食管癌（esophageal carcinoma，EC）是常见的消化道恶性肿瘤之一，据国际癌症研究中心全球统计报告显示2020年我国食管癌新发病例以及新增死亡病例均超过了世界总数的50 %^[1]。食管癌有2种组织学亚型，其中近90 %的食管癌患者为食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）患者^[2]。虽然ESCC中晚期患者的治疗方案正在不断优化，但患者5 a生存率依然很低^[3]。

铁死亡是2012年首次被提出的一种非凋亡形式的细胞死亡，其发生依赖于铁离子，过多的铁离子诱导更多的氧自由基产生，而不断累积的氧自由基攻击细胞膜中的多不饱和脂肪酸，使其过氧化，进一步导致细胞膜的破裂，最终诱发细胞的死亡^[4]。其实细胞内氧自由基产生来源有很多，由于细胞内含有强大的抗氧化系统在不断的阻断和清除过多产生的氧化物，细胞才能在氧化和抗氧化物的动态平衡下维持着生命活动^[5]。铁死亡的发生受多基因的共同调控，通过前期生物信息学分析筛选出2个ESCC中高表达的铁死亡相关基因，分别是RRM2和KIF20A。其中KIF20A被认为是铁死亡抑制因子^[6]。此外，KIF20A作为驱动蛋白家族成员，参与细胞有丝分裂过程，调节细胞增殖，在多种肿瘤中发挥着促癌基因的作用^[7]，而KIF20A在ESCC中的作用有待进一步研究。该研究旨在探究KIF20A对ESCC细胞生物学行为以及铁死亡的影响。

1.   材料与方法

1.1   数据来源

ULCAN（https://ualcan.path.uab.edu/index.html）是一个开放式癌症数据分析网站^[8]，其可提供公开可用的癌症OMICS数据，其中包括癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）。从ULCAN数据库中获取EC及正常组织RNA-seq数据。GEO（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库是各种高通量数据的公共数据库，从GEO数据库中获取GSE75241数据集（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/GSE75241）其包含15对ESCC及配对正常组织的基因表达谱信息。FerrDb（http://www.zhounan.org/ferrdb/current/）是铁死亡调节基因和铁死亡相关疾病检索及可获取网站，从中获取铁死亡相关基因集。

1.2   主要试剂与仪器

胎牛血清购于美国Sigma-Aldrich公司；青链霉素，RPMI1640购于美国BI生物公司，Opti- MEM，Lipofectamin3000购于美国Thermo Fisher公司；10 % SDS-PAGE凝胶试剂盒购于北京博泰斯生物技术有限公司；PVDH膜购于瑞士Roche公司；脱脂奶粉购于德国Biofroxx公司；KIF20A抗体购于美国Santa cruz公司，型号sc-374508；GAPDH及山羊抗兔IGg、山羊抗鼠IGg均购于北京博奥森公生物技术有限公司；CCK-8试剂购于北京博奥森生物技术有限公司，型号BA00208；基质胶Matrigel购于美国BD公司；Transwell细胞培养小室购于美国康宁公司；嘌呤霉素、ECL化学发光底物、4 %多聚甲醛均购中国Biosharp公司；0.1 %结晶紫、DMSO、GSH检测试剂盒、MDA检测试剂盒均购于北京索莱宝生物科技有限公司；铁死亡诱导剂RSL3购于美国MCE公司；全波长酶标仪购于美国BIO RAD公司；倒置显微镜购于日本Nikon公司。

1.3   细胞株及细胞转染

本研究所用食管鳞癌Eca109细胞购自中国科学院细胞库。在10 % 胎牛血清+ 1 % 青链霉素+ RPMI1640完全培养基，37 ℃、5 % CO₂培养箱中培养。KIF20A敲低慢病毒由汉恒生物科技有限公司设计，分别是shKIF20A-1: CCGTTCCTGCA TGATTGTCAA，shKIF20A-2:CCGATGACGATGTCGTAGTTT，空载作为对照组。按照半体积病毒感染法进行病毒感染，病毒MOI值分别是30和10。感染48 h后以1 mg/L的嘌呤霉素连续进行3次筛选。KIF20A过表达质粒由上海吉凯基因公司设计，过表达质粒在Opti- MEM中稀释，质粒浓度分别是1.5 μg和2 μg，用Lipofectamin3000转染至细胞中，KIF20A敲低组用sh-KIF20A来表示，KIF20A过表达组用OE-KIF20A来表示。

1.4   Western blot检测转染效率

Western blot实验检测KIF20A敲低/过表达转染效率。蛋白样品在10 % SDS-PAGE凝胶中进行电泳，PVDF膜湿转1.5 h，用5% 脱脂牛奶封闭，抗体孵育KIF20A（1∶200），GAPDH（1∶4000），4 ℃过夜，孵育二抗山羊抗兔IGg、山羊抗鼠IGg （1∶10000） 常温1 h，滴加ECL化学发光底物显影。结果在Fiji Image J v2.3.0（美国）软件中进行灰度值扫描。

1.5   CCK-8法检测细胞活力

KIF20A敲低/过表达细胞5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，实验分组为KIF20A敲低组和对照组、KIF20A过表达组和对照组，每组分别设计3个平行副孔，分别在12 h，24 h，36 h和48 h时更换含10 % CCK-8溶液的培养基，用全波长酶标仪在450 nm测量吸光度。每次实验至少设计3个平行复孔，实验均重复3次。

1.6   Transwell侵袭实验

实验前24 h将所需基质胶Matrigel转移至4 ℃，其以1∶8比例与无血清培养基稀释，5×10^-5 L/孔滴加至小室。待基质胶成膜，上室为无血清培养基细胞悬液（细胞浓度为2.5×10 ⁸个/L），下室为20%血清的完全培养基，实验分组为KIF20A敲低组和对照组、KIF20A过表达组和对照组，每组分别设计3个平行副孔。培养48 h后进行4%多聚甲醛固定，0.1 %结晶紫染色，在倒置显微镜下随机拍取3个视野，用Fiji Image J v2.3.0（美国）软件计数。实验重复3次。

1.7   细胞划痕实验

实验分组为KIF20A敲低组和对照组、KIF20A过表达组和对照组，每组分别设计3个平行副孔。KIF20A过表达组实验：将细胞接种于6孔板，待细胞密度达90 %时对细胞进行转染，按照转染说明，在转染6 h后进行换液，随后用200 μL灭菌枪头笔直划线并拍照记录，此时为0 h的迁移率。待48 h后给细胞换液后进行第2次拍照，Fiji Image J v2.3.0软件扫描划痕面积，通过以下公式计算迁移率（0 h划痕面积-48 h划痕面积）/0 h划痕面积。KIF20A敲低组实验：将原先构建的KIF20A稳定敲低及对照组细胞接种于6孔板，待细胞贴壁后进行划线，随后步骤如同上述。每次实验至少设计3个平行复孔，实验均重复3次。

1.8   最佳药物浓度筛选

铁死亡诱导剂RSL3干粉剂在DMSO中溶解，配制成10 mmol的母液，随后稀释至以下浓度：0.1 μmol，0.5 μmol，1 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol，同时DMSO为对照组。细胞按5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每个浓度及对照组分别设计3个平行副孔。加药24 h后在倒置显微镜下拍照，CCK-8法测量吸光度。最后在Graphpad Prism9 软件非线性拟合方式计算出半抑制浓度IC₅₀值（half maximal inhibitory concentration）。

1.9   GSH及MDA含量测定

在Eca109细胞中建立KIF20A敲低/过表达模型后分别加入RSL3诱导Eca109细胞发生铁死亡，通过检测GSH及MDA含量以表示各组细胞间的铁死亡水平。实验分组为KIF20A敲低组和对照组、KIF20A过表达组和对照组，每组分别设计3个平行副孔。细胞处理24 h后，研磨细胞取上清，分别用GSH及MDA试剂盒进行含量测定。按照说明书操作步骤，GSH提取统一每组细胞数为2.5×10⁶个，加入5×10^-4 L提取液，MDA提取统一每组细胞数为5×10⁶个，加入1×10^-3 L提取液开展后续操作。

1.10   统计学处理

采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析。计量资料两独立样本组间比较，若服从正态分布且方差齐，采用两独立样本t 检验，以均数±标准差 （$ \bar x \pm s $）表示，不服从正态分布的计量资料采用非参数Mann-Whitney检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   KIF20A的生物信息学分析

首先，从TCGA数据库中获取了食管癌差异表达的前50个上调基因，见图1A。GEO数据库中获取GSE75241作为验证数据集，见图1B，PCA图显示此数据集癌和癌旁分组具有显著区别，见图1C。随后从 FerrDb中获取铁死亡相关基因，取三者交集，结果显示有2个重叠基因，分别是RRM2和KIF20A，其中选择KIF20A为研究的目的基因，见图1D。

图  1  KIF20A的表达谱分析

A：食管癌中高表达的前50个基因；B：GSE75241数据集差异表达基因火山图；C：GSE75241数据集PCA图；D：TCGA-GSE75241-铁死亡数据集韦恩图。

Figure  1.  Analysis of expression profile of KIF20A

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   KIF20A敲低及过表达细胞的构建

以不同病毒滴度（MOI）构建稳定敲低细胞株（Eca109细胞），采用Western blot法检测干扰效率。与对照组比较，shKIF20A-1组MOI值为30时目的分子表达量降低，差异具有统计学意义（P < 0.01），因此选取此条件开展后续实验，见图2A，2B。在Eca109细胞中分别转染1.5 μg和2 μg质粒，结果显示KIF20A质粒浓度为2 μg时目的分子表达量高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.01），见图2C、图2D。

图  2  Western Blot检测KIF20A敲低/过表达效率[（$\bar x \pm s$），n=3]

A：KIF20A敲低效率测定电泳图；B：KIF20A敲低效率测定统计分析柱状图，a：MOI=30，b：MOI=10；C： KIF20A过表达效率测定电泳图；D：KIF20A过表达效率测定统计分析柱状图；^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001

Figure  2.  Western Blot detection of KIF20A knockdown/overexpression efficiency [（$\bar x \pm s$），n=3]

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   敲低/过表达 KIF20A对Eca109细胞增殖能力的影响

通过CCK-8法检测各组细胞的增殖能力，结果显示KIF20A敲低组细胞增殖能力在36 h和48 h表现出明显的抑制作用，且吸光度值低于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.01），见图3A～3B。KIF20A过表达组细胞吸光度值在36 h和48 h高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05，P < 0.01），见图3C～3D。上述结果提示，KIF20A影响Eca109细胞的增殖能力，并且起正向促进作用。

图  3  CCK-8法检测KIF20A敲低/过表达组细胞增殖能力[（$\bar x \pm s$），n=3]

A：KIF20A敲低/对照组细胞生长曲线；B：KIF20A敲低/对照组细胞增殖能力统计分析柱状图；C：KIF20A过表达/对照组细胞生长曲线；D：KIF20A过表达/对照组细胞增殖能力统计分析柱状图；^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  3.  The proliferation ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by CCK-8 assay [（$\bar x \pm s$），n=3]

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   敲低/过表达 KIF20A对Eca109细胞侵袭能力的影响

实验结果显示，KIF20A敲低组侵袭细胞数低于对照组，差异具有统计学意义（P <0.01），见图4A～4B。KIF20A过表达组侵袭细胞数高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.001），见图4C～4D。上述结果提示，KIF20A促进Eca109细胞的侵袭能力。

图  4  Transwell侵袭实验检测KIF20A敲低/过表达组细胞侵袭能力[（$\bar x \pm s$），n=3]

A：KIF20A敲低/对照组侵袭细胞染色图；B：KIF20A敲低/对照组细胞侵袭能力统计分析柱状图；C：KIF20A过表达/对照组侵袭细胞染色图；D：KIF20A过表达/对照组细胞侵袭能力统计分析柱状图；^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  4.  The invasion ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by Transwell invasion assay [（$\bar x \pm s$），n=3]

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.5   敲低/过表达 KIF20A对Eca109细胞迁移能力的影响

细胞划痕实验结果显示，划痕后48 h，KIF20A敲低组细胞迁移能力明显降低，愈合率低于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05），见图5A～5B。KIF20A过表达组细胞迁移能力明显升高，愈合率高于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05），见图5C～5D。以上结果提示，KIF20A对Eca109细胞的迁移能力起正向促进作用。

图  5  细胞划痕实验检测KIF20A敲低/过表达组细胞迁移能力[（$\bar x \pm s$），n=3]

A：KIF20A敲低/对照组细胞迁移面积；B：KIF20A敲低/对照组细胞迁移率统计分析柱状图C：KIF20A过表达/对照组细胞迁移面积；D：KIF20A过表达/对照组细胞迁移率统计分析柱状图；^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  5.  Cell migration ability of KIF20A knockdown/overexpression group was detected by cell scratch assay[（$\bar x \pm s$），n=3]

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.6   Eca109细胞铁死亡模型的构建

给细胞分别加入浓度为0.1 μmol，0.5 μmol，1 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol的RSL3稀释溶液，24 h后CCK-8法检测细胞活力，结果显示，Eca109细胞在RSL3的作用下细胞形态发生明显的改变，加药组较DMSO组细胞，体积减小，形态显皱缩，红色箭头所指，见图6A～6B。此外，与对照组相比0.5 μmol，5 μmol，10 μmol，30 μmol，50 μmol组细胞活力降低，差异具有统计学意义（P < 0.001），见图6C。进一步计算得出Eca109细胞的IC₅₀值为5.128 μmol。

图  6  CCK-8法检测RSL3诱导的Eca109细胞活力[（$\bar x \pm s$），n=3]

A：DMSO组Eca109细胞形态图；B：RSL3组Eca109细胞形态图；C：不同药物浓度组细胞活力检测统计分析柱状图；^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  6.  Eca109 cell viability induced by RSL3 was detected by CCK-8 [（$\bar x \pm s$），n=3]

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.7   敲低/过表达 KIF20A对Eca109铁死亡的影响

检测各组细胞铁死亡水平结果显示，KIF20A敲低组细胞经RSL3诱导后GSH含量低于对照组（P < 0.05），见图7A，而MDA含量高于对照组（P < 0.01），见图7B。RSL3诱导后，KIF20A过表达组细胞GSH含量高于对照组（P < 0.05），见图7C ，MDA含量低于对照组（P < 0.001），见图7D。以上结果提示，KIF20A的下调可以增强细胞铁死亡，而KIF20A的高表达保护Eca109细胞不发生铁死亡。综上所述，在Eca109细胞中，敲低KIF20A的表达促进铁死亡的发生，而过表达KIF20A可以抑制细胞的铁死亡。

图  7  GSH和MDA含量检测[（$\bar x \pm s$），n=3]

A：KIF20A敲低/对照组GSH含量测定； B：KIF20A敲低/对照组MDA含量测定；C：KIF20A过表达/对照组GSH含量测定； D：KIF20A过表达/对照组MDA含量测定。^*P < 0.05，^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  7.  GSH and MDA content were detected [（$\bar x \pm s$），n=3]

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

铁死亡是一种新型的细胞死亡方式，其是铁离子介导的氧自由基累积所诱发的氧化损伤过程^[9]。ESCC中关于铁死亡的研究，早些年有报道显示ESCC患者血清中含有浓度较高的MDA，而抗氧化类酶的活性较低，研究结果提示ESCC患者处于高氧化应激状态^[10]。随后的研究也明确指出ESCC组织中DNAJB6的低表达减少对下游铁死亡抑制因子 GPX4的抑制作用，从而减少ESCC中的铁死亡^[11]。类似的研究结果提示着ESCC细胞通过抑制其本身的铁死亡从而制造利于自身生长的环境。

铁死亡与肿瘤细胞的上皮间质转化，免疫细胞浸润，化疗耐药性等生物特性有关。有大量研究指出，多种抗癌药物除了具有传统的抑癌作用外，还可以通过加速细胞的铁死亡从而达到更高的抑制作用。比如，雄黄激活铁死亡通路抑制食管癌的进一步发展^[12] ，同样的还有冬凌草甲素^[13]，五氨基酮戊酸^[14]等，由于铁死亡通路复杂，故涉及众多基因的调控，因此，针对铁死亡通路上的靶点设计及研发靶点药物的选择也更多。

本研究从铁死亡的角度出发，通过生物信息学分析确定了ESCC中差异表达的铁死亡相关基因，即RRM2和KIF20A。结合分子功能以及在铁死亡通路中的作用，确定KIF20A为研究的目的基因。以往的肿瘤研究中KIF20A的功能研究以促进癌细胞有丝分裂和增殖能力为主，如卵巢癌^[15]和肝癌^[16]等研究中，KIF20A被提及为促进癌症驱动的分子。随着铁死亡机制研究的深入，KIF20A以间接的形式抑制细胞铁死亡的功能揭示^[5]，因此本研究结合KIF20A的以上2个功能，在食管癌Eca109细胞中进行了肿瘤细胞恶性表型以及铁死亡方面的研究。

为了验证KIF20A对Eca109细胞增殖，侵袭迁移能力的影响，在细胞水平对KIF20A进行了敲低及过表达处理，结果显示，KIF20A对Eca109细胞的增殖，侵袭迁移能力起正向促进作用。为了探究KIF20A在ESCC细胞铁死亡中的作用，通过敲低/过表达KIF20A后建立铁死亡应激模型，结果显示KIF20A的表达下调使Eca109细胞对RSL3诱导的铁死亡更加敏感，MDA含量增加，GSH含量降低，说明KIF20A敲低引发较高水平的铁死亡，而KIF20A过表达组结果与之相反。以上结果与KIF20A的铁死亡抑制功能相符，因此笔者认为ESCC组织中高表达的KIF20A可能通过抑制铁死亡的方式给予ESCC细胞更多的生长空间，并且协助增强ESCC细胞的增殖，侵袭迁移能力，有望成为ESCC患者潜在的干扰及药物研发靶点。本研究结果属于初步探究KIF20A对ESCC细胞生物学行为及铁死亡表型的影响，具体分子机制还需进一步探索及验证。