慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一种异质性肺部疾病，主要表现为持续的进行性气流受限，从而引起慢性呼吸道症状（呼吸困难、咳嗽、咳痰和/或病情加重）^[1]。COPD在全球范围内是一个重要的公共卫生问题，全球总体发病率约为10%^[2]，有患病率高、致死致残率高、病程及治疗周期长等特征。基于人口调查的数据，中国的COPD患病率更高，其年龄标准化患病率分别为男性3.2%，女性2.0%，实际的患病率则为8.2%～13.7%^[3]，多项研究显示COPD在全球范围内的人口预测趋势显示出显著的上升趋势^[4]。近年来，COPD的研究从分子机制探究到临床表型分析，各类研究层出不穷。在这些研究中，基因测序技术被广泛应用于深入理解COPD的遗传学基础和病理过程。然而，传统的基因测序方法主要提供细胞群体的平均数据，限制了细胞个体差异性的认识，使得疾病的复杂病理机制难以完全揭示。为了克服这一局限，单细胞测序技术应运而生，单细胞测序技术是一种前沿的生物信息学方法，通过在个体细胞层面分析基因表达，揭示细胞异质性，对理解疾病机理、发现生物标志物及个性化医疗具有重要意义。本文将详细阐述单细胞测序技术的原理，并全面综述其在COPD研究中的多样化应用，探讨单细胞测序技术在COPD研究中的应用和前景。

1.   单细胞测序技术概述

单细胞测序技术（single-cell RNA-seq，SCS）自20世纪90年代初期由Norman Iscove实验团队首次证实其可行性以来，已经走过了一段从概念验证到广泛应用的漫长旅程。Iscove利用PCR技术实现了cDNA的指数级扩增，为单细胞转录组分析铺平了道路^[5]。2009年，北京大学的汤富酬教授及其团队发表了全球首篇单细胞mRNA测序的研究文章，标志着单细胞转录组测序技术的正式诞生^[6]。至此，单细胞测序技术经历了从手工到自动化、从低通量到高通量的演变，极大地扩展了我们对基因表达的深度和细胞多样性的认识。尤其是第三代单细胞测序技术不需要PCR扩增步骤，缩短了测序时间，并实现实时检测信号，为我们理解复杂的生物学过程提供了新的视角和工具。

SCS是一种高通量测序技术，用于分析单个细胞的基因组、转录组或表观遗传组信息，具体来说，就是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整基因组后进行高通量测序。其基本流程包括：单细胞分离、全基因组扩增（WGA）及测序文库构建、数据分析及解读^[7]。单细胞分离是第一步关键步骤，常用方法有梯度稀释法、流式细胞荧光分选技术（FACS）、微流控技术和激光捕获显微切割（LCM）等^[8]。单细胞全基因组扩增及构建测序文库是单细胞测序技术关键环节，WGA通过MDA或PCR扩增方法放大单个细胞中的微量DNA，满足高通量测序需求^[9]。扩增后，DNA进入测序文库构建阶段，包括片段化、末端修复、接头连接和文库扩增^[10]。测序后的数据需经预处理和质量控制，去除低质量序列和污染物，确保数据清洁和质量。基因表达量定量分析通过比对读段到参考基因组，计算基因表达水平。细胞聚类分析根据基因表达模式分组，识别细胞异质性。差异表达分析识别表达差异显著的基因，可能关联特定生物学过程或疾病。轨迹分析推断细胞状态转变和分化路径，细胞通讯分析揭示细胞间相互作用。数据可视化工具如散点图、热图、PCA图和t-SNE图，帮助直观理解数据。数据分析是迭代过程，需多次调整优化，确保结果可靠性和生物学意义^[11]。随着技术发展，新的分析方法和工具不断涌现，为研究提供更多选择。

图  1  单细胞测序技术步骤流程图

Figure  1.  Flowchart of the steps in single-cell sequencing technology

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2.   单细胞测序在COPD中的应用

2.1   COPD概述及研究进展

COPD是一种以持续性气流受限为特征的肺部疾病。早期研究普遍认为吸烟、环境空气污染、体重不足、儿童慢性咳嗽、父母有呼吸道疾病史和受教育程度低是主要危险因素^[12]。其发病机制复杂，涉及炎症反应、氧化应激、蛋白酶-抗蛋白酶失衡以及肺组织的重塑等多个方面^[13]。近年来的研究开始关注生物活性小分子，如氨基酸及代谢物、活性肽、金属离子等在COPD发病中的作用，这些小分子参与调节氧化还原平衡、抑制炎症介质释放和调控细胞功能，并预测疾病进展^[14]。

COPD是一个受遗传和环境因素交互作用影响的多基因疾病^[15]。遗传流行病学（COPD Gene）研究揭示了遗传基础的重要性，至今已有超过20个遗传位点被确定与COPD的发病状态相关，还有额外的位点与COPD相关表型相关^[16]。同样，2019年的全基因组关联研究根据定量成像特征和共病关联对COPD遗传风险位点聚类成不同的组^[17]，这进一步支持了COPD的遗传易感性，扩展了我们对COPD遗传基础的理解。其他研究通过测试常见遗传变异，识别出FGF7基因及其调控区域的功能性变异对COPD风险的影响^[18]以及FAM13A基因与COPD的遗传易感性之间的联系^[19] ，这些研究补充解释了COPD除烟雾暴露等环境因素易感性，对COPD治疗策略提供了新的靶点和方向。

在诊断方面，COPD主要依靠肺功能检查，但由于早期症状不明显及肺功能检查的低普及，大多数患者直至病程中晚期才就诊，治疗效果往往不佳。目前已发现一些生物标记物，为COPD早期诊断及个性化治疗提供新思路。例如，α2巨球蛋白（A2M）在COPD患者表达下降，并且A2M变化与吸烟、FeNO和CaNO无显著相关性，可能成为非吸烟COPD患者的潜在生物标记物 ^[20]。随着技术发展，新的影像诊断技术逐步应用于早期诊断，如参数响应映射（parametric response mapping）等，有助于更早地发现小气道的损伤，从而早期识别COPD患者^[21]。

2.2   单细胞测序对COPD的鉴别作用

SCS技术在鉴别COPD患者与健康对照组之间细胞亚群差异方面发挥着重要作用，为理解COPD的细胞特异性机制提供了可能。Li X等^[22] 通过对比3名健康非吸烟者和COPD患者的29961个细胞，识别出17种不同的细胞群体，特别是单核细胞、巨噬细胞和纤毛上皮细胞表现出显著差异表达基因。An L等^[23]利用SCS鉴别出不同的先天淋巴细胞（ILC）亚群，且丰度存在差异，在COPD患者的肺中频率倾向于更高，展现出免疫细胞在COPD发病中的重要意义。CS不仅能够分析COPD患者肺组织中的不同细胞类型，还能够进一步分析不同细胞内基因表达差异。Sauler M^[24]团队使描绘了COPD患者与健康对照组相比肺泡生态位的变化，该图谱发现了COPD中不同上皮细胞、内皮细胞和巨噬细胞群中先前未被发现的基因表达变化和细胞相互作用，突出了COPD中细胞损伤和炎症的复杂性和多样性，增进了对COPD肺泡稳态变化的理解。

2.3   单细胞测序对COPD不同“内型”的识别作用

COPD内型是指在不同慢阻肺患者中可能表现出不同的病理生理特征和炎症模式，在医学中分型的目标是为了发现具有独特预后或治疗特征的病人组别^[25−26]。SCS通过分析COPD患者炎症反应和免疫细胞的变化，能够有效识别COPD内型。Singh D等^[27]发现嗜酸性粒细胞在COPD患者中在差异表达。在嗜酸性粒细胞性COPD患者中，轻度气流受限比例较低，且这种炎症内型更可能发生在男性、质指数（BMI）以及有某些共病风险的个体中。国内学者补充了中性粒细胞增多型的研究，指出中性粒细胞炎症内型与特定的微生物群落特征相关，并以嗜血杆菌为主，这种内型更多地与急性加重相关，可能影响COPD的病理过程和治疗^[28]。

另外，SCS可以揭示环境因素对COPD内型的影响，在COPD发展中，香烟烟雾是主要危险因素，Wohnhaas等^[29]利用SCS揭示了以前未认识到的急慢性烟草暴露对气道上皮细胞类型特异性影响以及不同亚群转录异质性。Huang Q^[30]等对COPD及不同吸烟史对照组进行单细胞测序分析，发现单核细胞在分子变化中富集，强调了烟雾暴露下单核细胞在COPD病理生物学中的免疫调节异常，这可能涉及到不同亚群的单核细胞在COPD中的特定作用和调节机制。以上研究识别出不同暴露下COPD的内型，有助于深入理解COPD异质性，为提高治疗精准性，改善患者预后和管理奠定基础。

2.4   单细胞测序对COPD严重程度的评估作用

COPD患者存在明显的免疫功能紊乱，这种紊乱涉及多种炎症细胞和细胞因子的异常表达与相互作用。这些免疫调节异常可能导致组织损伤和炎症反应的加剧，从而影响COPD的严重程度。SCS的出现，为深入理解COPD相关的免疫失调机制提供了技术支持。Sauler M^[24]的研究发现在晚期COPD患者的肺泡上皮II型细胞亚群中，存在代谢功能异常和应激耐受性降低的现象，这可能与COPD的进展相关。此外，Freeman C M等对COPD患者肺组织中的CD8（+） T细胞进行单细胞RNA测序，揭示了CD8⁺ T细胞通过IFNG与骨髓和肺泡II型细胞相互作用，并表现出过度扩张的T细胞受体克隆型。研究还指出，肺中CD8（+） T细胞的特定表达，如IL-18R和CD69与COPD的严重程度相关。同样，mRNA转录本中的穿孔素和颗粒酶B也与疾病的严重程度相关^[31]。

2.5   单细胞测序在COPD治疗中的作用

COPD在临床表现、疾病进展、对治疗的反应性等方面均存在明显的异质性，单细胞测序技术在单细胞层面解析COPD不同亚群以及细胞间相互作用并识别潜在的治疗靶点。Hu Y等^[32]发现COPD患者中存在转录异质性的肺巨噬细胞和单核细胞，并通过计算机模拟预测皮质类固醇氟替卡松是调节这些细胞异常转录谱的顶级化合物。这一研究表明吸入性皮质类固醇在COPD不同炎症亚型中的疗效可能存在差异。进一步地，薛廷^[33]等通过对单细胞数据综合分析，发现IL1RN、S100A8和S100A9与激活的树突状细胞（DC）正相关，并在肺气肿小鼠肺组织中观察到对应mRNA相对表达量上调，揭示了DC在COPD中的关键作用，并识别出核心基因，为COPD的免疫治疗提供了理论依据。另一项研究利用多个与SCS相关的研究，探讨了巨噬细胞铁死亡在COPD中的分子机制，揭示了SOCS1和HSPB1作为COPD中铁死亡相关巨噬细胞的新生物标志物，并可能成为未来COPD治疗的潜在靶点^[34]。值得注意的是，一些研究已经开始关注肠道微生物群对COPD的影响。通过单细胞RNA测序及血清代谢组学分析，发现肠道菌群组成显著影响吸烟诱导的COPD发展，存在肠道菌群-肺COPD轴。金氏拟杆菌能降低肠道炎症，增强结肠线粒体和核糖体活性，系统地恢复血清中异常氨基酸代谢，并抑制肺部炎症，这为探索肠道微生物群与肺免疫力之间的关系提供了新的视角^[35−36]。

表  1  单细胞测序在COPD研究中的部分应用案例

Table  1.  Some Application Cases of Single-cell Sequencing in COPD

研究内容	研究对象	主要发现
细胞亚群差异分析	COPD患者VS健康对照组	在上皮细胞、内皮细胞、免疫细胞中 均表现不同的基因表达及分子功能差异。
COPD内型识别	COPD患者	COPD不同内型对环境暴露、临床表现、 疾病进展、治疗反应性等方面均存在明显异质性。
COPD严重程度评估	COPD肺组织	IL-18R、CD69及穿孔素表达上调代表疾病的进展， 可评估COPD严重程度。
发现治疗靶点	COPD患者及小鼠模型	SOCS1和HSPB1可能是COPD治疗新靶点；肠道微生物能通过 调节肺组织炎症反应稳定COPD肺免疫力。

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3.   单细胞测序在COPD应用中的挑战

单细胞测序技术在COPD研究中具有巨大的潜力，但同时也面临诸多挑战。包括scRNA-seq数据中普遍存在的高比例零值表达水平，细胞间变异的来源难以界定，系统误差和批次效应的存在，数据缺失问题和技术偏差，从而影响对细胞亚群的准确识别和分类。实验设计的挑战，如无法实现完全平衡的实验布局，增加了区分技术与生物学变异的难度。统计分析的复杂性提高，需要考虑零值处理和批次效应校正。数据标准化和归一化方法的选择对于减少技术变异的影响至关重要。最后，确保实验结果的重复性和可复制性也是一项重要但艰巨的任务^[37]。

4.   小结

随着SCS在COPD研究中的应用领域的普及，研究者不仅识别出以前未被鉴定的细胞亚群，还探索了新的生物标志物和新的治疗靶点。此外，结合机器学习算法^[38]，SCS还能预测COPD患者的关键诊断基因标志物，为疾病的早期诊断和精准治疗提供了新工具。未来单细胞测序的成本将会降低，更多的科研将会使用这项技术，单细胞多组学技术如结合基因组、表观组、蛋白组和代谢组等，将在临床转化应用方面为疾病进程提供更全面的视角。单细胞测序将在COPD的早期诊断、疾病监测和个性化治疗中以及并发症研究中发挥更加重要的作用。