冲击波对兔神经肌肉接头及肌组织形态学的影响
Effect of Shock Wave on NMJ and Muscle Morphology in Rabbits
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摘要: 目的 评估放散式体外冲击波 (radial extracorporeal shock wave treatment, rESWT) 处理后兔小腿三头肌组织形态学及神经肌肉接头处AChE和nAChR含量改变.方法 体重 (2±0.2) Kg雄性新西兰兔60只, 对左小腿三头肌肌腹行强度1.5bar, 频率10 Hz的2 000次冲击.在rESWT处理当天和处理后第1、2、4、6、8周 (分别对应第16组) 各取10只兔的双侧小腿三头肌组织, 冰冻切片后进行HE染色观察肌肉组织形态学变化, Ach E染色后测量平均光密度值, nAChR免疫组织化学染色后对nAChR进行计数.结果 所有实验兔HE染色两侧对比未见肌组织形态学明显差异;前5组实验侧Ach E平均光密度值对比对照侧显著升高 (P<0.05) , 处理后第1周实验侧Ach E平均光密度值达峰值后缓慢下降, 至处理后8周实验侧与对照侧相比AchE平均光密度值差异无统计学意义 (P>0.05) ;AchR计数对比前5组均显示实验侧对比对照侧显著降低 (P<0.05) , 但自冲击波处理当天至处理后8周呈现逐渐升高的趋势, 处理后8周实验侧与对照侧相比AchR计数差异无统计学意义 (P>0.05) .结论 对兔单侧小腿三头肌肌腹行适当强度rESWT处理后, 肌组织HE染色显示形态学未产生较大影响, 而短时间内AchE明显增多、AchR显著降低, 提示该强度rESWT的处理在短时间内降低肌细胞接受刺激的数量及程度, 进而减少动作电位的产生.Abstract: Objective To evaluate the AChE and nAChR in the NMJ and the morphology of the muscle in the bilateral triceps surae after the unilateral shock wave therapy. Method 60 male New Zealand rabbits weighing (2±0.2) Kg were used in this study. Two thousand shock waves at an energy flux density of 1.5 bar and the frequency of10 Hz were applied to their left calf muscles. Divided into six groups, both sides of the triceps muscle of calf were taken out on the day of the shock wave and the1, 2, 4, 6 and 8 weeks after the treatment. HE staining was used to observe the morphological changes of muscle tissue and the average optical density was measured after AChE stain so as to calculate the receptor count after Acetylcholine receptor immunohistochemistry. Result No abnormal morphological abnormalities were observed in all rabbits. In the first five groups, the AChE was significantly higher in the side of the shockwave treatment compairing with the control side (P<0.05) , slow decrease after 1 week after the treatment. In the first five groups, the nAChR was significantly lower in the side of the shock wave treatment compairing with the control side (P <0.05) , and gradually increased to normal after 8 weeks. Conslusion Suitable dose of shock wave will not have a greater impact on morphology of muscle tissue. After the shock wave treatment, the amount and degree of stimulate of muscle cells were decreased, and the production of action potentials was reduced. While the experimental side Ach E and AchR in shock wave treatment day to 8 weeks after treatment showed a significant trend to normal, it shows that the effect of shock wave on NMJ is transient and reversible.
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慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的患病率在全球范围内呈逐年上升趋势，严重威胁了人类健康。随着疾病进展，CKD患者极易并发慢性肾脏病-矿物质和骨异常（chronic kidney disease - mineral and bone metabolism disorder，CKD-MBD），表现为矿物质代谢紊乱、骨调节激素异常、各种骨骼病变及软组织钙化。核因子 κB 受体活化因子配体 （receptor activator of NF-κB ligand，RANKL）属于肿瘤坏死因子配体超家族的一员，具有促进破骨细胞生成、分化及成熟的重要作用[1-2]；骨保护素 （osteoprotegerin ，OPG）属于肿瘤坏死因子受体超家族的一员，可抑制破骨细胞的分化与成熟，并诱导其凋亡[3-4]；成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factor，FGF23）由长骨中的骨细胞和成骨细胞分泌，可作用于肾脏及甲状旁腺，参与调节机体磷与维生素 D 的动态平衡[5-6]。近年来相关研究表明，血清RANKL、OPG 、FGF23在多种骨病的发生与发展中起重要作用。本研究通过比较CKD不同分期患者血清RANKL、OPG、FGF23的表达水平，分析血清RANKL、OPG、FGF23与肾功能及钙磷代谢指标的相关性，探讨其在CKD-MBD早期诊断中的临床价值。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
选择 2021年1月至2022年2月于云南省第一人民医院肾内科收治的符合CKD诊断标准的患者62例作为研究组，并依据KDIGO对 CKD 的分期标准进行分组，另选取同期昆明省第一人民医院体检中心的健康人员26名纳入对照组。入组标准：（1）满足CKD的诊断标准，且未行肾脏替代治疗患者；（2）入组前至少2周内未使用活性维生素D及其类似物类药物、磷结合剂或拟钙剂治疗；（3）病例资料完善且配合。排除标准:（1）甲状旁腺疾病、恶性骨肿瘤、多发性骨髓瘤者；（2）急性肾损伤、严重感染、骨折、其他系统严重急慢性疾病者；（3）长期应用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物。2组人员性别及年龄比较，差异无统计学意义，具有可比性。2组人员均签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 实验室指标
收集研究组血钙（Ca）、血磷（P）、碱性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、胱抑素C（Cys C）、尿酸（UA）、血红蛋白（Hb）、甲状旁腺激素（PTH）等指标；对照组收集血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）。
1.2.2 血清RANKL、OPG、FGF23检测
2组人员均于清晨留取静脉血 5 mL，置入真空静脉采血管，自然静置20 min后以3 000 r/min离心10 min，留取上清液分装后置于-40 ℃冰箱内保持，待标本收集完毕后，统一检测。通过酶联免疫吸附实验测定血清RANKL、OPG、FGF23水平，试剂盒自武汉伊莱瑞特生物科技公司采购，RANKL试剂盒货号为VPSY7RIAVW，FGF23试剂盒货号为P3GNYEGS8U，OPG试剂盒货号为7UIYERD2IC。
1.3 统计学处理
采用 SPSS 26.0 统计软件包分析数据，定量资料采用均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）描述，两组间比较表采用独立样本t检验；多组间比较采用ANOVA方差分析，组间两两比较采用 LSD-t检验；计数资料采用百分比（%）描述，采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关性分析法。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 研究组与对照组各相关指标水平比较
研究组患者SCr、BUN及血清RANKL、OPG、FGF23水平均高于对照组（P < 0.05），见表1。
表 1 对照组与研究组各指标水平比较（$\bar x \pm s $ ）Table 1. Comparison of each index level between control group and research group （$\bar x \pm s $ ）分组 n SCr（μmol/L） BUN(mmol/L) RANKL（pg/mL） OPG（pg/mL） FGF23（pg/mL） 对照组 26 79.2 ± 16.3 3.9 ± 0.9 114.0 ± 35.7 1.02 ± 0.43 96.5 ± 36.7 研究组 62 380.8 ± 347.5 15.9 ± 10.5 200.3 ± 84.9 1.60 ± 1.08 203.6 ± 111.9 t 25.343 29.664 17.340 14.707 22.204 P 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* *P < 0.05。 2.2 CKD不同分期患者各相关指标水平比较
随着CKD患者肾功能进展， SCr、BUN、Cys C、PTH、P水平逐渐升高（P < 0.05）；CKD5期组患者血清RANKL、OPG、FGF23水平高于CKD2～3期组及CKD4期组（P < 0.05），提示血清RANKL、OPG、FGF23与CKD疾病进展有关。随着CKD患者肾功能进展，eGFR、Hb水平逐渐降低（P < 0.05）；CKD4期组及CKD5期组患者Ca水平高于CKD2-3期组（P < 0.05）。CKD不同分期患者间UA、ALP水平及RANKL/OPG差异无统计学意义（P > 0.05），见表2、表3。
表 2 CKD不同分期患者各相关指标水平比较（$\bar x \pm s $ ）Table 2. Comparison of relevant indicators in patients with different stages of CKD （$\bar x \pm s $ ）组别 n eGFR（mL/min） SCr（μmol/L） BUN(mmol/L) Cys C（mg/L） UA（μmol/L） Hb（g/L） ALP（pg/mL） CKD2～3期组 20 51.8 ± 15.8 126.6 ± 28.4 7.5 ± 2.5 1.50 ± 0.39 450.4 ± 94.3 141.3 ± 21.2 76.9 ± 26.9 CKD4期组 20 20.8 ± 5.3* 263.2 ± 65.9* 12.5 ± 3.2* 2.91 ± 0.77* 501.2 ± 124.4 122.8 ± 22.3* 102.0 ± 98.1 CKD5期组 22 7.6 ± 2.8*# 713.7 ± 387.9*# 26.4 ± 10.3*# 4.54 ± 0.96*# 517.5 ± 125.3 103.4 ± 20.6*# 89.3 ± 44.2 F 160 35.58 46.164 83.333 1.877 16.931 0.778 P 0.000* 0.000* 0.000* 0.000* 0.162 0.000* 0.464 与CKD2-3期组比较，*P < 0.05；与CKD4期组比较，#P < 0.05。 表 3 CKD不同分期患者各相关指标水平比较（$\bar x \pm s $ ）Table 3. Comparison of relevant indicators in patients with different stages of CKD （$\bar x \pm s $ ）组别 n PTH（ng/L） Ca（mmol/L） P（mmol/L） RANKL（pg/mL） OPG（pg/mL） FGF23（pg/mL） RANKL/OPG CKD2～3期组 20 84.6 ± 32.6 2.28 ± 0.12 1.01 ± 0.27 163.2 ± 67.0 1.06 ± 0.68 151.3 ± 69.9 297.2 ± 352.0 CKD4期组 20 202.1 ± 171.0* 2.17 ± 0.17* 1.16 ± 0.22* 205.5 ± 87.9 1.42 ± 0.91 196.6 ± 107.1 316.9 ± 443.2 CKD5期组 22 475.5 ± 340.9*# 2.09 ± 0.16* 1.46 ± 0.36*# 229.4 ± 87.6*# 2.42 ± 1.21*# 257.3 ± 126.0*# 183.2 ± 287.3 F 16.490 7.849 12.656 3.512 8.190 5.450 0.831 P 0.000* 0.001* 0.000* 0.036* 0.001* 0.007* 0.441 与CKD2-3期组比较，* P < 0.05；与CKD4期组比较，#P < 0.05。 2.3 血清RANKL、OPG、FGF23与肾功能及钙磷代谢指的标相关性分析
Pearson相关分析显示，血清RANKL水平与SCr、BUN、Cys C、PTH、FGF23呈正相关性（P < 0.05），与eGFR、Hb呈负相关性（P < 0.05）；血清OPG水平与SCr、BUN、Cys C、FGF23呈正相关性（P < 0.05），与eGFR、Hb呈负相关性（P < 0.05）；血清FGF23水平与SCr、BUN、Cys C、PTH、P、RANKL、OPG水平呈正相关性（P < 0.05），与eGFR、Hb、ALP、Ca呈负相关性（P < 0.05），见表4。
表 4 血清RANKL、OPG、FGF23与各指标相关性分析Table 4. Correlation analysis of serum RANKL，OPG，FGF23 and each index指标 RANKL OPG FGF23 r P r P r P eGFR −0.512 0.000* −0.362 0.000* −0.414 0.000* SCr 0.549 0.000* 0.389 0.000* 0.434 0.000* BUN 0.537 0.000* 0.390 0.000* 0.457 0.000* Cys C 0.440 0.000* 0.342 0.000* 0.400 0.002* UA 0.214 0.097 0.102 0.434 0.157 0.226 Hb −0.258 0.046* −0.254 0.048* −0.329 0.010* ALP 0.207 0.110 −0.075 0.567 −0.009* 0.045* PTH 0.259 0.044* 0.008 0.953 0.335 0.008* Ca −0.125 0.336 0.014 0.914 −0.270 0.036* P 0.240 0.063 0.178 0.171 0.403 0.001* RANKL − − 0.108 0.314 0.450 0.000* OPG 0.108 0.314 − − 0.216 0.042* FGF23 0.450 0.000* 0.216 0.042* − − *P < 0.05。 3. 讨论
CKD-MBD是CKD 终末期及维持性血液透析患者最常见的并发症之一，具有起病隐匿、累积范围广、危害性大、死亡率高等特点。在肾功能受损早期多以PTH轻度升高为主，钙磷代谢异常在CKD 3～5 期患者中更为常见。既往研究发现，钙磷代谢情况与CKD患者的疾病进展存在明显相关性，对钙磷代谢的指标评估有助于人们了解CKD患者病情发展情况[7]。CKD患者随着肾功能进展及肾小球滤过率下降，血清OPG、FGF23水平逐渐升高，提示血清OPG、FGF23不仅是CKD的危险标志物，也可能是CKD疾病进展的危险因素[8-9]。但关于RANKL与CKD及其并发症的相关性，暂无人做出相关研究。
笔者发现，研究组患者血清RANKL、OPG、FGF23水平均明显高于对照组；在研究组中，随着CKD患者eGFR的下降，血清RANKL、OPG、FGF23水平处于逐渐升高的趋势，相关分析显示RANKL、OPG、FGF23水平与eGFR呈负相关，提示 RANKL、OPG、FGF23 与CKD的发生、发展可能存在一定相关性。近年研究表明，在CKD 患者中存在血清OPG、FGF23水平明显升高的情况，且其升高时机相对于传统骨代谢生化指标如Ca、P、PTH等更加提前[10]。在本研究中，CKD2-3期组患者血Ca、P仍在正常范围时，PTH、血清RANKL、OPG、FGF23水平就已开始升高。相关性分析显示血清RANKL水平与PTH呈正相关，FGF23水平与PTH、P呈正相关，与Ca呈负相关，但OPG与钙磷代谢指标无明显相关性。我们发现血清RANKL与CKD疾病进展及钙磷代谢也存在一定相关性，血清RANKL、FGF23是早期发现CKD患者钙磷代谢紊乱的敏感指标。
综上所述，血清RANKL、OPG、FGF23与CKD患者肾功能进展存在一定相关性，血清RANKL、FGF23与钙磷代谢存在一定相关性，监测CKD患者血清RANKL、FGF23水平，对预防及诊断CKD-MBD具有重要意义。
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[1]王玉龙, 高晓平, 张秀花, 等.康复功能评定学[M].第2版.北京:人民卫生出版社, 2013:280-281. [2]潘文秀, 谢青, 顾琳, 等.重复经颅磁刺激在脑卒中后肌痉挛中的康复应用[J].中国医学前沿杂志 (电子版) , 2017, 9 (2) :58-62. [3]张志杰, 刘四文, 唐丹.脊髓损伤后肌痉挛的评价与治疗[J].中国康复医学杂志, 2006, 21 (2) :188-189. [4]肉毒毒素治疗成人肢体痉挛状态中国指南 (2015) [J].中国康复医学杂志, 2015, 30 (1) :81-110. [5] [5]TORII Y, GOTO Y, TAKAHASHI M, et al.Quantitative determination of biological activity of botulinum toxins utilizing compound muscle action potentials (CMAP) , and comparison of neuromuscular transmission blockage and muscle flaccidity among toxins[J].Toxicon, 2010, 55 (2-3) :407-414. [6]郭佳宝, 朱毅, 陈炳霖, 等.放散式体外冲击波治疗脑卒中后肢体痉挛的系统评价[J].中国康复医学杂志, 2017, 32 (2) :207-212. [7] [7]SOHN M K, CHO K H, KIM Y J, et al.Spasticity and electrophysiologi changes after extracorporeal shock wavetherapy on gastrocnemius[J].Ann Rehabil Med, 2011, 35 (5) :599-604. [8]杨志杰, 阎文静, 陈修平, 等.放散式体外冲击波治疗脑卒中后小腿三头肌痉挛的疗效研究[J].中国康复医学杂志, 2013, 28 (4) :352-355. [9] [9]温瑞.甲钴胺对周围神经损伤后运动终板再生修复的影响[D].开封:河南大学 (硕士论文) , 2010. [10] [10]TOMONORI KENMOKU, 1 NOBUYASU OCHIAI, 1 SEIJI OHTORI, et al.Degeneration and recovery of the neuromuscular junction after application of extracorporeal shock wave therapy[J].J Orthop Res, 2012, 30 (10) :1660-1665. [11]李建伟, 郑世江, 张景春, 等.不同频率冲击波针灸对膝骨性关节炎患者疼痛及功能活动的影响[J].针刺研究, 2015, 40 (4) :300-303. [12]冯海清, 陈明亮.冲击波治疗肌腱末端病的疗效分析[J].福建体育科技, 2015, 34 (2) :16-18. [13]宋小慧.发散式体外冲击波对脑梗死患者肢体痉挛和运动功能的影响[D].上海:上海交通大学 (硕士论文) , 2015. [14] [14]SKETELJ J, CRNE-FINDERLE N, SKET D, et al.Comparison between the effects of botulinum toxin-induced paralysis and denervation on molecular forms of acetylcholinesterase in muscles[J].J Neurochem, 1993, 61 (2) :501-508. [15] [15] TOMONORI KENMOKU, NOBUYASU OCHIAI, SEIJI OHTORI, et al.Deneneration and recovery of the neuromuscular junction after application of extracorporeal shock wave therapy[J].Orthop Res, 2012, 30 (10) :1660-1665. 期刊类型引用(9)
1. 孟贤，赵璐，郑珊珊. 新生儿坏死性小肠结肠炎患儿血清肠脂肪酸结合蛋白水平变化及诊断价值分析. 包头医学. 2022(02): 3-5 . 
百度学术2. 赵丽. 新生儿坏死性小肠结肠炎患儿发生脑损伤的影响因素. 黑龙江医学. 2022(15): 1808-1810+1814 . 百度学术3. 李丽娜. 血清瓜氨酸与新生儿坏死性小肠结肠炎的相关性分析. 中国当代医药. 2022(23): 149-152 . 百度学术4. 杨雪利，何刚，田鹏，刘娟. Ⅰ-FABP对坏死性小肠结肠炎的早期诊断及预后预测的价值研究. 四川医学. 2021(04): 404-408 . 百度学术5. 李才荣，王玮琳，刘江玲. 静脉注射用丙种球蛋白治疗新生儿溶血病与足月儿坏死性小肠结肠炎发病的相关性研究. 临床和实验医学杂志. 2021(09): 986-989 . 百度学术6. 刘延霞，林则彬，何波，郑祝龄. 个性化预测新生儿坏死性小肠结肠炎发病风险的列线图模型构建. 中国儿童保健杂志. 2021(08): 838-842 . 百度学术7. 刘欣，王群，陶旭炜，黄砚屏，曾凌空. 血清SAA、CRP、SIRT1水平与新生儿坏死性小肠结肠炎疾病进展的关系及其诊断价值分析. 现代生物医学进展. 2021(10): 1849-1853 . 百度学术8. 范文婷，廖伟. 新生儿坏死性小肠结肠炎发生的主要危险因素及手术时机对预后影响的回顾性分析. 川北医学院学报. 2019(06): 679-682 . 百度学术9. 和灿琳，胡浩，戍俊陶，刘玲，奚敏. 新生儿坏死性小肠结肠炎病情进展的影响因素分析. 临床医学研究与实践. 2018(28): 112-114 . 百度学术其他类型引用(0)
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