接种疫苗被认为是世界范围内预防感染最经济的措施。一种有效的佐剂对于提高疫苗接种效率是非常必要的。脂质体是磷脂双分子层包裹水相而构成的类球状微囊，按电荷性质可分为中性脂质体、阴离子脂质体和阳离子脂质体^[1]。其中阳离子脂质体比阴离子和中性脂质体更有效，可延长在注射部位抗原的停留时间，增加抗原提呈，并诱导更强的免疫反应^[2-4]。

DC-Chol（3β-[N-（N′ ，N′ -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]）是胆固醇衍生物，含有一个叔胺基团。DC-Chol毒性相对较小^[5]，通常与脂质二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE）结合使用^[6-7]。胆固醇是经典脂质体配方的主要成分，被阳离子衍生物（DC-Chol）取代，形成PLUSCOM^[8]，可有效吸附抗原^[9-10]。ISCOMs作为佐剂，以多种方式增强免疫反应，通过抗原提呈细胞对微粒优先摄取，PLUSCOM在诱导抗原特异性CD8 T细胞反应方面与经典ISCOMs一样有效^[11]。

本研究以四价流感病毒裂解疫苗原液作为模型药物，探讨DC-Chol修饰脂质体作为载体对该疫苗的免疫增强效果。研究中选择市售疫苗原液和PBS作为对照组，比较DC-Chol脂质体作为疫苗佐剂的免疫增强效果。同时还对DC-Chol脂质体中DC-Chol用量与免疫原性的量效关系进行了初步研究，为阳离子脂质体佐剂的开发奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   材料

1.1.1   流感疫苗

均由江苏沃森生物技术有限公司提供。H1N1批号SA2018002，H3N2批号SB2018002，B（V）批号SC2018001，B（Y）批号SC22018006。

1.1.2   实验动物

SPF级昆明种小鼠，雌性，6～8周龄，体重18～22 g，由昆明医科大学实验动物中心提供[合格证号为SCXK9（滇）2005-0008]。

1.1.3   主要试剂

大豆卵磷脂（北京美亚斯磷脂技术公司）；胆固醇（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）；DC-Cholesterol（Avanti Polar Lipids，USA）；MTT（北京博奥拓达科技有限公司）；Anti-mouse CD4 PE、Anti-mouse CD8a FITC（eBioscience，USA）。

1.2   方法

1.2.1   DC-Chol脂质体的制备

采用薄膜分散法和冻融-冻干法^[12]。将胆固醇（80 mg）和大豆磷脂（300 mg）溶于无水乙醇，减压旋转成膜；在水化的脂质体混悬液中加入DC-Chol水浴静置，加入一定量流感疫苗原液，制备脂质体冻干粉。

1.2.2   DC-Chol脂质体包封率检测

高速离心取上清液，通过Lowry蛋白法^[12]计算包封率。

1.2.3   DC-Chol脂质体量效关系研究

小鼠随机分为七组，每组3只，不同剂量DC-Chol脂质体组（250、500、750、900 μg/只）、PBS组、疫苗原液组、中性脂质体组，抗原剂量为6 μg/只。腹腔免疫后第7天处死，通过MTT法^[13]测定刺激指数（SI）确定最佳DC-Chol剂量。

1.2.4   DC-Chol脂质体细胞免疫原性研究

在方法1.2.3确定最佳用量的基础上制备脂质体进行免疫实验。小鼠随机分为PBS组、疫苗原液组、中性脂质体组、DC-Chol 脂质体组,每组9只，腹腔免疫，于第7天、14天、28天处死，MTT方法检测各组SI值，流式细胞术检测T淋巴细胞表面标记。

1.3   统计学处理

采用SPSS17.0软件进行统计分析，多组间比较通过单因素方差分析，以P < 0.05 为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   DC-Chol 脂质体包封率结果

蛋白含量测定的标准曲线为Y = 0.0032X - 0.0009，相关系数R² = 0.9984，在10～100 μg/mL 范围内有良好线性关系。DC-Chol流感疫苗脂质体包封率结果，见表1。

表  1  不同含量的DC-Chol阳离子脂质体的包封率

Table  1.  Encapsulation efficiency of DC-Chol cationic liposomes with different contents

DC-Chol含量（µg/鼠）	包封率（%）
250	59.17
500	70.44
750	68.78
900	68.78

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2.2   DC-Chol 脂质体量效关系研究

检测结果显示，与PBS组、疫苗原液组相比较，剂量分别为250、500、750、900 μg的DC-Chol组差异有统计学意义（P < 0.05），表明DC-Chol脂质体有较好的免疫原性，见图1；500、750、900 μg组三个剂量组间比较差异无统计学意义（P > 0.05），选择500 µg/鼠为DC-Chol修饰脂质体疫苗的最佳用量。

图  1  不同剂量DC-Chol 7 d时的SI

与PBS比较，^*P < 0.05；与原液比较，^#P < 0.05。

Figure  1.  SI of different doses of DC-Chol on 7 d

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2.3   DC-Chol 修饰流感疫苗脂质体细胞免疫原性研究

2.3.1   脾淋巴细胞增殖实验

DC-Chol脂质体组与中性脂质体组、疫苗原液组、PBS组比较差异有统计学意义（P < 0.05）,且SI值高于各组，说明DC-Chol阳离子脂质体能有效刺激脾淋巴细胞增殖，产生较早较强的免疫原性，增强细胞免疫，见图2。DC-Chol脂质体组7 d时刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的强度最大，诱导细胞免疫的水平最高，但其14～28 d SI值稍有上升，说明抗原刺激机体时产生的抗体不会一直存在于机体中，部分会通过以代谢或排泄的方式排出体外，但仍然有细胞免疫原性的存在即记忆细胞。

图  2  一个免疫周期的SI

与PBS比较，^*P < 0.05；与原液比较，^#P < 0.05。

Figure  2.  SI of an immune cycle

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2.3.2   T淋巴细胞表面标记实验

由图3可知，DC-Chol脂质体组与中性脂质体组、疫苗原液组、PBS组比较差异有统计学意义（P < 0.05）,说明DC-Chol阳离子脂质体可增强细胞免疫；免疫相同周期时，DC-Chol组28 d与14 d的CD4⁺/CD8⁺值进行比较差异有统计学意义（P < 0.05）,随着时间的延长，DC-Chol修饰的脂质体疫苗对脾淋巴细胞的刺激强度增加，有延长免疫时间的作用。

图  3  14 d、28 d时 CD4⁺/CD8⁺比值

与PBS比较，^*P < 0.05；与原液比较，^#P < 0.05。

Figure  3.  CD4⁺/CD8⁺ on 4 d 28 d

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3.   讨论

阳离子脂质体已成为新一代的疫苗佐剂和给药系统。Yifan Ma^[14]通过制备不同表面电荷密度的阳离子脂质体，作用于C57小鼠，采用 ELISA方法和流式细胞术发现阳离子脂质体能诱导更强的免疫反应，证实了阳离子脂质体的免疫调节作用主要是由于其表面电荷密度，而不是阳离子脂质体的浓度。Brunel等^[15]将DC-Chol用于乙型肝炎疫苗，结果表明DC-Chol具有免疫调节作用，能诱导BALB/c小鼠的Th1和Th2型免疫反应。Rui等^[16]开发了一种由肺炎球菌表面蛋白a和阳离子DC-Chol脂质体组成的肺炎球菌鼻腔疫苗，用小鼠肺炎链球菌感染模型验证了该疫苗的有效性。DC-Chol脂质体能同时诱导体液免疫和细胞免疫，诱导产生IgGl和IgG2a；DC-Chol脂质体还能诱导粘膜免疫^[17-18]。阳离子脂质体能够运载不同种类的药物或作为疫苗载体，且到目前人们仍然不断开发其应用潜力。阳离子脂质体的毒性在一定程度上限制了它的应用，未来需要更加深入研究其结构和作用机制，设计出更加低毒高效的阳离子。

本实验中制备的DC-Chol脂质体疫苗包封率均在50% 以上。选择PBS、市售流感疫苗原液以及中性脂质体作为对照组，在一个免疫周期内DC-Chol脂质体的SI值始终高于其他组，提示 DC-Chol流感疫苗脂质体冻干粉在体内可产生细胞免疫，延长免疫时间，具有明显的佐剂效果。该实验为今后研究DC-Chol脂质体佐剂提供了初步参考，未来还需对其作用机制和安全性方面深入研究。