NT-3-HUMSCs联合基因沉默SOCS3治疗SD大鼠脊髓损伤后的神经再生修复

白刚; 张洪钿; 赖军; 罗林; 左频; 范耀东

NT-3-HUMSCs联合基因沉默SOCS3治疗SD大鼠脊髓损伤后的神经再生修复

1. 昆明医科大学第三附属医院神经外科
2. 中国人民解放军陆军总医院神经外科
3. 重庆市人民医院神经外科

基金项目:

基金：云南省教育厅科学研究基金重点资助项目 (2014Z054);

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出版历程
- 收稿日期: 2017-08-20

Joint Therapy by NT-3-HUMSCs and SOCS3 Gene Dilencing in Nerve Regeneration Repair after Spinal Cord Injury in SD Rats

Funds:

基金：云南省教育厅科学研究基金重点资助项目 (2014Z054);

摘要

摘要: 目的 NT-3-HUMSCs联合基因沉默SOCS3治疗SD大鼠脊髓损伤, 以期促进损伤神经再生修复.方法 (1) 用贴壁法体外培养人脐带间充质细胞 (HUMSC) , 同时进行分离, 提纯和鉴定; (2) 构建NT-3基因真核表达载体, 利用基因转染技术将其转入HUMSC, 构建NT-3-HUMSC细胞, 体外检测其存活情况及NT-3表达情况; (3) 筛选作用于SOCS3的特异性靶点, 进行序列同源性分析, 设立阴性对照, 设计并合成SOCS3-siRNA, 同时在体外检测功能; (4) 建立SD大鼠脊髓损伤模型分为为:I.假手术组10只;Ⅱ.T12全脊髓横断损伤模型40只, 随机分为4组, 生理盐水治疗组10只;siRNA+NT-3-HUMSCs治疗组10只;NT-3-HUMSCs治疗组10只;SOCS3-siRNA治疗组10只.以上各组造模成功后, 分别存活12周进行神经电生理监测; (5) 对SD大鼠进行灌注固定和取材, 观察局部胶质疤痕降解情况和轴突再生情况, 同时运用生物素化葡聚糖 (BDA) 荧光顺行追踪取损伤移植区-宿主交界处头尾侧脊髓组织, 镜下观察皮质脊髓束再生的情况.结果 (1) siRNA+NT-3-HUMSCs治疗组较生理盐水治疗组横断脊髓空洞明显缩小, 差异有统计学意义 (P<0.05) ; (2) BDA顺行追踪结果表明siRNA+NT-3-HUMSCs治疗组较生理盐水治疗组神经轴突生长明显; (3) 神经电生理检测损伤12周后治疗组P40潜伏期较假手术组缩短, siRNA+NT-3-HUMSCs治疗组较生理盐水治疗组比较潜伏期缩短明显, 波幅升高明显, 差异有统计学意义 (P<0.05) .结论 NT-3-HUMSCs联合基因沉默SOCS3治疗SD大鼠脊髓损伤, 可以促进损伤神经再生修复.
- 脊髓损伤 /
- SOCS3 /
- siRNA /
- NT-3基因 /
- 基因转染
Abstract: Objective To investigate the effect of joint therapy by NT-3-HUMSCs and SOCS3 gene silencing in promoting the injury nerve regeneration repair after spinal cord injury in SD rats. Methods (1) Adherence method was used to culture human umbilical cord-derived mesenchymal cells (HUMSC) in vitro for separation, purification and identification. (2) We constructed NT-3 gene eukaryotic expression vector, and used gene transfection technology into its HUMSC, and tested the survival of NT-3-HUMSC cells and NT-3 expression in cells. (3) We screened specific targets of SOCS3, made sequence homology analysis, and set a negative control, designed and synthesized siRNA and detected the function. (4) SD rats model of spinal cordinjury were established and divided into: 1. sham group 10; 2.T12 whole spinal cord injury model 40, were randomly divided into four groups, respectively; saline treatment group 10; siRNA + NT-3-HUMSCs treatment group 10; NT-3-HUMSCs treatment group 10; siRNA treated group 10. After each group above modeling success, they received respectively the neural electrophysiological monitoring for 12 weeks survival. (5) We perfused SD rats for fixation and collect samples, and observed the local glial scar degradation situation and axon regeneration, meanwhile, used biotin glucan fluorescent (BDA) anterograde tracing. The injury transplant area-host junction spinal cord tissues were collected to observe the corticospinal tract regeneration under microscope. Results (1) In siRNA + NT-3-HUMSCs treatment group, the transection syringomyelia was significantly reduced as compared with normal saline group (P < 0.05) . (2) BDA anterograde tracing results showed that in the siRNA + NT-3-HUMSCs treatment group, neural axon grew significantly compared with the normal saline group. (3) Neural electrophysiological testing 12 weeks after injury: in the treatment group, the incubation period P40 was shorter as compared with control group; in siRNA + NT-3-HUMSCs treatment group, the incubation period was shorter obviously than normal saline, but the amplitude increased obviously (P < 0.05) . Conclusion NT-3-HUMSCs joint with SOCS3 gene silencing can promote the injury nerve regeneration repair in the treatment of SD rat spinal cord injury.
- Spinal cord injury /
- SOCS3 /
- siRNA /
- NT-3 gene /
- Gene transfection

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部分胸痛患者冠状动脉造影检查显示冠状动脉无明显狭窄或接近正常，但造影剂充盈缓慢、排空速度明显延迟，这种现象被称为冠状动脉慢血流现象（coronary slow flow phenomenon，CSFP）^[1]。CSFP患者有发生心肌缺血的风险，甚至可能进展为急性冠脉综合征导致碎死。CSFP的发病机制尚不明确，目前主要包括：冠状动脉微循环障碍、炎症反应、血管内皮功能紊乱、血小板功能及形态异常以及基因变异等^[2-3]。另外，Cin等^[3]利用血管内超声（intravenous ultrasound，IVUS）观察CSFP患者的冠状动脉，发现其已经存在不同程度的弥漫性内膜增厚、管壁钙化现象，故认为CSFP是冠状动脉粥样硬化的早期表现。临床上常常采用心肌梗死溶栓试验（thrombolysis in myocardial infarction，TIMI）血流帧数评估冠状动脉血流速度^[4]，具有较好的客观性和准确性。

瘦素（leptin，LEP）主要由脂肪细胞分泌，作用于中枢神经系统，从而控制食物摄入、引起能量消耗，对机体的能量代谢调节起着重要作用^[5]。研究发现，瘦素可通过胰岛素抵抗、介导内皮功能障碍、参与炎症反应、促进血小板聚集等途径参与到冠心病的发生发展中^[6-7]。瘦素由人类染色体7q31.3上的瘦素基因所表达，包含三个外显子，长度约20 kb。其中，LEP rs7799039 G/A位于瘦素基因启动子位置上，其基因位点的变异可能在转录水平上影响瘦素的表达。瘦素受体（leptin receptor，LEPR）由瘦素受体基因的所表达。瘦素受体基因位于人类染色体1p31上，包括20个外显子、19个内含子，长度 > 70 kb^[8]。1997年，Mastuoka等^[9]对LEPR基因20个外显子应用PCR技术进行测序分析，发现了存在7种核苷酸变异。其中，LEPR基因rs1137101、rs1137100与冠心病及其相关危险因素密切相关^[10-11]。

目前关于LEP及LEPR基因多态性与CSFP的相关研究尚未报道。本课题通过比较CSFP组与正常冠状动脉血流（normal coronary flow，NCF）组的血清LEP及LEPR水平，检测LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs113710基因及基因型频率，一方面，探究LEP及LEPR基因多态性与CSFP之间的相关性，另一方面，探寻影响CSFP的相关危险因素，为其防治探寻新途径。

1. 资料与方法

1.1 研究对象

收集于2018年09月至2019年11月因胸痛入住昆明医科大学第二附属医院心内科患者100例，记录临床资料、冠脉造影结果，并计算校正的TIMI帧数（TFC）。将研究对象分为CSFP组54例，NCF组46例。CSFP组入组标准：（1）冠脉造影示冠状动脉正常^[12]或狭窄程度 < 40%^[13]；（2）在30帧/s图像采集速度下，记录冠状动脉TIMI帧数，以造影剂进入某支冠状动脉记作为第一帧，到达远端终点分支作为最后一帧。因左前降支（LAD）的解剖长度明显长于左回旋支（LCX）、右冠状动脉（RCA），所以将记录到的LAD的TIMI帧数除以1.7，得到校正的TIMI帧数。将LAD、LCX和RCA的TIMI帧数相加后除以3，记录平均冠脉TIMI帧数（Mean TFC）。当Mean TFC > 27时诊断为CSFP。NCF组入组标准：（1）冠脉造影示冠状动脉正常或狭窄程度 < 40%；（2）Mean TFC ≤ 27时诊断为NCF组^[1]。排除标准：冠状动脉支架植入术后、冠状动脉狭窄程度 ≥ 40%、冠状动脉无复流现象、冠状动脉瘤样扩张、冠状动脉痉挛、快速或缓慢型心律失常导致冠状动脉血流改变、心肌病、心瓣膜病、慢性消耗性疾病等。

1.2 临床资料收集

记录入组患者性别、年龄、身高、体重、体重指数（BMI）、糖尿病病史、高血压病史、吸烟史等临床资料，测定空腹血糖（FBG）、空腹胰岛素水平（FINS）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）等指标。采用稳态模型抵抗指数（homeostasis model insulin resistance index，HOMA-IR）评估胰岛素抵抗情况，HOMA-IR = FINS*FBG/22.5^[14]。

1.3 ELISA实验

入院后第2天抽取空腹静脉血4 mL于促凝管中，4℃条件下离心（3000 r/min，15 min），提取血清。按照说明书，采用ELISA检测LEP、LEPR的浓度。分别于96孔ELISA板中加入标准品与待测样品，样本中的LEP或LEPR与载体上固有的LEP或LEPR抗体结合，洗涤后加入LEP或LEPR二抗，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶标记检测抗体，加入TMB底物显色反应，用酶标仪测定吸光度，绘制标准品线性回归曲线，计算得出LEP、LEPR的浓度。

1.4 SNaPShot检测瘦素、瘦素受体基因类型及分布频率

抽取2 mL全血，使用全血基因组DNA提取试剂盒提取DNA。采用PCR法将DNA进行扩增，引物序列（由昆明擎科生物技术有限公司设计合成）如下：瘦素基因rs7799039（上游引物5′-AGCCAAGGCAAAATTGAGGA-3′，下游引物3′-AAGAGATTAAAGCAAAGACAGGCA-5′）；瘦素受体基因rs1137100（上游引物5′-TGCCTGCTGGACTCTCAAAG-3′，下游引物3′-AGCTAATGCTTACCTATTTGTTGAA-5′）；瘦素受体基因rs1137101（上游引物5′-GGTT CCCCAAAAAGGCAGTT-3′，下游引物3′-CCCCCAGTACTACATCTACCATC -5′）。扩增后采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。将PCR产物纯化后，采用单碱基延伸引物序列进行SNP单链正向延伸，引物序列如下：rs7799039（TTTTTTTTTTTTTTTTTGTTTTGCGACAGGGTTGC）；rs1137101（TTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTCATCTGGTGGAGTAATTTTCC）；rs1137100（TTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGCAGACAACA TTGAAG GAA）。将扩增产物放入ABI 3730XL测序仪进行测序。随机选取一个样本的SNP-PCR扩增产物，进行Sanger法测序检验，证实与SNaPShot结果一致。所有位点用Genemapper 4.0软件对ABI 3730XL测序结果进行分析。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0进行统计学分析。计量资料服从正态分布采用均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，组间差异采用t检验；非正态分布资料采用M（P25, P75）描述，组间比较使用Mann-Whitney U秩和检验。计数资料使用百分率表示，组间比较使用χ²检验。对于基因检测，首先运用Hardy-Weinberg平衡检验分别验证两组研究对象的群体代表性，通过计算得出基因及基因型频率，并应用χ²检验比较组间差异。采用Logistic回归分析影响CSFP的危险因素。P < 0.05表示差异具有统计学意义。

2. 结果

2.1 两组间临床指标的比较

比较CSFP组与NCF组的基本临床资料，两组在年龄、体重指数、HDL、LDL、TG、TC、高血压病史、糖尿病病史、吸烟史等方面差异均无统计学意义（P > 0.05）。但是与NCF组受试者相比，CSFP患者中男性比例较多，且有着较高的血清瘦素（LEP）水平、胰岛素抵抗指数（HOMA-IR），P < 0.05，见表1。

表 1 两组受试者临床指标比较 [$\bar x \pm s$/n（%）/M（P25，P75）]

Table 1. Comparison of clinical indexes between the two groups [$\bar x \pm s $/n（%）/M（P25，P75）]

组别	CSFP组（n = 54）	NCF组（n = 46）	t/χ²	P
男性	36（66.7）	21（45.7）	4.476	0.034^*
年龄（岁）	59.93 ± 10.70	60.13 ± 9.64	−0.100	0.921
吸烟史	27（50.0）	16（34.8）	2.347	0.126
高血压病史	34（63.0）	33（71.7）	0.865	0.352
糖尿病史	10（18.5）	7（15.2）	0.192	0.661
BMI（kg/m²）	24.83 ± 3.40	24.24 ± 3.23	0.870	0.386
TC（mmol/L）	4.46 ± 0.82	4.33 ± 1.17	0.633	0.529
TG（mmol/L）	1.75（0.69～6.02）	1.59（0.51～5.43）	−1.477	0.140
HDL-C（mmol/L）	1.19 ± 0.27	1.23 ± 0.24	−0.780	0.437
LDL-C（mmol/L）	2.75 ± 0.64	2.65 ± 0.93	0.639	0.525
PLT（×10⁹/L）	212.37 ± 53.05	221.41 ± 50.48	−0.869	0.387
MPV（fL）	10.92 ± 1.13	11.03 ± 1.22	−0.457	0.649
FBG（mmol/L）	5.28（3.42～11.10）	5.10（4.12～10.69）	−0.858	0.391
FINS（uIU/mL）	19.60（4.33～210.09）	15.90（2.67～57.26）	−1.646	0.100
HOMA-IR	4.53（0.66～56.02）	2.98（0.88～15.63）	−1.667	0.046^*
LEP（ng/mL）	2.59（0.54～12.21）	1.00（0.56～11.51）	−3.614	< 0.001
LEPR（ng/mL）	3.05（1.29～27.29）	2.78（0.95～26.42）	−1.069	0.285
注：^*P < 0.05。

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2.2 两组间TIMI帧数[M（P25,P75）]的比较

根据冠脉造影，采用TIMI帧数评价患者冠状动脉血流速度，包括左前降支（LAD），左回旋支（LCX），右冠状动脉（RCA）。比较CSFP组与NCF组的TIMI帧数，结果发现CSFP组的LAD（校正后）-TFC、LCX-TFC、RCA-TFC及平均TFC均高于NCF组（P < 0.05），说明CSFP组冠状动脉血流速度慢，见表2。

表 2 两组受试者TIMI帧数比较 [M（P25，P75）]

Table 2. Comparison of TFC between the two groups [M（P25，P75）]

项目	CSFP组（n = 54）	NCF组（n = 46）	Z	P
LAD（校正后）-TFC	38.31（37.47，40.78）	31.01（29.67，33.18）	−2.323	0.020^*
LCX-TFC	26.67（24.83，28.39）	19.31（17.20，20.98）	−2.309	0.021^*
RCA-TFC	26.11（23.89，27.66）	19.10（15.23，21.24）	−2.337	0.019^*
Mean TFC	30.52（29.65，31.27）	22.95（21.53，24.67）	−2.627	0.009^#
注：^*P < 0.05, ^#P < 0.01。

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2.3 两组患者基因及基因型分布频率比较

LEPR rs1137100位点及LEPR rs1137101位点，G为野生型，A为突变型；LEP rs7799039位点，A为野生型，G为突变型。LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101在CSFP组和NCF组之间的基因型分布频率均符合Hardy-Weinberg平衡，证明研究对象具有群体代表性（P > 0.05）。进一步对三个SNP位点基因及基因型分布频率进行分析、比较，结果显示，在CSFP组和NCF组患者中，LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101基因及基因型分布频率无明显统计学差异（P > 0.05），见表3。

表 3 两组之间基因及基因型分布频率比较

Table 3. Comparison of gene and genotype distribution frequency between the two groups

基因型	CSFP组		NCF组		χ²	P	Hardy-Weinberg检验^（1）
基因型	频数	频率（%）	频数	频率（%）	χ²	P	Hardy-Weinberg检验^（1）
rs1137100
GG	37	68.5	32	69.6	0.721	0.739	0.89/0.82
GA	16	29.6	12	26.1
AA	1	1.9	2	4.3
G等位基因	90	83.3	76	82.6	0.018	0.892
A等位基因	18	16.7	16	17.4	0.018	0.892
rs1137101
GG	34	63.0	32	69.6	0.749	0.773	0.98/0.82
GA	18	33.3	12	26.1
AA	2	3.7	2	4.3
G等位基因	86	79.6	76	82.6	0.286	0.592
A等位基因	22	20.4	16	17.4	0.286	0.592
rs7799039
GG	2	3.7	2	4.3	2.173	0.343	0.68/0.99
GA	12	22.2	16	34.8
AA	40	74.1	28	60.9
G等位基因	16	14.8	20	21.7	1.614	0.204
A等位基因	92	85.2	72	78.3	1.614	0.204
注：（1）分别显示CSFP组/NCF组基因型Hardy-Weinberg平衡检测的P值。

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2.4 冠状动脉慢血流的危险因素分析

将年龄、性别、吸烟史、高血压史、糖尿病史、LEP、LEPR、FBG、FINS、HOMA-IR、BMI、PLT、MPV、血脂等指标进行Logistic逐步回归分析，见表4，最终得到的模型为：LEP、HOMA-IR对应的OR值 > 1，提示LEP、HOMA-IR为影响冠状动脉慢血流的相关危险因素。

表 4 影响冠状动脉慢血流的二元Logistic回归分析

Table 4. Binary logistic regression analysis of coronary slow flow

变量	回归系数	标准误	Wald-χ²	P	OR	95%CI
HOMA-IR	0.092	0.048	3.595	0.038	1.096	1.005-1.205
LEP	0.241	0.110	4.800	0.028	1.273	1.026-1.579

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3. 讨论

国内外研究者近来试图从分子生物学角度探寻CSFP的危险因素。X Cai等^[15]发现GW26-e3963白细胞介素-10启动子多态性与CSFP的发生有关。瘦素及瘦素受体基因在心血管疾病的发生发展中起到一定作用，可作为心血管疾病发生的一个重要遗传学标志。本研究拟探索CSFP的危险因素并探讨瘦素及瘦素受体基因多态性与CSFP的相关性。

首先，笔者探索影响CSFP发生的危险因素。通过测定CSFP组与NCF组的血清瘦素、瘦素受体、胰岛素抵抗指数以及比较两组间相关临床资料，结果显示，CSFP组瘦素浓度、胰岛素抵抗指数显著高于NCF组，logistic回归分析证实瘦素、胰岛素抵抗是CSFP的危险因素。既往研究发现，血清瘦素水平的升高能够导致血管内皮收缩因子内皮素-1（endothelin-1,ET-1）与血管内皮舒张因子一氧化氮（nitric oxide,NO）失衡，从而降低冠状动脉舒张功能，增加微血管阻力^[2]。同时，血清瘦素水平的升高可以诱导CRP、TNF-α、IL-6等炎症因子的表达，增加氧化应激，刺激血管平滑肌细胞增殖、迁移，促进动脉粥样硬化的发展^[16]。另外，瘦素与胰岛素抵抗之间也存在一定联系，在对肥胖个体的研究中发现，大脑对瘦素敏感性的削弱会造成甘油三酯过多堆积，引起胰岛素敏感性降低，进而又可以促进胰岛素抵抗的发生^[7]。在瘦素抵抗、胰岛素抵抗的情况下，心肌细胞发生糖类、脂肪等物质代谢紊乱，产生活性氧自由基、炎症介质，从而加剧了血管内皮的损伤^[6]。既往研究表明^[2]，由于雌激素对心血管内皮细胞具有一定保护作用和抗动脉粥样硬化作用，故男性患者在CSFP发生中居多。另外，吸烟会导致血管舒缩功能障碍，诱发微血管痉挛，导致冠状动脉血流速度减慢，也被认为是CSFP的另一危险因素。国内研究发现^[17]，高血压是影响CSFP患者发展为主要心血管不良事件的独立危险因素。本研究显示CSFP组以男性比例较多，但logistic回归未证实性别为CSFP的危险因素，此外，吸烟、高血压与CSFP无相关性，与既往研究不一致，可能是因为样本量过小导致。

其次，笔者探讨瘦素及瘦素受体基因多态性与CSFP之间的相关性。本研究采用了SNaPShot技术对3个SNP位点进行检测，与一代测序技术和限制性内切酶法相比，具有精准度高、检测速度快、通量高的特点。通过研究显示，LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101位点GG、GA、AA基因型以及G、A等位基因在CSFP组与NCF组之间分布频率相似，logistic回归分析显示，CSFP在3个SNP位点各基因型之间发病风险相似，说明瘦素及瘦素受体基因多态性与CSFP无相关性。其原因可能为：CSFP作为一种冠脉微循环障碍疾病，其病理机制复杂，虽然目前已经发现eNOS、白细胞介素、血管紧张素转化酶等多个基因异常表达与CSFP存在相关性^[18]，但对基因多态性的研究结论有所不同，原因可能为基因多态性在不同种族、地域中表现形式不同。同时，研究样本量的差异也会导致结论具有争议。因此，仍需对CSFP基因多态性的大样本研究，必要时进一步作全基因组联合研究，以寻找CSFP的生物遗传学标志。

综述所述，本研究发现瘦素、胰岛素抵抗是CSFP的危险因素。此外，LEP rs7799039、LEPR rs1137100、LEPR rs1137101多态性与CSFP无相关性，有待于更大样本量或meta分析进一步来阐明瘦素及瘦素受体基因与CSFP的相关性，为CSFP的预防、诊疗提供新思路。

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期刊类型引用(17)

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1. 资料与方法
1.1 研究对象
1.2 临床资料收集
1.3 ELISA实验
1.4 SNaPShot检测瘦素、瘦素受体基因类型及分布频率
1.5 统计学处理
2. 结果
2.1 两组间临床指标的比较
2.2 两组间TIMI帧数[M（P25,P75）]的比较
2.3 两组患者基因及基因型分布频率比较
2.4 冠状动脉慢血流的危险因素分析
3. 讨论

1. 资料与方法
1.1 研究对象
1.2 临床资料收集
1.3 ELISA实验
1.4 SNaPShot检测瘦素、瘦素受体基因类型及分布频率
1.5 统计学处理
2. 结果
2.1 两组间临床指标的比较
2.2 两组间TIMI帧数[M（P25,P75）]的比较
2.3 两组患者基因及基因型分布频率比较
2.4 冠状动脉慢血流的危险因素分析
3. 讨论

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[1]	周磊, 吕雯雯, 段永忠, 钱雯, 程继帅. 靶向抗HSV-1的siRNA研究进展, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20240901
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[3]	王福科, 张红, 杨桂然, 肖渝, 何川, 宋恩, 李彦林. 携载增强型绿色荧光蛋白基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞示踪方法, 昆明医科大学学报.
[4]	李勤学, 李传静, 王锋. 慢病毒介导siRNA沉默MMP-3对大鼠创伤性骨性关节炎模型软骨退变的影响, 昆明医科大学学报.
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[12]	陈绍春. 用慢病毒转染技术实现Gnaq基因在SH-SY5Y细胞中持续稳定高表, 昆明医科大学学报.
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[20]	朱兴宝. ORMA40载体介导生存素基因转染嗅神经鞘细胞, 昆明医科大学学报.

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