宫颈癌（cervical cancer ，CC）仍然是目前女性在生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一，同时是女性第四大癌症死亡病因，虽然人乳头瘤病毒（human papillomavirus，HPV）疫苗已经问世，对宫颈癌的有效防治也提供了新机遇，但目前宫颈癌的发病人群仍日趋年轻化，2020年全球约有34.2万死亡病例和60.4万新发病例^[1]，这意味着宫颈癌仍然是一个重大的世界公共卫生问题。

细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（cluster of differentiation 147 ，CD147）是原发性肿瘤中最常见的表达蛋白之一，它是一种高度糖基化的I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族（ immunoglobulin superfamily ，IgSF）成员，在促进肿瘤细胞上皮转化、炎症发生、细胞增殖、加速肿瘤细胞糖酵解、调节肿瘤细胞自噬等方面有着重要作用^[2-3]。炎症小体是由细胞质中的模式识别受体组装的多蛋白复合体，可介导炎症和焦亡的发生^[4]。焦亡是一种程序性细胞死亡方式，也是一种由炎症小体介导的炎症细胞死亡^[5-6] 。炎症小体黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanome 2，AIM2）是介导细胞焦亡的关键上游起始蛋白，是免疫系统的一种非特异性受体因子，属于经典炎症小体家族^[7]。研究表明AIM2炎症小体在细菌感染、自身免疫性疾病及肿瘤的发生和发展中有重要作用^[8]。CD147在多种恶性肿瘤中均表达升高，本课题组前期实验结果证明，与正常宫颈细胞相比CD147 在宫颈癌细胞中的表达显著升高^[9]，但CD147对肿瘤的作用是否与炎症小体有关，尚未见相关研究 。本研究以SiHa宫颈癌细胞为研究对象，探究CD147对宫颈癌的作用机制是否与AIM2炎症通路调控焦亡有关，为宫颈癌发病机制及新靶点的治疗研究提供思路。

1.   材料与方法

1.1   细胞与主要试剂

人宫颈癌细胞SiHa细胞株购于武汉普诺赛公司，CD147-siRNA慢病毒由吉凯公司构建。Trizol试剂、乳酸脱氢酶释放检测试剂盒、RIPA组织细胞裂解液均购自塞维尔生物科技有限公司抗体 CD147（Ab217319）购自美国Abcam公司，AIM2（sc-515514）购自美国Santa Cruz公司，caspase-1（22915-1-AP）、 IL-18（60070-1-lg）、GSDMD（20770-1-AP）、GAPDH（60004-1-lg）购自三鹰生物技术有限公司，DMEM 培养基购于普诺赛公司；逆转录和荧光定量试剂盒均购买于TaKaRa公司。

1.2   实验方法

1.2.1   细胞培养与处理

宫颈癌SiHa细胞培养于 DMEM（10%胎牛血清+1%青链霉素双抗）培养基中，在37 ℃、5%CO₂细胞培养箱内培养。慢病毒转染前，在6孔板中种100000个细胞，并按照吉凯公司的说明书进行转染。根据慢病毒不同干扰序列，将实验分组为SiHa组、阴性对照组（shCD147-NON）、敲低组1（shCD147-1）和敲低组2（shCD147-2）。荧光倒置显微镜下观察各组细胞感染状况，以绿色荧光蛋白表示细胞感染率。

1.2.2   实时荧光定量PCR实验

选取状态良好的细胞提RNA，按照试剂盒（Takara生物科技公司）说明书方法对内参（GAPDH）及目的基因（CD147、AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD）进行反转录合成cDNA、PCR扩增及逆转录。统计相应基因CT值，运用2^-ΔΔCT的计算公式计算mRNA的相对表达量。本研究中所涉及的PCR引物，见表1。

表  1  RT-qPCR检测基因的引物序列

Table  1.  Primer sequences of genes detected by RT-qPCR

基因	引物序列
CD147	F-TGTTCGTGCTGCTGGGATTCG R-GAGCCAAGGTCTTCTACGGTAGTG
AIM2	F-TATCGGCACAGTGGTTTCTTAGAGG R-GGGCTGAGTTTGAAGCGTGTTG
Caspase-1	F-CCCACATCCTCAGGCTCAGAAG R-TGCGGCTTGACTTGTCCATTATTG
IL-18	F-TGGCTGCTGAACCAGTAGAAGAC R-GAGGCCGATTTCCTTGGTCAATG
GSDMD	F-CCAGAAGAAGACGGTCACCATCC R-TGGAACGCTTGTGGCCTGTC
GAPDH	F-TGCACCACCAACTGCTTAGC R-GGCATGGACTGTGGTCATGAG

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1.2.3   Western blot实验

收集处理后的SiHa细胞裂解蛋白，检测 CD147、AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD的蛋白相对表达量，将提取后的蛋白进行上样、电泳、电转、5%脱脂牛奶封闭1 h、TBST洗膜3次、一抗 4 ℃孵育16 h，TBST洗膜3次，二抗杂交1.5 h，再次TBST洗膜3次后加上化学发光剂（ECL）显色，上机检测。抗体稀释如下：CD147（1∶10000） 、AIM2（1∶5000）、Caspase-1（1∶1500）、IL- 18（1∶5000）、GSDMD（1∶5000）、GAPDH(1∶8000)。

1.2.4   平板克隆实验

以1000个/孔的密度将各组细胞接种在6孔板中培养，继续培养2周，观察细胞集落形成的大小和数量，PBS洗涤3遍、固定后染液染色，并采集各组细胞集落图像。

1.2.5   CCK-8实验

细胞接种到96孔板，每孔2000个细胞，每组6个复孔。培养12、24、36、48 h后，将20 µL CCK-8试剂避光加入每孔200 µL培养基中。3 h后，在450 nm处用酶标仪测定吸光度值。

1.2.6   乳酸脱氢酶（LDH）释放实验

先收集细胞到离心管内离心，8000 g 4 ℃离心10 min，弃上清，超声波破碎细胞。根据乳酸脱氢酶活性检测试剂盒的说明书制备样品和标准品，并将制备好的样品转移到 96 孔板中，使用酶标仪检测 450 nm 波长下的吸光度值，计算乳酸脱氢酶活性。

1.2.7   细胞焦亡形态学观察

细胞培养皿置于荧光倒置显微镜的载物台上，分别观测SiHa细胞和对照组细胞形态变化，拍照记录，荧光倒置显微镜下观察细胞的形态学变化。

1.3   统计学处理

采用GraphPad Prism 9.0 软件进行统计分析。组间多重比较统计分析使用LSD-t法；组间统计学分析使用单因素方差分析；2组间统计学分析使用t检验进行统计分析，P < 0.05 为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   CD147在宫颈癌细胞中的表达水平及慢病毒转染效率的测定

Western blot检测 CD147在宫颈癌细胞 SiHa （HPV+）、C33a（HPV-） 和正常宫颈上皮细胞 H8（HPV+）、HCerEpic（HPV-）中的表达水平，结果显示：蛋白CD147在HPV阳性细胞中表达水平高于HPV阴性细胞，且在宫颈癌SiHa细胞中表达水平最高（F = 975.2，P < 0.0001），见图1A，故选取SiHa细胞进行CD147低表达慢病毒的转染。RT-qPCR和Western blot实验检测 SiHa组、shCD147-NON组、shCD147-1 组和shCD147-2组细胞中CD147 mRNA和蛋白的表达情况，RT-qPCR实验结果显示，与SiHa组相比，shCD147-1 组和shCD147-2 组 CD147 mRNA表达均显著降低（F = 240.4，P < 0.0001），见图1B。Western blot检测结果与RT-qPCR结果一致（F = 457.1，P < 0.0001），见图1C。荧光倒置显微镜下观察可见细胞中多含有绿色荧光，提示CD147慢病毒转染成功，见图1D。结果表明CD147在宫颈癌细胞中的高表达且慢病毒介导的CD147低表达载体构建成功。

图  1  检测 CD147在宫颈癌细胞中的表达水平及慢病毒转染效率

A：CD147蛋白在宫颈癌及正常宫颈上皮细胞中的相对表达量；B：转染慢病毒后CD147的 mRNA 的表达情况；C：转染慢病毒后CD147蛋白的相对表达量；D：慢病毒转染CD147细胞后绿色荧光表达情况 ( 标尺为100 μm)；ns：差异无统计学意义；^****P < 0.0001。

Figure  1.  The expression level of CD147 in cervical cancer cells and the transfection efficiency of lentivirus were detected

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2.2   下调CD147对AIM2炎症小体信号通路的影响

RT-qPCR和Western blot实验检测AIM2炎症小体相关因子的mRNA及蛋白的表达。RT-qPCR结果显示，与SiHa组相比，shCD147-1 组和 shCD147-2 组细胞中AIM2（F = 363.3，P < 0.0001）、Caspase-1（F = 18.47，P < 0.0001）、IL-18（F = 476.1，P < 0.0001）、GSDMD（F = 59.35，P < 0.0001）表达升高，见图2A。Western blot检测结果显示，与SiHa组相比，shCD147-1 组和 shCD147-2 组细胞中AIM2（F = 580.2，P < 0.0001）、Caspase-1（F = 66.67，P < 0.0001）、IL-18（F = 210.9，P < 0.0001）、GSDMD（F = 124.0，P < 0.0001）表达升高，见图2B，结果提示下调CD147可激活AIM2炎症小体信号通路。

图  2  下调CD147 对 SiHa 细胞AIM2炎症小体信号通路的影响

A：下调 CD147后 AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD 的 mRNA 的表达情况；B：下调 CD147后 AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD 蛋白的相对表达量；ns：无统计学差异；^***P < 0.001；^****P < 0.0001。

Figure  2.  Effect of down-regulating CD147 on AIM2 inflammasome signaling pathway in SiHa cells

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2.3   下调CD147对宫颈癌细胞焦亡的影响

荧光倒置显微镜下观察细胞的形态，与SiHa组相比，shCD147组出现细胞焦亡典型形态，主要表现为细胞明显的肿胀和空泡化的现象，见图3A，且乳酸脱氢酶（LDH）释放度明显升高（t = 11.13，P < 0.001），见图3B。结果提示下调CD147可促进细胞焦亡的发生。

图  3  下调CD147对宫颈癌SiHa细胞焦亡的影响

A：荧光倒置显微镜观测下调 CD147对SiHa 细胞形态影响（ 标尺为100 μm）；B： 下调 CD147对SiHa 细胞释放乳酸脱氢酶水平的影响；^***P < 0.001。

Figure  3.  Effect of down-regulation of CD147 on pyroptosis in cervical cancer SiHa cells

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2.4   下调CD147对宫颈癌细胞增殖克隆能力的影响

CCK-8实验结果表明，与SiHa组相比，shCD147-1 组和 shCD147-2 组细胞增殖能力减弱（24 h：F = 105.9，P < 0.0001；36 h：F = 2847，P < 0.0001；48 h：F = 489.2，P < 0.0001），见图4A。平板克隆实验结果表明，与SiHa组相比，shCD147-1 组和 shCD147-2 组细胞集落形成能力显著降低（F = 309.0，P < 0.0001），见图4B。结果提示下调CD147表达可抑制SiHa细胞的增殖克隆能力。

图  4  下调 CD147 后宫颈癌 SiHa 细胞增殖克隆能力情况

A：下调 CD147对SiHa 细胞增殖影响；B：下调 CD147对SiHa 细胞集落形成情况；^***P < 0.001；^****P < 0.0001。

Figure  4.  The proliferation and cloning ability of cervical cancer SiHa cells after down-regulation of CD147

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3.   讨论

细胞焦亡在肿瘤发生发展中具有促进或抑制的双重作用。一方面，细胞焦亡引起的长期炎症反应有利于肿瘤细胞生长微环境的构建，促进正常细胞向肿瘤细胞的转化，帮助肿瘤细胞实现免疫逃逸，加快肿瘤的发生发展；另一方面，作为促炎性细胞死亡方式之一，细胞焦亡激活后通过促进肿瘤细胞发生焦亡，进而发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。CD147作为免疫球蛋白超家族中的一个重要成员^[10]，因其诱导邻近成纤维细胞或肿瘤细胞产生基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs），促进肿瘤细胞迁移和侵袭，又被命名为细胞外基质金属蛋白酶诱导剂（extracellular matrix metalloproteinase inducer，EMMPRIN），越来越多的证据表明，CD147 在正常组织或细胞中表达降低，而在多种肿瘤中表达升高，包括肝癌、黑色素瘤、肺癌等^[11]。目前对于晚期宫颈癌患者并没有较好的解决方案，而炎症常常与癌症的发生密切相关，宫颈炎就是宫颈癌发生和发展重要病因之一，因此炎症是癌症预防和治疗的一个重要策略。CD147与多种炎症性疾病具有相关性，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、间质性肺炎、系统性红斑狼疮等，CD147可能参与这些炎性疾病反应的调节。近年来随着国内外学者的进一步研究，炎症小体在调节肿瘤的发生、生长、侵袭和转移中发挥着重要作用^[12]。AIM2炎症小体是炎症小体家族的重要一员，AIM2炎症小体可作为一种细胞质传感器来识别外来双链DNA，其通过细胞外囊泡进行细胞间的传播^[13]。当AIM2炎症小体受到病原体信号刺激后，其复合体中的Caspase-1被进一步激活释放促炎细胞因子，诱导细胞发生焦亡^[14]。细胞焦亡是一种由消皮素介导的细胞程序性死亡形式，它是细胞不断扩增，直到细胞膜破裂导致细胞内容物释放，从而激活强烈的炎症和免疫反应^[15]，细胞焦亡可由多种影响因素激活炎性小体而触发^[16]。宫颈癌与炎症之间的机制非常复杂，尚不完全清楚，需要进一步阐明，为其靶向治疗提供方向和思路。

本研究通过Western blot 实验发现CD147在宫颈癌细胞中高表达，且在HPV阳性的细胞中表达相对较高，在HPV阴性的细胞中表达相对较低，提示 CD147 的表达与 HPV 病毒感染有关，有研究发现CD147分子在HIV-1宿主细胞上高表达，抑制CD147发挥可拮抗HIV-1感染宿主细胞的作用^[17]，说明CD147和病毒感染有相关性。过去普遍认为肿瘤细胞的死亡方式是凋亡，而凋亡的机制一直是研究的热点。然而越来越多的证据表明，肿瘤细胞的死亡方式是多样化的，程序性坏死可分为细胞凋亡、细胞焦亡及铁死亡等^[18]。CD147不仅可以通过凋亡，还可通过自噬、铁死亡等方式影响肿瘤的发生^[19]。研究发现CD147作用机制与激活Caspase酶有关，沉默CD147后，Caspase-3表达升高，从而使细胞进入凋亡阶段^[20]。本研究采用 shRNA 技术沉默其表达后，通过RT-qPCR和Western blot实验发现，下调 CD147后，AIM2炎症相关因子AIM2、Caspase-1、IL-18、GSDMD明显上调，荧光倒置显微镜下观察到下调 CD147细胞出现典型的细胞焦亡形态，且乳酸脱氢酶（LDH）释放度明显升高，证明CD147诱导细胞死亡可能通过AIM2炎症小体途径来实现，也说明CD147诱导细胞死亡是多通路的。本研究通过CCK-8和平板克隆实验发现下调CD147表达后，实验组细胞增殖能力、集落形成能力显著降低，与曹勋荣等研究结果相一致^[21]。

综上所述，本研究发现CD147在宫颈癌细胞中呈高表达趋势，下调CD147可通过介导AIM2炎症小体诱发细胞焦亡，抑制宫颈癌SiHa细胞增殖克隆，进而抑制肿瘤的发生发展。CD147 的表达量与HPV病毒感染有关，但其具体机制尚不完全明确，需进一步研究，本课题组后续将进一步分析CD147与HPV的相关性及之间的具体分子机制，为宫颈癌机制及新靶点的治疗研究提供了新思路。