2/F P 用药前 100 200 250 LVEF（%）# 68.4（64.3～72.4） 65.5（61.3～69.4） 65.4（63.5～70.6） 67.3（64.9～70.2） 1.221 0.748 FS（%）# 37.2（33.2～40.6） 35.1（31.1～39.4） 35.4（33.7～40.9） 37.3（35.9～40.2） 2.398 0.494 SV（mL）# 33.3（26～40.9） 31.3（26.3～40.2） 35.1（27.5～40.2） 35.2（28.1～41） 0.922 0.82 EDV（mL）# 50.3（37.8～58.2） 49.6（36.2～55.4） 50.6（38.9～53.2） 50.2（39.9～57.3） 0.497 0.92 s’M（m/s）# 0.06（0.05～0.07） 0.06（0.06～0.07） 0.06（0.06～0.07） 0.06（0.05～0.07） 2.024 0.567 e’M（m/s）# 0.12（0.1～0.13） 0.11（0.11～0.13） 0.11（0.11～0.13） 0.11（0.1～0.12） 1.926 0.588 a’M（m/s）# 0.06（0.05～0.06） 0.06（0.05～0.07） 0.06（0.05～0.06） 0.06（0.05～0.06） 2.047 0.563 e’T（m/s）# 0.13（0.12～0.14） 0.13（0.12～0.14） 0.13（0.13～0.14） 0.12（0.12～0.13） 8.077 0.044* TeiS# 0.4（0.38～0.4） 0.4（0.38～0.42） 0.4（0.4～0.42） 0.4（0.4～0.42） 6.746 0.08 TeiRL# 0.4（0.4～0.42） 0.42（0.41～0.44） 0.44（0.43～0.44）a 0.44（0.44～0.44）a 18.371 <0.001* TeiT# 0.4（0.38～0.41） 0.42（0.39～0.43） 0.42（0.42～0.43）a 0.42（0.42～0.44）a 15.687 0.001* TeiM 0.384±0.025 0.394±0.01957 0.4027±0.0166a 0.4053±0.0203a 3.307 0.027* #表示经过SK正态性检验得出非正态分布；P<0.05；a表示与用药前存在显著差异。 3. 讨论
在肿瘤治疗中，AC是临床最常用的一种药物，药物AC的ADR很多，其中最严重的ADR是心脏毒性；在治疗过程中药物累积与心脏毒性有关，心脏毒性在临床上主要表现为患者心功能不全[13]。AC的不良反应有多种机制，如拓扑异构Ⅱβ抑制和铁介导下活性氧簾机制等[14]。药物AC的心脏毒性临床表现和时间都不一致，且发病时多数为无临床症状，但临床症状出现时心脏多为严重受损[15]。若在ALCP化疗中早发现心脏损伤，对预防或治疗患儿预后尤为重要。故本研究收集了昆明医科大学附属儿童医院血液科使用蒽环类药物ALCP，研究该类患儿药物使用前后的心功能，其目的为了给该类患儿的心脏保护起到保驾护航作用。
监测心功能常用方法包括心肌活检、心电图、磁共振成像和超声心动图等。但心肌活检适用性不强、心电图缺乏特异度和敏感性、磁共振费用昂贵且耗时长。虽然LVEF是化疗后心功能早期监测首选指标[16]，在心脏病学中具有独特的地位[17]。但心脏早期的变化，LVEF不敏感，故不能及时评估实际的心脏损害[18]。临床中多数患者心肌功能损害（严重心肌功能损害）时，才能被LVEF监测到，但此时损伤是不可逆伤[19]。若能及时通过监测发现AC对心脏功能的影响，并对心脏进行早期保护，可规避心脏功能恶化和心力衰竭[20]。而日本学者提出的Tei指数（心肌做功指数），其目的是综合评价舒张整体功能和心脏收缩 [21]。且Tei 指数具有无创、简单和重复操作性强特点，目前广泛应用于心血管领域[22]。
目前，抗癌药物相关心脏毒性研究主要研究左心室功能[23]，但右心室与多种心血管疾病及癌症的预后有密切关系，本研究评价ALCP使用AC后的左右心室功能，探索心脏毒性发生敏感预测指标。在恶性肿瘤患儿，Tei指数指标更敏感，左心Tei指数与AC累计剂量成正比[24]。在研究中，除累积量为100 mg/m2 时差异无统计学意义外，笔者发现左右心Tei指数与AC累计剂量成正比。但本研究局限为：（1）样本量少导致无法分少数民族组，在今后研究中增加样本量和分少数民族组；（2）除应用超声心动图监测AC对左右心室功能的影响，无其他鉴定标准或组织学证证明AC引起心肌损伤。
综上所述，Tei指数变化提示心功能亚临床已经发生改变，其数值升高可预测ALCP使用AC后心脏毒性的发生。Tei 指数无创、费用低、可重复、操作简单、敏感和特异性，不受心率和心肌形态变化的影响，可用于心脏功能非侵入性影像学检查，对早期亚临床心脏功能障碍的发现具有重要的意义。
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