云南省食源性沙门菌血清分型及脉冲场凝胶电泳的指纹图谱
Serotyping and PFGE Type of Salmonella Isolates in Yunnan Province
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摘要: 目的 研究云南省食源性沙门菌的血清型, 用脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 方法对优势血清型进行分子分型, 建立云南省食源性沙门菌PFGE指纹图谱资料库, 为食源性疾病溯源提供数据.方法 对2013年至2016年从云南省食源性疾病监测中分离到的322株食源性沙门菌进行血清学分型, 采用Bio Numerics软件对148株沙门菌DNA酶切图谱进行类聚分析, 通过聚类比较分析菌株间的相关性, 建立指纹图谱库.结果 322株沙门菌血清分型主要包括A、B、C、D、E、F、G群等7个群, 鼠伤寒沙门氏菌是主要血清型, 占11.4% (37/322) .采用Bio Numerics软件对148株沙门菌DNA酶切图谱进行类聚分析, 根据电泳产生条带的位置和数量的不同, 共分为102个不同的PFGE带型.按照90%的相似度, 这些PFGE带型可以分为39个大小不一的聚类群, 呈现多样性.结论 云南省食源性沙门菌分子分型复杂, 以鼠伤寒沙门氏菌为主, PFGE带型呈现多样性.Abstract: Objective To study the serotypes and molecular characteristics of foodborne Salmonella in Yunnan Province using pulsed field gel electrophoresis (PFGE) and to establish PFGE fingerprint database.Methods This study was carried out on the basis of the Serological typing of 322 strains of foodborne Salmonella which was isolated from Yunnan national foodborne disease surveillance from 2013 to 2016. The clustering analysis was conducted on 148 strains of Salmonella DNA restriction enzyme map by using the software of Bio Numerics. Fingerprint database was established through the comparison of clustering analysis correlation on bacterial strain. Results The serotype of 322 strains of Salmonella mainly included A, B, C, D, E, F, G and other 7 groups, among which Salmonella typhimurium was the major type, accounting for 11.4% (37/322) . Cluster analysis was applied using Bio Numerics software in 148 strains of Salmonella DNA restriction enzyme map.According to the different number and the different positions, electrophoresis strips were divided into 102 different PFGE patterns (Figure 1) , which was categorized into 39 clusters if 90% of the strips was similar. Conclusion Foodborne salmonella molecular classification is complex. Salmonella typhimurium is the major type. PFGE belt type presents diversity.
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胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤。据报道，每年约有14000例新增的胶质瘤患者[1]，且老年人具有较高的发病率。尽管目前手术切除以及放化疗等医学技术取得了很大的进步，但患者的预后仍然较差，临床上仍无法彻底治愈恶性程度较高的胶质瘤。因此，探索胶质瘤的潜在发病机制，寻找新的预后标志物迫在眉睫。miRNA是由18～25个核苷酸组成的非编码RNA，已被广泛报道参与调节肿瘤细胞的生理过程[2-3]，通过与靶mRNA的异常表达和交叉调节可作为肿瘤的诊断和预后标志物。例如：miR-4319在甲状腺癌组织和细胞中下调，抑制甲状腺癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化[4]。miR-149是肿瘤中具有广泛调控作用的miRNA，由2q37.3上的MIR149基因编码。Xu B等[5]报道，促进miR-149-5p表达可增强替莫唑胺对胶质瘤细胞的毒性。但miR-149-5p在胶质瘤中的作用机制尚不清楚。因此，本研究将探讨miR-149-5p对胶质瘤细胞恶性生物学行为的调控作用及其具体作用机制。
1. 材料与方法
1.1 临床样本收集
收集在渭南市中心医院就诊并确诊为胶质瘤患者的肿瘤组织样本30例，在距肿瘤组织2 cm处获得相邻的癌旁组织样本（即对照组），在收样前患者知情并签署知情同意书。采集样本的患者除手术治疗外未接受其他治疗。本研究工作遵循世界医学协会赫尔辛基宣言进行，同时获得了渭南市中心医院伦理委员会的批准（2023研004-3）。
1.2 细胞系
胶质瘤细胞系A172（货号：CL-0012，Pricella，武汉）、U251（货号：CL-0237，Pricella，武汉）、HS683（货号：CL-0362，Pricella，武汉）、H4（货号：CBP60590，Cobioer，南京）。人正常星形胶质细胞HA1800（货号：AC340443）和293T细胞（货号：KMCC-001-0255）购自上海中乔新舟生物科技有限公司。
1.3 主要试剂
90%高糖DMEM培养基、DMEM培养基购自上海中乔新舟生物科技有限公司。PrimeScript™ RT试剂盒和gDNA Eraser购自Takara。NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor序列合成由吉玛基因提供技术支持。MSH5抗体购自ThermoFisher Scientific。GAPDH、GSK3β、β-catenin、AXIN2一抗购自Abcam。Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒、胰蛋白酶、CCK-8试剂盒和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio。Hoechst33342试剂、Wnt通路抑制剂Triptonide以及Wnt通路激活剂HLY78购自MedChemExpress。荧光显微镜购自莱卡。离心机购自深圳瑞沃德。细胞培养箱购自Eppendorf。Bio-RAD蛋白成像系统购自上海艾研。
1.4 细胞培养
A172、U251、HS683、H4细胞分别接种于含10% FBS、1% P/SH的DMEM培养基。A1800细胞接种于含10% FBS的高糖DMEM培养基中。293T细胞培养在含10% FBS、1% Glutamax和1%双抗的DMEM培养基内。培养基置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中。
1.5 细胞转染和处理
取生长良好的A172细胞，经胰蛋白酶消化后接种于不含抗生素的培养基中。次日，根据Lipofectamine 2000脂质体转染试剂盒说明书，分别将NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor、sh-NC、sh-MSH5、sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor以及pcDNA-MSH5分别转染至A172细胞。待细胞培养48 h后，分别检测转染效率，成功转染的细胞用于后续实验。转染的pcDNA-MSH5的A172细胞再根据试剂说明分别用Triptonide和HLY78处理。
1.6 RT-qPCR实验
TRIzol试剂提取总RNA，并使用PrimeScript™ RT试剂盒和gDNA Eraser将1000 ng RNA逆转录为cDNA。使用SYBR® Premix Ex Taq™ II和Applied Biosystems 7500实时PCR系统进行实时聚合酶链式反应。2-ΔΔCt法计算目标基因的相对表达。U6作为miRNA的内参。引物序列见表1。
表 1 引物序列Table 1. Primer sequences目的基因 引物序列 （F：正向序列，R：反向序列，5′-3′） miR-149-5p F: CTCTGGCTCCGTGTCTTCAC R: CTGCCCCAGCACAGCC U6 F: TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC R: CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 1.7 CCK-8实验
CCK-8用于测定细胞活力。调整细胞密度，向96孔板的每孔中接种1000个A172细胞，每孔100 μL。培养板置于5% CO2细胞培养箱中培养。在培养的第0、24、48、72、96 h向每孔中添加10 μL CCK-8试剂，通过酶标仪测定细胞的光密度值。
1.8 Western blot实验
细胞在冰上含有蛋白酶抑制剂的RIPA溶液中裂解。BCA试剂盒检测蛋白质的浓度。将分离的蛋白质进行SDS-PAGE凝胶电泳，随后转移至PVDF膜上。将膜与一抗（MSH5：0.05 μg/mL；GAPDH：1∶2000；GSK3β：1∶2000；β-catenin：1∶4000；AXIN2：1 μg/mL）进行过夜孵育，再与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育2 h。经ECL化学发光底物曝光后用蛋白成像系统采集图像。Image J软件用于分析条带灰度值。
1.9 EDU实验
收集对数生长期的细胞培养在96孔板中，用100 μL含20 μmol/L EdU的培养基处理。在37 ℃、5% CO2环境中孵育2 h，用4%多聚甲醛分别固定各组细胞30 min，再置于含0.5% Triton-X-100的PBS溶液中孵育20 min。Hoechst33342溶液染细胞核。荧光显微镜观察染色结果并拍照记录。
1.10 Transwell检测迁移和侵袭
成功转染的细胞经胰蛋白酶消化后，收集细胞并计数。将4×104个细胞用100 μL无血清培养基悬浮制得细胞悬液并接种至Transwell小室上室，将含10% FBS的完全培养基加至小室下室。Transwell小室置于细胞培养箱中培养48 h。随后用4%多聚甲醛固定细胞0.1%结晶紫溶液染色。显微镜拍照并计数。侵袭实验接种细胞前在小室上室中加入稀释后的Matrigel基质胶，胶凝固后再接种细胞，其余步骤与迁移实验相同。
1.11 流式细胞术检测细胞周期
取生长良好的各组细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后，重悬于PBS中。然后在冰冷的70%乙醇中过夜固定。随后，1000 r/min条件下将细胞离心5 min，并重悬在50 μL RNase A中，于37 ℃下孵育30 min。将400 μL碘化丙啶（PI）细胞悬液中混匀，孵育30 min，通过流式细胞仪进行检测。
1.12 流式细胞术检测细胞凋亡率
采用双染法Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡率。将转染后的细胞接种至6孔板中，加入完全培养基培养24 h。收集细胞与Annexin V-FITC试剂在常温中避光孵育15 min，然后再与PI溶液避光孵育15 min。通过流式细胞仪测定细胞凋亡率。
1.13 双荧光素酶报告基因实验
经PCR扩增MSH5的3′-UTR（MSH5-WT）并插入p-GL3报告载体中，同时构建与miR-149-5p具有靶向结合位点的MSH5 3′-UTR突变序列（MSH5-MUT），并转入p-GL3报告载体。将NC mimic或miR-149-5p mimic分别与MSH5-WT或MSH5-MUT经Lipofectamine 2000共转染至293T细胞中。转染48 h后，通过双荧光素酶测定法分析荧光素酶活性。海肾荧光素酶活性作为内部参照。
1.14 统计学处理
每组实验均进行3次重复。GraphPad Prism8.0用于数据分析并作图。来自三个及以上独立重复实验的数据均表示为“均数±标准差”。非配对t检验用于分析2组间的差异。单因素方差分析用于分析多组间的差异，Tukey检验用于多组间的两两比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞中的表达
收集胶质瘤患者的肿瘤组织及其对应的癌旁组织，通过RT-qPCR检测显示，miR-149-5p肿瘤组织中的表达显著低于癌旁组织（图1A，P < 0.0001）。此外，miR-149-5p在人胶质瘤细胞系A172、U251、HS683、H4中的表达明显低于人正常星形胶质细胞HA1800（图1B，P < 0.0001）。由此，推测miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞系中的低表达与胶质瘤的发展密切相关。
图 1 miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞中的表达A：RT-qPCR检测胶质瘤组织中miR-149-5p的表达，与Para-cancer组相比，****P < 0.0001；B：RT-qPCR检测miR-149-5p在人正常星形胶质细胞阿和人胶质瘤细胞中的表达，与HA1800组相比，**P < 0.01，****P < 0.0001。Figure 1. miR-149-5p was downregulated in glioma tissues and cells2.2 miR-149-5p对A172细胞恶性生物学行为的影响
为进一步探索miR-149-5p对胶质瘤细胞的作用机制，分别在A172细胞中转染NC mimic、miR-149-5p mimic、NC inhibitor和miR-149-5p inhibitor。检测显示，转染miR-149-5pmimic明显增加miR-149-5p的表达，转染miR-149-5p inhibitor组中miR-149-5p表达降低。CCK-8、EDU、Transwell以及流式细胞术检测表明，过表达miR-149-5p明显抑制A172细胞的增殖（图2B、2C和2F，P < 0.01）、迁移（图2D和2G，P < 0.05）和侵袭（图2E和2H，P < 0.01），促进G1期细胞比例（图3A和3B，P < 0.01）以及凋亡率（图3C和3D，P < 0.01）。与NC inhibitor组相比，敲降miR-149-5p组中细胞的增殖活力（P < 0.05）、迁移（P < 0.05）和侵袭（P < 0.05）能力显著升高，G1期细胞比例（P < 0.05）以及凋亡水平（P < 0.05）降低。综上可知。过表达miR-149-5p可显著抑制A172细胞的增殖、转移和细胞周期，诱导细胞凋亡。敲降miR-149-5p可明显促进A172细胞的恶性生物学行为。
图 2 miR-149-5p对A172细胞恶性生物学行为的影响A：RT-qPCR检测miR-149-5p的表达；B：CCK-8检测细胞活力；C和F：EDU检测细胞增殖；D和G：Transwell检测细胞迁移能力；E和H：Transwell检测细胞侵袭能力；与NC mimic组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，****P < 0.000 1；与NC inhibitor组相比，#P < 0.05。Figure 2. Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells
图 3 miR-149-5p对A172细胞恶性生物学行为的影响A和B：流式细胞术检测细胞周期；C和D：流式细胞术检测细胞凋亡率；与NC mimic组相比，**P < 0.01；与NC inhibitor组相比，#P < 0.05。Figure 3. Effect of miR-149-5p on malignant biological behavior of A172 cells2.3 miR-149-5p靶向MSH5
通过starbase数据库预测发现，MSH5与miR-149-5p具有靶向结合序列，见图4A。双荧光素酶报告基因实验验证证实，过表达miR-149-5p可明显抑制MSH5野生型载体的荧光素酶活性见图4B，P < 0.05），而对MSH5突变型载体的荧光素酶活性无显著作用（P > 0.05。通过GEPIA数据库预测显示，MSH5在胶质瘤组织中表达降低（图4C，P < 0.01）。RT-qPCR发现，过表达miR-149-5p可抑制MSH5的蛋白表达（图4D，P < 0.01），而敲降miR-149-5p组A172细胞中MSH5表达显著增加（图4E，P < 0.01）。由此证实，miR-149-5p靶向负调控MSH5。
图 4 miR-149-5p靶向MSH5A：starbase数据库预测miR-149-5p和MSH5的结合序列；B：双荧光素酶报告基因实验验证miR-149-5p和MSH5的靶向关系，与NC mimic组相比，*P < 0.05；C：GEPIA数据库预测MSH5在胶质瘤组织中的表达，与Para-cancer组相比，**P < 0.01；D：Western blot检测MSH5的蛋白表达，与NC组相比，**P < 0.01。Figure 4. miR-149-5p targeted MSH52.4 miR-149-5p靶向MSH5调控A172细胞的恶性生物学行为
为进一步探索miR-149-5p调控MSH5对A172细胞恶性生物学行为的影响，分别在A172细胞中转染sh-NC、sh-MSH5和sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor。Western blot结果见图5A和5B，转染sh-MSH5组A172细胞中MSH5的蛋白表达低于sh-NC组（P < 0.001），转染sh-MSH5+miR-149-5pinhibitor组中MSH5的蛋白表达高于sh-MSH5转染组（P < 0.05）。通过CCK-8、EDU、Tranwell和流式细胞术检测表明，敲降MSH5可显著抑制A172细胞的增殖活力（图5C～5E，均P < 0.01）、迁移（图5F和5G，P < 0.01）和侵袭（图5H和5I，P < 0.05），促进G1期细胞比例（图6A和6B，P < 0.01）以及细胞凋亡率（图6C和6D，P < 0.001）。同时敲降miR-149-5p和MSH5组中细胞的增殖（P < 0.05）、迁移（P < 0.05）和侵袭（P < 0.05）能力高于敲降MSH5组，G1期细胞比例（P < 0.05）和凋亡（P < 0.05）水平低于仅敲降MSH5组。综上所述，敲降miR-149-5p靶向MSH5，可逆转敲降MSH5对A172细胞恶性生物学行为的抑制作用。
图 5 miR-149-5p靶向MSH5调控A172细胞的恶性生物学行为A和B：Western blot检测MSH5蛋白表达；C：CCK-8检测细胞活力；D和E：EDU实验检测细胞增殖；F和G：Tranwell实验检测细胞迁移能力；H和I：Tranwell实验检测细胞侵袭能力；与sh-NC组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与sh-MSH5组相比，#P < 0.05。Figure 5. miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells
图 6 miR-149-5p靶向MSH5调控A172细胞的恶性生物学行为A和B：流式细胞术检测细胞周期；C和D：流式细胞术检测细胞凋亡率；与sh-NC组相比，**P < 0.01，***P < 0.001；与sh-MSH5组相比，#P < 0.05。Figure 6. miR-149-5p targeted MSH5 to regulate the malignant biological behavior of A172 cells2.5 MSH5调控Wnt信号通路对A172细胞的作用
Wnt信号通路被报道在胶质瘤的发展进程中发挥着重要作用，因此，笔者进一步探讨miR-149-5p/MSH5分子轴是否通过Wnt信号通路而调控胶质瘤的进程。分别用Wnt通路抑制剂Triptonide以及Wnt通路激活剂HLY78处理转染pcDNA-MSH5的A172细胞。检测结果见图7A，与pcDNA-NC作用相比，pcDNA-MSH5组中MSH5（图7B，P < 0.001）、GSK3β表达降低（图7C，P < 0.001），β-catenin（图7D，P < 0.05）和AXIN2（图7E，P < 0.01）表达升高。与pcDNA-MSH5组相比，pcDNA-MSH5+Triptonide组中GSK3β表达升高（P < 0.001），β-catenin（P < 0.05）和AXIN2（P < 0.01）表达降低；而pcDNA-MSH5+HLY78组中GSK3β表达降低（P < 0.001），β-catenin（P < 0.05）和AXIN2（P < 0.05）表达升高。过表达MSH5且经Triptonide处理可显著下调过表达MSH5对A172细胞的增殖（图7F～7H，均P < 0.01）、迁移（图7I～7J，P < 0.01）和侵袭（图7K～7L，P < 0.01）的促进作用以及对A172细胞的G1期细胞比例（图8A～8B，P < 0.05）和凋亡水平（图8C～8D，P < 0.05）的抑制作用。过表达MSH5且经HLY78处理可显著上调过表达MSH5对A172细胞的增殖（均P < 0.05）、迁移（P < 0.05）和侵袭（P < 0.05）的促进作用以及对A172细胞的G1期细胞比例（P < 0.05）和凋亡水平（P < 0.05）的抑制作用。综上表明，过表达MSH5通过激活Wnt信号通路促进A172细胞的恶性表型。
图 7 MSH5调控Wnt信号通路对A172细胞的作用A：Western blot检测MSH5，B：GSK3β，C：β-catenin，D：和AXIN2，E：的蛋白表达；F：CCK-8检测细胞活力；G和H：EDU检测细胞增殖；I和J：Transwell检测细胞迁移能力；K和L：Transwell检测细胞迁移能力；与pcDNA-NC组相比，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001；与pcDNA-MSH5组相比，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。Figure 7. Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells
图 8 MSH5调控Wnt信号通路对A172细胞的作用A和B：流式细胞术检测细胞周期；C和D：流式细胞术检测细胞凋亡率；与pcDNA-NC组相比，*P < 0.05；与pcDNA-MSH5组相比，#P < 0.05。Figure 8. Effect of MSH5 regulating Wnt signaling pathway on A172 cells3. 讨论
胶质瘤占原发性脑肿瘤的80%，由于有空间占位效应，使患者的颅内压升高，可能导致患者呕吐、视力丧失或出现癫痫症状[6]。同时，胶质瘤具有较强的侵袭性，手术很难将病灶完全切除[7]。因此，越来越多的研究者开始研究靶向治疗，以期通过寻找有效的生物标志物为胶质瘤提供新的治疗方案。
miRNA在基因表达中具有重要的调控作用，据估计，约有三分之一的蛋白表达受miRNA的调控[8-9]。miR-149-5p被证实在多种肿瘤细胞中作为抑癌因子抑制肿瘤的进程。Li Q等[10]证明，在胃癌组织和细胞系中miR-149-5p低表达，过表达miR-149-5p显著抑制胃癌细胞的增殖和转移并诱导细胞凋亡。在乳腺癌细胞中，circ-0072995通过靶向下调miR-149-5p可促进乳腺癌细胞的恶性表型和无氧糖酵解[11]。miR-149-5p靶向下调RGS17，抑制前列腺癌细胞的活力、增殖和迁移[12]。在本研究中，笔者发现miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞系中表达降低，过表达miR-149-5p显著抑制胶质瘤A172细胞的增殖、迁移和侵袭，促进细胞G1期的比例并诱导细胞凋亡。而敲降miR-149-5p可促进A172细胞的增殖和转移，抑制G1期细胞比例以及细胞凋亡率。此外，miR-149-5p也被报道参与炎症及代谢类疾病的调控[13-15]。例如：miR-149-5p可抑制骨关节炎和类风湿性关节炎中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[15]。黄芪多糖通过上调miR-149-5p的表达，改善高糖和棕榈酸诱导的小鼠胰腺β细胞的增殖和胰岛素的分泌[13]。过表达miR-149-5p显著聚集尿酸诱导的干细胞中甘油三酯的积累[16]。
MutS同源物5（MutS Homolog 5，MSH5）是MutS蛋白家族的成员，与MSH4形成异二聚体复合物，参与DNA配错修复和减数分裂重组，在DNA双链断裂的同源重组修复过程中发挥重要作用[17]。研究发现，MSH4和MSH5中的遗传变异是男性不育的相关原因[18]。MSH5突变可损害DNA同源重组修复，可能导致非综合性原发性卵巢功能不全[19]。敲低lncRNA HCP5抑制YB1与MSH启动子在的结合，抑制MSH5的转录激活，进而抑制DNA双链断裂的修复过程，促进卵巢颗粒细胞的凋亡[20]。本研究中，笔者发现MSH5是miR-149-5p的靶基因，MSH5在胶质瘤组织和细胞中高表达，敲降miR-149-5p靶向上调MSH5促进A172细胞恶性表型。
糖原合成酶激酶3-β（glycogen Synthase Kinase 3-β，GSK3β）是GSK3的两种异构体之一，可通过介导Wnt/β-catenin信号通路参与调节糖原合成、蛋白质合成、细胞增殖、细胞分化以及免疫功能和炎症等过程[21-23]。本研究中，笔者证明，过表达MSH5通过抑制GSK3β，促进β-catenin和AXIN2表达，从而促进胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡。
综上所述，本研究发现miR-149-5p在胶质瘤组织和细胞系中低表达，敲降miR-149-5p通过靶向上调MSH5，抑制GSK3β，促进β-catenin和AXIN2通路蛋白表达，进而促进胶质瘤细胞的生长和转移，并抑制细胞凋亡。
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