心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）是治疗缺血性心脏病的主要障碍^[1-3]，其最主要机制为I/R（ischemia-reperfusion）过程中局部及全身的炎症反应^[4]。IL-6是心肌缺血再灌注损伤时释放的关键因子^[5]。心肌I/R后患者血浆中IL-6水平显著升高^[6-7]，而循环中的高IL-6与心肌损伤、心力衰竭和死亡率相关^[8]。低功率聚焦超声辐照靶向微泡，能使IL-6单克隆抗体定点释放，不仅完成了I/R心肌的无创评价^[9]，同时也减轻了局部炎症反应。通过设置实验参数，超声靶向微泡破坏技术（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）不仅能够提升细胞膜通透性，且不会引起细胞的不可逆损伤^[10]。本实验通过携IL-6单克隆抗体联合不同辐照强度的UTMD技术治疗MI/RI，为以后MI/RI超声靶向治疗应用于临床提供理论依据。

1.   资料与方法

1.1   动物模型的制备

健康成年日本大耳兔90只购自昆明医科大学动物实验中心，平均体重为2 000～2 500 g，动物许可证为SCXK（滇）2011-0004，随机将其分为三组：A组（15只）关胸对照组、B组（15只）开胸对照组，A、B两组再分为U₀、U₁、U₂三组，每组5只兔，C组（60只）缺血/再灌注组，分成T1～T4时段（T1～T4再灌注时间分别为30 min、60 min、120 min、180 min，将各时段分为U₀、U₁、U₂组，每组5只兔）。A组无需任何处置，B组开胸后相同部位仅穿线不阻断，C组通过自制套管将冠状动脉左前降支（LAD）阻断30 min，解除梗阻，分别给予再灌注30 min、60 min、120 min、180 min制备MI/RI损伤动物模型。其中各U₀组均未经超声辐照，U₁组、U₂组分别选择0.5 w/cm²及0.75 w/cm²强度超声辐照。动态监测各组心电图情况，监测时间点为术前、缺血30 min、再灌注30 min、60 min、120 min、180 min，心肌缺血的改变为心电图上ST段畸变，弓背朝上抬高幅度大于0.5 mV。

1.2   靶向声学造影剂的制备

1.2.1   Biotin（抗体生物素）标记

根据Thermo操作说明书，依照比例（抗体∶Biotin = 1∶15）取13.5 μL Biotin添加至Anti-IL-6抗体液体内，置于避光环境下反应1 h；完成反应后，将以上液体于4 ℃、pH = 7.4 PBS溶液透析过夜；24 h后换液，约6 h后收样品，保存至−20 ℃避光环境下。

1.2.2   抗体和微泡耦联

微量取样枪把500 μg标记有生物素的IL-6抗体添加至1 mL Targestar SA微泡内，常温下进行20～30 min的孵育，连续摇动至冻干粉末彻底分散产生白色乳状、均匀的微泡混悬液，即得到IL-6靶向超声微泡。

1.3   超声靶向微泡破坏技术

兔取左侧卧位，呼吸平缓后，于胸骨左缘放置探头，选择Philips EPIQ75，S5-1探头，频率1.8/3.6 MHz。每组兔行常规超声心动图后，由兔耳缘静脉给予靶向微泡造影剂（剂量为0.05 mL/kg），完成各心肌节段显影并储存图像，待微泡稳定附着于梗死部位心肌组织后，低功率聚焦超声仪对A、B、C3组中的U₁组进行强度为0.5 w/cm²的超声辐照，U₂组进行0.75 w/cm²的超声辐照（频率均为1 MHz），辐照5 min。取得3组兔各U₁、U₂组辐照前、后的动态图像后处死实验兔获取心肌组织。图像经QLAB10.5软件分析，以左室乳头肌短轴水平前壁作为关键分析节段，获得对应的心肌视频强度，得到视频强度差值（video intensity difference，VID）。

1.4   酶联免疫吸附（ELISA）实验

取局部心肌组织（各组心肌组织均取结扎位线下5～10 mm，约2 mm厚），将其捣碎后，依照100 mg/mL DH.Z.混合物（内含细胞裂解液、蛋白酶抑制剂）置于4 ℃温度下处理一整夜，在20 000 r/min环境下离心20 min，将上清保存至−80 ℃冰箱内，之后对不同组别兔心肌组织内的IL-6含量进行检测，测得超声辐照前、后心肌组织中IL-6的水平。

1.5   统计学处理

统计分析使用SPSS软件，数值用均数±标准差（$\bar x$±s）表示。两种处理方式作用于同一样本选择配对t检验，同一处理方式作用于两组样本时选择两独立样本t检验，三组间数据的统计分析使用单因素方差分析；P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   模型制备情况

90只兔，B组死亡2只，其中1只死亡可能与麻药注射速度较快相关，另1只可能和不正当的手术操作相关。C组4只手术失败，分别为胸膜破裂死亡2只、阻断冠脉30 min后死亡2只，原因可能为诱发室颤。心电图结果显示：套管夹闭LAD后，ST段迅速抬高，再灌注30 min时ST段未降低，45 min时ST段下降，60 min时降到等电位线附近，120 min及180 min时ST段降到等电位线，见图1。

图  1  各组兔心电图表现

a：正常心电图；b：B组心电图；c：C组术中心电图；d：心梗30 min时心电图；e；再灌注30 min时心电图；f：再灌注45 min时心电图；g：再灌注60 min时心电图；h：再灌注120 min时心电图；r：再灌注180 min时心电图。

Figure  1.  Electrocardiogram of rabbits in each group

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2.2   靶向声学造影剂的制备结果

免疫荧光染色、玻片凝集实验结果显示IL-6单克隆抗体已顺利偶联至Targestar SA微泡表面，见图2、图3。

图  2  玻片凝集实验对靶向微气泡的检验

a：凝集反应（-）；b：凝集反应（+）。

Figure  2.  Test of targeted microbubbles by glass slide agglutination experiment

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图  3  免疫荧光染色实验对靶向微气泡的检验

a：未见明显荧光显现；b：可见明显绿色荧光。

Figure  3.  Detection of targeted microbubbles by immunofluorescence staining

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2.3   心肌声学造影（MCE）

以开始注射造影剂为起点，对A、B、C 3组中的U₁与U₂组兔心肌组织进行强度为0.5 w/cm²和0.75 w/cm²的超声辐照，于辐照前、后行QLAB定量分析，结果显示：C组中T1～T4时段U₂组心肌组织的超声视频强度差值高于U₁组，差异有统计学意义（P < 0.05），T1～T4时段U₁组及U₂进行组内两两比较，差异无统计学意义（P > 0.05），见图4、表1。

图  4  心肌组织超声辐照QLAB定量分析图

A1～A3：分别代表再灌注120 min：辐照前、0.5 w/cm²强度辐照后、0.75 w/cm²强度辐照后；B1～B3：分别代表开胸对照组：辐照前、0.5 w/cm²强度辐照后、0.75 w/cm²强度辐照后；C1～C3：分别代表关胸对照组：辐照前、0.5 w/cm²强度辐照后、0.75 w/cm²强度辐照后。

Figure  4.  QLAB quantitative analysis of ultrasonic irradiation of myocardial tissue

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表  1  各组兔超声辐照前后视频强度差值[dB，（$\bar x\pm s$）]

Table  1.  Video intensity difference of each group before and after ultrasonic irradiation [dB，（$\bar x\pm s$）]

分组	n	A组	B组	C组
				T1（30 min）	T2（60 min）	T3（120 min）	T4（180 min）
U1	30	0.15 ± 0.14	5.18 ± 2.83	9.33 ± 1.14	9.32 ± 1.65	10.31 ± 2.75	9.64 ± 1.51
U2	30	0.33 ± 0.04	5.28 ± 1.13	10.99 ± 1.79*	12.05 ± 1.34*	12.34 ± 3.13*	11.61 ± 2.46*
与U1组比较，*P < 0.05。

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2.4   各组兔心肌组织ELISA定量分析结果

T1～T4时段U₂组VID值较U₁组高（P < 0.05），T1～T4时段U₂组及U₁组VID值进行组内两两比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。ELISA结果显示：超声辐照后，T1～T4时段，U₂组IL-6含量比U₁组低（P < 0.05），T1～T4时段U₁组及U₂组IL-6含量差值进行组内两两比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。

U₀组：A组与B组心肌组织内的IL-6含量差异无统计学意义（P > 0.05）。A组和B组分别与C组中T1-T4时段心肌组织IL-6含量比较，差异有统计学意义（P < 0.05），见表2。

表  2  不同时段各组兔心肌组织内IL-6水平[pg/mL，（$\bar x\pm s$）]

Table  2.  IL-6 level in myocardial tissue of rabbits in different time periods [pg/mL，（$\bar x\pm s$）]

分组	n	A组	B组	C组
				T1（30 min）	T2（60 min）	T3（120 min）	T4（180 min）
U0	30	13.01 ± 2.02*	14.85 ± 2.18*	38.76 ± 5.01△▲	54.29 ± 4.86△▲	79.88 ± 4.02△▲	75.25 ± 3.23△▲
U1	30	12.75 ± 2.73*	11.24 ± 2.58*	15.25 ± 2.64△	28.02 ± 4.74△	39.25 ± 3.31△	36.58 ± 2.89△
U2	30	12.00 ± 2.13*	11.01 ± 2.07*	10.47 ± 1.85	25.24 ± 3.51	35.39 ± 2.31	32.36 ± 2.91
与C组比较，*P < 0.05；与U2组比较，△P < 0.05；与U1组比较，▲P < 0.05。

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U₁及U₂组：A组、B组心肌组织IL-6含量差异无统计学意义（P > 0.05）。U₂组T1-T4时段心肌组织的IL-6含量分别与U₀、U₁组T1-T4时段相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。U₁组T1-T4时段心肌组织的IL-6含量与U₀组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）。

2.5   VID值与心肌组织内IL-6水平差值的相关性分析

0.5 w/cm²强度超声辐照前后心肌组织内IL-6水平差值与VID值呈正相关（rU₁ = 0.745，P < 0.05），0.75 w/cm²强度与VID值亦为正相关（rU₂ = 0.734，P < 0.05），见图5。

图  5  VID值与心肌组织内IL-6水平差值的相关性分析

Figure  5.  Correlation analysis of the difference between VID value and IL-6 level in myocardial tissue

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2.6   超声辐照后各组兔心肌组织HE染色病理结果

开胸对照组中未经超声辐照、经0.5 w/cm²强度及0.75 w/cm²强度超声辐照的心肌细胞未见明显变化；再灌注120 min未经超声辐照的心肌细胞排列稍紊乱，细胞形态尚清晰，细胞间隙增宽，可见炎性细胞浸润；0.5 w/cm²强度超声辐照下，心肌细胞排列较规整，损伤较未经超声辐照组有所缓解，炎性细胞浸润减少；0.75 w/cm²强度超声辐照下，心肌细胞损伤缓解明显，排列基本正常，炎性细胞极少量浸润，见图6。

图  6  开胸对照组及再灌注120 min组兔心肌组织病理结果（×400）

A1～A3：为开胸对照组：未经超声辐照、0.5 w/cm²强度辐照后、0.75 w/cm²强度辐照后；B1～B3：为再灌注120 min组：未经超声辐照、0.5 w/cm²强度辐照后、0.75 w/cm²强度辐照后。

Figure  6.  Pathological results of rabbit myocardial tissue in the control group after thoracotomy and the group after 120 min of reperfusion （× 400）

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3.   讨论

炎症反应在MI/RI的发生发展过程中扮演着重要角色，研究表明，心肌缺血再灌注时，IL-6及其受体表达明显增加，且与预后相关^[11]。在MI/RI早期，缺血、缺氧心肌细胞的IL-6呈高表达^[12]，IL-6能够诱导中性粒细胞、心肌细胞表达CD11b/CD18和细胞间黏附分子1，从而引起心肌损伤，还可通过诱导心肌细胞的凋亡参与再灌注后的心室重塑。因此，降低MI/RI心肌组织局部IL-6的浓度，对于缺血再灌注心肌损伤及再灌注后的心室重塑至关重要。

UTMD技术是一种新的区域或组织特异性基因传递手段，实现了超声在分子层面的显影，而其在疾病靶向治疗方面的研究也逐步深入。UTMD介导的mir-206能抑制细胞迁移和侵袭并促进细胞凋亡，使其成为HCC的潜在治疗方法^[13]，UTMD辅助外泌体miR-21进入心脏可显著降低细胞死亡，恢复心脏功能^[14]，UTMD介导的GDF11基因对老年小鼠的缺血心肌有更好的保护作用，其疗效优于腹腔注射^[15]。鉴于UTMD在疾病中的应用及IL-6在MI/RI中的重要作用，本研究以IL-6为治疗靶点，将UTDM和低功率聚焦超声联合用于MI/RI中，以期筛选出UTDM治疗再灌注损伤的最佳条件。

本研究发现，在未经超声辐照及0.5 w/cm²、0.75 w/cm²强度超声辐照的MI/RI心肌组织中IL-6的含量均随着再灌注时间的延长而逐渐升高，于120 min达峰值，随后下降。这与以往的研究结果一致^[16]，MI/RI早期即引起心肌组织内产生高水平的IL-6，且心肌组织损伤程度随着再灌注时间的延长逐渐加重。VID值表示超声辐照后携IL-6单克隆抗体的靶向微泡与心肌组织内IL-6的中和量。同一强度超声辐照各组心肌组织后，组间VID值分析无统计学差异，提示当超声辐照强度相同时，超声能损害的微泡量及IL-6的中和量，不因再灌注时间变化而改变。同一时段，0.75 w/cm²强度超声辐照心肌组织的VID值较0.5 w/cm²强度的高，说明在相同再灌注时段，辐照强度增大，IL-6的中和量增多。0.5 w/cm²强度辐照心肌组织的VID值和IL-6水平差值为正相关，0.75 w/cm²强度辐照心肌组织的VID值和IL-6水平差值亦为正相关。进一步表明VID值能反映心肌组织IL-6的中和量。

超过一定范围的超声辐照强度会引起细胞损伤，前期研究发现1.0～1.5 w/cm²超声辐照强度可致心肌细胞出现炎症反应 ^[17]。在本研究中，经过0.5 w/cm²及0.75 w/cm²强度的超声辐照后，对照组心肌细胞未出现明显损伤，说明0.5 w/cm²及0.75 w/cm²强度的超声辐照不会对心肌细胞造成损伤。此外，再灌注损伤后，经过超声辐照的心肌细胞与未经辐照的心肌细胞比较，不仅心肌细胞损伤程度较前减轻，炎性细胞浸润也明显减少，且0.75 w/cm²强度的超声辐照对心肌细胞再灌注损伤的治疗效果优于0.5 w/cm²。

本实验通过携IL-6单克隆抗体微泡联合UTMD技术，对不同时间段再灌注损伤心肌进行不同强度超声辐照，IL-6抗体与心肌组织抗原结合，有效缓解炎性反应，进而对MI/RI发挥靶向治疗作用。在不引起心肌损伤的超声辐照强度下，越早干预、辐照强度越高，减轻炎症反应的效果越佳。本实验仅设定了0.5 w/cm²及0.75 w/cm²两个辐照强度，因此，存在一定局限性。