2021年第5版WHO中枢神经系统肿瘤分类将成人型星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤的分类标准以 IDH 突变状态和 1p/19q 共缺失状态主导，不再强调传统的组织学形态特征，取消少突星形胶质细胞瘤这一分类，弥漫性胶质瘤如果同时存在 IDH 突变和 1p/19q 共缺失，无论组织形态是否符合少突胶质细胞瘤，都可定义为少突胶质细胞瘤，IDH 突变和 1p/19q 共缺失型^[1−2]。但两者的组织学形态仍然存在不同预后^[3]，组织学形态对于弥漫性低级别胶质瘤的预后分层仍然有用，在严格定义的少突胶质细胞瘤中，仍然有一部分肿瘤并未发生1p/19q 共缺失且不具有TP53、ATRX突变的星形细胞标记物特征。除了IDH突变和1p/19q 共缺失，少突胶质细胞瘤也与TERT、MGMT、PDGFRA、EGFR、CIC、FUBP1、INA、PTEN等分子指标有关^[4−8]。目前，国内较少有大样本的病例分析成人1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”的组织病理学特征、分子病理学特征及患者的预后特征。因此，本研究对成人1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”的组织病理学特征、分子病理学特征及患者的预后特点进行总结，以探讨成人1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”的特点。

1.   材料与方法

1.1   病例资料

选择昆明医科大学第一附属医院病理诊断为少突细胞瘤和间变少突细胞瘤、少突星形细胞瘤和间变少突星形细胞瘤的患者，共收集到337例，要求患者有临床病理及生存资料用于回顾性分析。根据2007年世界卫生组织（world health organization，WHO）中枢神经系统肿瘤分类^[9]，组织学切片由2名经验丰富的神经病理学家独立审查，肿瘤分级使用广泛接受的标准。本研究获得昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准[（2023）伦理L第206号]。本研究的队列与以往的研究有部分重叠。

1.2   荧光原位杂交技术 （fluorescence in situ hybridization，FISH） 检测及结果判定

1.2.1   FISH 检测

使用Vysis1p36/1q25和19q13/19p13 FISH探针试剂盒（Abbott Molecular）进行双色探针杂交。实验经以下步骤：4 µm厚的组织切片用二甲苯脱蜡；然后80 ℃ 1M硫氰酸钠中加热10 min；37 ℃下胃蛋白酶溶液消化20～30 min；滴加探针，加盖玻片后用封口胶封口，放入杂交仪中，80 ℃变性30 min，37 ℃下过夜；去除封口胶及盖玻片，73 ℃环境下置于0.3%NP-40 2×SSC溶液中，漂洗3 min并晾干；在杂交区域加入荧光染料DAPI （4，6，二脒基-2，苯基吲哚） ，加盖玻片；在荧光显微镜下观察、采集图像。

1.2.2   FISH 结果的判读原则

选择细胞核大小一致、核的边界完整、DAPI染色均一、细胞核孤立无重叠、绿色信号清晰的细胞。随机计数至少100个非重叠的细胞核，若标本的红色信号与绿色信号比值为1∶2的细胞核>25%定义为1p或19q缺失。

1.3   直接测序法检测 IDH1/2、TERT 启动子和TP53突变状态

通过直接测序法评估IDH1/2、TERT 启动子和TP53突变状态。将石蜡固定的肿瘤标本的DNA及RNA使用核酸提取试剂盒（Life Technologies Corporation，中国香港和Kapa Biosystems Wilmington，美国）提取，目的片段扩增所用引物序列见表1。扩增产物经核酸外切酶I（TakaRa Biotechnology Limited，中国）纯化后，使用 BigDye Terminator Cycle Sequencing kit v.1.1 （Life Technologies，美国）将扩增产物进一步行 PCR 反应，然后通过3130xl基因分析仪进行测序及结果分析。

表  1  IDH1/2、TERT 、TP53基因检测引物序列

Table  1.  IDH1/2，TERT、TP53 gene detection primer sequence

基因	引物	序列（5' to 3'）	扩增产物范围（bp）	退火温度（ ℃）
IDH 1	F	CGGTCTTCAGAGAAGCCATT	122	60
	R	CACATTATTGCCAACATGAC
IDH 2	F	AGCCCATCATCTGCAAAAAC	150	60
	R	CTAGGCGAGGAGCTCCAGT
TERT Promoter	F	GTCCTGCCCCTTCACCTTC	274	68
	R	AGCACCTCGCGGTAGTGG
TP53 Exon2	2F1	AGGTGACCCAGGGTTGGA	231	64
	2R1	TCCCACAGGTCTCTGCTAGG
TP53 Exon3	3F1	CCCCCTAGCAGACCTGT	190	64
	3R1	TGGGTGAAAAGAGCAGTCAG
TP53 Exon4	4F5	CCTGGTCCTCTGACTGCTCT	242	64
	4R5	TTCTGGGAAGGGACAGAAGA
TP53 Exon5	5F3	GTTCTTTCGTCGGCTCTTC	357	60
	5R3	GGGCCAGACCTAAGAGCAAT
TP53 Exon 6	6F3	GCTGGGGCTGGAGAGACGACAG	260	64
	6R3	TACTGCTCACCTGGAGGGCCACTG
TP53 Exon 7	7F7	CAAGGCGCACTGGCCTCAT	216	64
	7R1	GTCAGAGGCAAGCAGAGGCT
TP53 Exon 8	8F3	CAAGGGTGGTTGGGAGTAGA	327	60
	8R3	AGGAAAGAGGCAAGGAAAGG
TP53 Exon 9	9F2	GACCAAGGGTGCAGTTATGC	196	60
	9R2	CGGCATTTTGAGTGTTAGACTG
TP53 Exon 10	10F4	TGCATGTTGCTTTTGTACCG	235	60
	10R1	AAGGGGCTGAGGTCACTCAC
TP53 Exon 11	11F1	GGGCACAGACCCTCTCACT	223	60
	11R1	CAAAGACCCAAAACCCAAAA

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.4   MGMT 启动子甲基化水平检测

通过甲基化特异性PCR方法检测样本的MGMT启动子甲基化水平。使用MSP-MGMT引物对亚硫酸盐修饰后的基因组DNA进行PCR扩增，分别用特异性引物对上述PCR产物再进行PCR 扩增，非甲基化引物序列 （MGMT-U） 和甲基化引物序列（MGMT-M） 见表2，PCR产物在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，然后在紫外照射下观察。

表  2  MGMT 启动子甲基化引物序列

Table  2.  MGMT promoter methylation primer sequence

引物	序列
MSP-MGMT-F	5'-GGATATGTTGGGATAGTT-3'
MSP-MGMT-R	5'-CCAAAAACCCCAAACCC-3'
MGMT-MF	5'-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3'
MGMT-MR	5'-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3'
MGMT-UF	5'-TTTGTGTTTTGATGTTTGTAGGTTTTTGT-3'
MGMT-UR	5'-AACTCCACACTCTTCCAAAAACAAAACA-3'

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.5   ATRX、p53、PDGFRA、EGFR、 CIC、FUBP1、INA、PTEN免疫组化染色及结果判读

1.5.1   免疫组化染色

石蜡组织切片经脱蜡后分别用 ATRX 多克隆抗体 （1∶400 dilution; SIGMA CAT: HPA001906）、P53 单克隆抗体 （1∶100 dilution; DO-7，Dako，Glostrup，Denmark）、PDGFRA 多克隆抗体（（1∶200，sc-338，Santa Cruz Biotechnology Inc，Santa Cruz，CA） 、 EGFR 多克隆抗体 （1∶150 dilution，M7239，Dako，Glostrup，Denmark）、CIC多克隆抗体（1∶100 dilution; LS-B4752; Lifespan Biosciences，Inc.，Seattle，USA）、FUBP1多克隆抗体 （1∶100 dilution; sc-11101；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，USA）、INA单克隆抗体 （1∶100 dilution，2E3，Invitrogen Corp，Camarillo，CA）二步法染色，每次实验均以缓冲液代替I抗孵育为阴性对照。

1.5.2   阳性结果判读原则

ATRX阳性肿瘤细胞数>10% 即ATRX表达，ATRX阳性细胞数≤10%即ATRX失表达^[10]；P53阳性细胞数>10% 即P53过表达，P53阳性细胞数≤10% 即P53阴性^[11]。PDGFRA及EGFR的表达根据以下半定量标准对肿瘤最强染色区域进行评分：0（阴性），1（弱），2（中等）和3（强）^[8，12]；CIC和FUBP1通过将染色细胞的百分比乘以强度程度，对表达进行半定量评分，染色细胞的百分比分为0（<10%）、1（10%～50%）、2（>50%），而强度分为0（未染色）、1（弱）、2（中等）和3（强），总分被解释为未染色（0）、弱（1，2）、中等（3，4）和强（6）^[13]；INA阳性表达定义为>10%的肿瘤细胞显示细胞质染色^[5]。

1.6   统计学处理

采用IBM SPSS Statistics 26 （IBM公司，NY，USA）进行统计分析。使用Kendall’ s tanub对各种分子标记物和临床特征进行相关性分析。2个群体间定量资料的比较采用独立样本t检验或Mann-Whitney检验。组间单因素生存分析采用Kaplan-Meier估计和Log rank检验。当P < 0.05（双侧）时，差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   成人“少突胶质细胞瘤”的临床特征

327例病例的年龄为19～75岁，男女比例1.24∶1，包括123例少突胶质瘤（2级），71例间变性少突胶质瘤（3级），100例少突星形细胞瘤（2级），33例间变性少突星形细胞瘤（3级），组织学分级为2级的胶质瘤223例，组织学分级为3级的胶质瘤104例，80.4%（263/327）的病例可获得手术资料，其中71.5%（188/263）的患者接受了全切除，另外28.5%（75/263）的患者接受了非全切除。75.2%（246/327）的患者收集了辅助治疗信息，其中52.4%（129/246）的患者接受了放化疗联合治疗，26%（64/246）的患者只接受了放疗，4.9%（12/246）的患者只接受了化疗，16.7%（41/246）的患者没有接受辅助治疗，见表3。

表  3  患者临床基本资料[n（%）]

Table  3.  Clinical characteristics [n（%）]

类别		n	占比
年龄 （岁）	44.08±11.08
性别		327
	男		181（55.4）
	女		146（44.6）
组织类型		327
	少突胶质细胞瘤		123（37.6）
	间变性少突胶质瘤		71（21.7）
	少突星形细胞瘤		100（30.6）
	间变性少突星形细胞瘤		33（10.1）
组织分级		327
	WHO2		223（68.2）
	WHO3		104（31.8）
肿瘤位置		324
	额叶		197（60.8）
	颞叶		41（12.7）
	顶叶		14（4.3）
	枕叶		8（2.5）
	超过一侧脑叶		50（15.4）
	其他部位		14（4.3）
手术方式		263
	全切		188（71.5）
	非全切		75（28.5）
术后治疗		246
	联合放化疗		129（52.4）
	单纯放疗		64（26）
	单纯化疗		12（4.9）
	未治疗		41（16.7）

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.2   成人少突胶质细胞瘤的形态学及1p/19q编码情况及免疫表型特征分析

327例成人少突胶质瘤其中1例未能检测出1p/19q缺失状态被排除在分析队列外，326例成人少突胶质瘤中有123例1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”，43.3%（55/123）的病例表现为典型少突胶质细胞瘤组织形态学，其中少突胶质瘤28例，间变性少突胶质瘤27例，见图1。在分子上，在81例1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”中，P53 蛋白总阳性率为67.9%（55/81），见图2。在61例1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”中，ATRX 蛋白总失表达率为 41.0%（25/61），见图3。P53和ATRX免疫组化的联合评估发现52.6%（30/57）的1p/19q未共缺失的少突胶质肿瘤缺乏这些重要的星形细胞标记物。

图  1  不同的1p/19q编码的病理分型

Figure  1.  Pathological classification of different 1p/19q frequency

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  2  成人“少突胶质细胞瘤”的p53表达

Figure  2.  Expressions of p53 in adult oligodendrogliomas

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  3  成人“少突胶质细胞瘤”的ATRX表达

Figure  3.  Expressions of ATRX in adult oligodendrogliomas

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   成人1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”的临床特征及免疫组化标记物的相关性分析

年龄的独立样本t检验显示，手术时相对年龄较大的患者在典型少突胶质组织学（P = 0.023）、WHO 3级（P = 0.035）、额叶定位（P = 0.025）和TERT启动子突变（P = 0.019）的肿瘤中经常被发现。除年龄差异外，相关分析显示，具有典型少突胶质组织形态学的肿瘤与TERT启动子突变状态（r = -0.27，P = 0.02）、p53表达 （r = 0.32，P = 0.03）、EGFR表达（r = -0.28，P = 0.01）和PDGFRA表达（r = -0.27，P = 0.02）存在相关性。肿瘤分级与患者性别（r = -0.19，P = 0.03）、典型少突胶质组织学（r = -0.2，P = 0.03）存在相关性。在1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”中，TERT启动子突变与IDH突变（r = 0.342，P = 0.002）、ATRX表达（r = 0.296，P = 0.022）存在相关性，CIC表达与FUBP1表达（r = 0.283，P = 0.04）存在相关性，MGMT甲基化与INA表达（r = 0.407，P = 0.01）存在相关性，PTEN表达与PDGFRA表达（r = 0.329，P = 0.012）、FUBP1表达（r = 0.489，P = 0.000）存在相关性，见图4、图5。

图  4  成人“少突胶质细胞瘤”EGFR、PDGFRA、INA、CIC、FUBP1和PTEN的免疫组化结果（×20）

A：EGFR；B：PDGFRA；C：INA；D：CIC；E：FUBP1；F：PTEN。

Figure  4.  Immunohistochemical results of EGFR，PDGFRA，INA，CIC，FUBP1，and PTENin adult oligodendroglioma （×20）

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  不同临床病理特征及分子标记物的相关性分析

AGE45年龄45岁；Gender性别；Histological type（O vs OA）组织学类型（少突胶质细胞瘤vs少突星形细胞瘤）；Histological grade组织学分级；No frontal lobe vs frontal lobe 非额叶vs额叶；Operation（no total vs total） 非全切vs全切；IDH异柠檬酸脱氢酶；TERT端粒酶逆转录酶；TP53肿瘤蛋白P53；MGMTp methylation O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶启动器甲基化；ATRX expression α-地中海贫血/精神发育迟滞综合征X染色体相关基因表达；EGFR expression表皮生长因子受体表达；PDGFRA expression血小板衍生生长因子受体α表达；PTEN expression磷酸酶与张力蛋白同源物表达；INA expression INA表达；FUBP1expression 远端上游元件结合蛋白1；CIC expression CIC表达。*在 0.05 级别（双尾），相关性显著；**在 0.01 级别（双尾），相关性显著。

Figure  5.  Correlation analysis between various clinicopathological and molecular factors

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   成人1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”的分子病理预后相关因素分析

在132例1p/19q未共缺失的“少突胶质肿瘤”队列中，p53阳性表达和ATRX表达缺失对预后的不利价值已被证实。在临床上，年龄较小（年龄≤45岁）表现出良好的预后价值。在组织学上，WHO 2级及典型少突胶质细胞形态学特征的患者总生存率和无进展生存率方面均具有良好的预后价值（P < 0.001），见图6。在分子上，Kaplan-Meier生存分析未发现各分子标记物的显著预后价值，见表4。

表  4  不同分子标记物的Kaplan-Meier生存分析

Table  4.  Kaplan-Meier survival analysis of various molecular markers

分子标记物	n	中位OS HR（95%CI）	χ2	P	中位PFS HR（95%CI）	χ2	P
IDH	92
野生型	22	42（23.3～103.4）	2.151	0.143	27.0（2.0～52.0）	1.739	0.187
突变型	70	102（84.6～119.6）			70.0（40.3～99.7）
TERT启动子	67
野生型	37	93.6（44.7～142.5）	0.012	0.914	48.0（0～106.7）	0.018	0.894
突变型	30	109.1（24.1～194.1）			62.0（8.7～115.3）
PDGFRA	63
阳性	37	93.6（73.2～114.0）	2.954	0.086	57 （20.3～93.7）	0.911	0.340
阴性	26	70.0（20.3～119.7）			36（28.2～43.8）
EGFR	68
Negative/weak	47	48（26.3～69.7）	0.014	0.100	48（26.3～69.7）	2.654	0.103
Moderate/strong	21	96.8（44.7～148.9）			96.8（44.7～148.9）
PTEN	54
阳性	32	93.6 （46.8～136.4）	0.612	0.434	54.1（26.0～82.2）	0.12	0.750
阴性	22	91.6 （46.8～136.4）			53.6（17.0～90.3）
INA	58
阳性	27	93.6（78.2～109.0）	0.263	0.608	62（45.2～78.8）	0.701	0.401
阴性	31	94.0（45.7～142.3）			54.1（0～78.7）
CIC	58
阳性	44	86.4（54.5～118.2]	0.036	0.800	62 （38.2～85.8）	1.073	0.300
阴性	14	97.3（71.6～123.1）			34.9（0～75.2）
FUBP1	47
阳性	42	94.0（57.9～130.1）	2.073	0.150	62（37.0～87.0）	3.212	0.073
阴性	5	44.2（40.7～47.7）			31.7（15.2～48.2）
N：病例数；OS：总生存期；PFS：无进展生存期；NA：不可用。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

图  6  1p/19q非共缺失的“少突胶质细胞瘤”的Kaplan-Merier分析

A～B:年龄与1p/19q非共缺失的“少突胶质细胞瘤”患者预后的关系；C～D:组织病理分级与1p/19q非共缺失的“少突胶质细胞瘤”患者预后的关系；E～F:组织病理分类与1p/19q非共缺失的“少突胶质细胞瘤”患者预后的关系。

Figure  6.  Kaplan-Meier survival analysis in 1p/19q non-codeleted oligodendrogliomas

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

3.1   组织病理学符合少突胶质细胞瘤的患者并不都具有1p/19q共缺失

胶质瘤是原发性中枢神经系统肿瘤中最常见的恶性肿瘤^[14]，近年来，中枢神经系统胶质瘤的分类以患者预后为指导，将分子病理学引入肿瘤分类，而在2007年WHO中枢神经系统肿瘤分类中存在的少突星形胶质瘤这一组织病理学分类被废弃，不再强调组织形态学，而是通过分子病理学1p/19q是否共缺失来区分少突胶质细胞瘤和星形胶质细胞瘤^[1，9]，虽然1p/19q共缺失被认为是少突胶质细胞瘤的分子特征并且可以预测预后及指导治疗，但是仍有30%～40%组织病理学表现为少突胶质细胞瘤的患者1p/19q未共缺失。苏玉金等^[15]利用FISH法对568例含少突胶质细胞成分的胶质瘤患者的1p/19q共缺失情况进行了检测，结果显示少突星形细胞瘤及间变性少突星形细胞瘤染色体1p/19q未共缺失均超过一半以上，少突胶质细胞瘤及间变性少突胶质细胞瘤染色体1p/19q共缺失仅约66%^[15]。在RTOG 9402试验中，150例少突胶质肿瘤中有29%具有完整的1p或19q等位基因^[16]，当同一队列的组织学接受中央小组审查时，20%（19/97）的具有典型的少突胶质形态学的肿瘤的1p/19q未共缺失^[17]。本实验与其结论基本一致，本研究审查了1个大样本的少突胶质细胞瘤队列（n=326），结果显示24%（30/125）的少突胶质细胞瘤和38.9%（28/72）的间变性少突胶质细胞瘤具有完整的1p或19q，1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”的总频率为29.4%（58/197），本研究还进一步检测了星形特征性细胞标志物p53和ATRX的表达情况，在这部分1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”中52.6%（30/57）的样本缺乏星形细胞瘤特征性标记物P53高表达和ATRX缺失。因此，1p/19q未共缺失的“少突胶质肿瘤”是1个独特的、规模可观的群体，将这些患者完全纳入星形胶质细胞瘤的治疗方案和临床试验可能不合适，患者从中获益可能不明显并且相关的研究结果可能会受影响。

3.2   在低级别胶质瘤中TERT启动子突变与少突胶质细胞瘤相关

端粒是保护染色体末端的DNA-蛋白质复合体，端粒的长度在每次细胞分裂后都会缩短，许多类型的肿瘤细胞通过端粒酶激活来延长端粒长度，进而使肿瘤细胞增殖增加^[18]，研究发现端粒酶逆转录酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）表达变化不仅改变整个端粒酶的活性水平，而且其水平上调被认为是端粒酶被激活的关键步骤^[19]，TERT启动子的突变更常见于IDH突变，1p/19q共缺失的少突胶质细胞瘤及IDH野生型，胶质母细胞瘤中；但任有10%～15%的恶性肿瘤通过非端粒酶依赖的方式延长端粒长度，即ALT途径（端粒替代延长途径），这常见于IDH突变，1p/19q未共缺失的星形胶质细胞瘤中^[20]，而ALT表型的诱导需要同时存在IDH突变及ATRX缺失，并且在胶质瘤中ATRX的突变高发于星形细胞瘤^[21]，有研究表明，这2条延长端粒长度的途径很大程度上是互斥的^[22−23]。Eckel-Passow等^[24]根据IDH和TERT启动子的突变状态以及1p/19q是否共缺失将胶质瘤患者分为5组，并进行了各组之间的预后差异统计，研究结果显示，在低级别胶质瘤中，IDH和TERT启动子同时突变组的总体生存期最长，仅有TERT启动子突变组的总体生存期最短。在IDH突变的胶质瘤中，TERT启动子突变的缺失更加提示可能是星形细胞瘤。本研究中典型少突胶质细胞瘤组织形态学也与TERT启动子突变（P < 0.001）显著相关，因此TERT启动子突变可能可以和1p/19q共缺失联合评估少突胶质细胞瘤，从而提高少突胶质细胞瘤诊断的准确性。

3.3   1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”与EGFR、PDGFR表达负相关

表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和血小板衍生生长因子受体α（platelet derived growth factor receptor α，PDGFRA）与细胞命运决定、细胞增殖相关，在脑发育过程中广泛参与神经干细胞的迁移及胶质细胞的发育等重要过程^[25]，国内外研究结果显示^[26−29]，EGFR和PDGFR低表达是胶质瘤富含成熟神经元和少突胶质细胞的特征，在本研究中，在1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”中，符合典型少突胶质细胞瘤组织学特征的肿瘤与EGFR、PDGFR表达显著负相关，这一结果与之符合，这提示EGFR和PDEFR表达可能是鉴别1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”和星形细胞瘤的遗传学改变。

综上所述，在组织形态学上符合典型少突胶质细胞瘤特征的一部分肿瘤并未发生分子病理学1p/19q共缺失改变，以2021年第5版WHO中枢神经系统肿瘤分类标准^[1]，将这部分肿瘤归类为星形细胞瘤，但其并不具有p53阳性表达、ATRX表达缺失的星形细胞标记物特征，因此星形细胞瘤并不能解释这部分肿瘤，并且这部分肿瘤的组织病理学与EGFR和PDGFRA呈负相关，提示患者完全使用星形细胞瘤的治疗方案可能获益不明显。1p/19q未共缺失的“少突胶质细胞瘤”的分子亚型值得笔者进一步探索。