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血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI的水平与病毒性肝炎发展的相关性

徐苏 刘宇晴 郑兴旺

徐苏, 刘宇晴, 郑兴旺. 血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI的水平与病毒性肝炎发展的相关性[J]. 昆明医科大学学报, 2024, 45(12): 147-152. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20241221
引用本文: 徐苏, 刘宇晴, 郑兴旺. 血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI的水平与病毒性肝炎发展的相关性[J]. 昆明医科大学学报, 2024, 45(12): 147-152. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20241221
Su XU, Yuqing LIU, Xingwang ZHENG. Correlation between Serum Levels of Anti-HBC,CHE,and Apolipoprotein AI and the Development of Viral Hepatitis[J]. Journal of Kunming Medical University, 2024, 45(12): 147-152. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20241221
Citation: Su XU, Yuqing LIU, Xingwang ZHENG. Correlation between Serum Levels of Anti-HBC,CHE,and Apolipoprotein AI and the Development of Viral Hepatitis[J]. Journal of Kunming Medical University, 2024, 45(12): 147-152. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20241221

血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI的水平与病毒性肝炎发展的相关性

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20241221
基金项目: 浦口区科技计划项目(S2022-27)
详细信息
    作者简介:

    徐苏(1989~),女,江苏南京人,学士,主管技师,主要从事生化研究工作

    通讯作者:

    郑兴旺,E-mail:714551406@qq.com

  • 中图分类号: R511

Correlation between Serum Levels of Anti-HBC,CHE,and Apolipoprotein AI and the Development of Viral Hepatitis

  • 摘要:   目的  探讨血清乙型肝炎病毒核心抗体(hepatitis B core anbody,抗-HBC)、胆碱酯酶(cholinesterase,CHE)、载脂蛋白AI的水平与病毒性肝炎发展的相关性。  方法  选取南京市浦口区中医院2021年1月至2024年1月收治的388例病毒性肝炎患者作为观察组;另选取同期68例健康体检者作为对照组,比较观察组与对照组血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平。比较观察组中慢性肝炎不同病情严重程度患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平。比较观察组中不同疾病类型患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI检测阳性例数。比较观察组中肝硬化不同分级患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平。  结果  观察组血清抗-HBC水平(4.52±0.63)log10PEIU/mL高于对照组(1.12±0.26)log10PEIU/mL,差异有统计学意义(t = -43.822,P < 0.001),而CHE(4.09±0.91)kU/L、载脂蛋白AI102.54±5.95)mg/dL均低于对照组的(10.65±1.73)kU/L、(120.17±6.06)mg/dL,差异有统计学意义(t = 46.580、22.477,P < 0.001);观察组中慢性肝炎不同病情严重程度患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平差异均有统计学意义(P < 0.05),且血清抗-HBC水平显示慢性肝炎轻度 < 慢性肝炎中度 < 慢性肝炎重度,而CHE、载脂蛋白AI水平显示慢性肝炎轻度 > 慢性肝炎中度 > 慢性肝炎重度,差异有统计学意义(P < 0.05);慢性肝炎重度、肝硬化及肝癌的血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI的阳性例数明显高于慢性肝炎轻度、中度,差异有统计学意义(P < 0.05);观察组中肝硬化不同分级患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平差异有统计学意义(P < 0.05),且随病情的发展血清抗-HBC水平不断增高,而CHE、载脂蛋白AI均不断降低,差异有统计学意义(P < 0.05)。  结论  病毒性肝炎患者血清抗-HBC的表达水平显著升高,CHE、载脂蛋白AI的表达水平明显降低,且血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI的表达水平与其疾病发展相关。
  • 三七(Panax notoginseng (Burk.) F. H. chen ex C. H.),又名参三七、田七等,为五加科多年生草本植物,是我国名贵中药材。三七中主要有效成分包括:三七多糖,三七皂苷、黄酮类、氨基酸、挥发油等[1]。据现有研究发现三七多糖具有调节免疫功能[2]、抗炎[3]、降血糖[4]、降血脂[5]、抗氧化[6]、抗衰老[7]等药理作用,刘平平等[8]发现从三七发酵液提取的三七多糖对DPPH自由基、羟自由基等具有一定清除作用。现已有研究表明,天然多糖如:银耳多糖、山药多糖、灵芝多糖等具有良好的吸湿保湿性能,在日化产品中具有良好的应用前景[9],而三七多糖是否具有吸湿、保湿的生物活性尚未见报道。

    三七药渣是三七在工业中提取三七总皂苷后的废渣[10],其中三七多糖、三七素等成分仍具有药用价值却不能得到有效利用。本课题组前期采用水提醇沉法,从工业三七药渣中提取三七粗多糖,通过DEAE Sepharose Fast Flow成功分离出中性多糖和酸性多糖,已证实三七药渣中提取的三七多糖具有多种生理活性[11-12],且具有良好的安全性[13]。本文拟在前期研究基础上,首次考察从药渣中提取的三七粗多糖及纯化后各组分是否具有吸湿、保湿及体外抗氧化活性,为三七多糖用于日化产品、保健食品、药品研发奠定基础。

    三七药渣(云南三七科技提供);D-无水葡萄糖对照品、D-半乳糖醛酸对照品、DPPH、ABTS(上海源叶生物);甘油、抗坏血酸(VC)、七水合硫酸亚铁(广东光华科技);海藻酸钠(上海易恩);DEAE Sepharose Fast Flow填料(美国GE Healthcare);透析袋(合肥白鲨生物科技);其余试剂均为国产分析级纯。

    BSA224S万分之一分析天平(德国Sartorius公司);DK-98- II水浴锅(天津市泰斯特);RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣);H1850高速离心机(湖南湘仪);SCIENTZ-10ND 冷冻干燥机(宁波新芝);玻璃干燥器(四川蜀玻集团);岛津UV-1900紫外-分光光度计(日本岛津);Bio-rad MODEL 680酶标仪(美国Bio-rad 公司)。

    1.3.1   三七多糖的提取、纯化及含量测定

    采用水提醇沉法从工业三七药渣中提取CPPN,取干燥三七药渣1000 g,加入10倍量超纯水,沸水浴提取6 h,过滤;滤渣加入8倍量超纯水,沸水浴提取6 h,过滤;滤渣继续加入6倍量超纯水,沸水浴提取6 h,过滤。合并3次滤液,8000 r/min离心5 min,取上清液,80℃减压浓缩,至原体积的1/10后,加入滤液3倍体积的无水乙醇,放4 ℃下醇沉过夜。8000 r/min离心5 min,弃去上清液,收集沉淀。分别用无水乙醇、乙醚洗涤沉淀三次后加入适量超纯水复溶,冷冻干燥,即得CPPN。采用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换填料对CPPN进行纯化,取CPPN 600 mg,溶于20 mL超纯水中,8000 r/min离心10 min去除不溶物,经0.45 μm微孔滤膜过滤后上样,以超纯水、0.1、0.2、0.3 M NaCl溶液对其进行梯度洗脱,收集洗脱液,5 mL/管。硫酸蒽酮法跟踪检测,绘制洗脱曲线其中管数为横坐标,吸光度值为纵坐标。依据洗脱曲线,合并各组分,80℃减压浓缩至原体积1/10,超纯水透析36 h(MwCO 14000Da),每4 h换一次水。透析结束后,真空冷冻干燥,分离得到的各组分依次命名为NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ。采用硫酸蒽酮法,测定三七多糖中性糖含量,间羟基联苯法测定三七多糖糖醛酸含量[14]

    1.3.2   吸湿/保湿能力考察

    参照蔡婉静等[15]在研究中采用的方法,以常用的保湿剂甘油和海藻酸钠对照,考察CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿和保湿能力。(1)吸湿性。准确称取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠各0.5 g于称量瓶中,平行3份,将其放入置有饱和碳酸钾溶液(RH43%)和饱和硫酸铵溶液(RH81%)的干燥器内,室温下放置,并在4、8、12、24、36 h分别称量样品放置前重量(W0)和放置后的重量(W1),吸湿能力按照公式(1)计算:

    $$ {\text{吸湿性}}(\%)=({\rm{W}}_0-{\rm{W}}_1)\times100/{\rm{W}}_0 $$ (1)

    (2)保湿性。准确称取CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠各0.5 g于称量瓶中,平行3份,并分别加入3倍样品质量的超纯水,转动称量瓶直至样品将水分完全吸收。将称量瓶放入装有干燥完全的硅胶的干燥室内,于室温下放置,并在4、8、12、24、36 h分别称量样品放置前重量(H0)和放置后的重量(H1)。保湿能力按照公式(2)计算:

    $$ {\text{保湿性}}(\%)={\rm{H}}_1 \times100/{\rm{H}}_0 $$ (2)
    1.3.3   抗氧化能力测定

    (1) DPPH自由基清除能力。将维生素C和三七多糖各待测组分用蒸馏水配置成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL浓度的样液测定时,在96孔板中加入2×10-4 mol/L的DPPH乙醇溶液100 μL,然后加入100 μL待测液,摇匀后,在室温,黑暗处放置30 min,并测定517 nm处的吸光度值At,用乙醇代替DPPH溶液测定本底吸光度值Ar,用超纯水代替样品溶液测得参比溶液吸光度A0[16]。采用Vc作为阳性对照,同一测定设计3个平行,清除率按公式(3)计算:

    $$ {\rm{DPPH}}{\text{自由基清除率}}(\%)=[1-({\rm{A}}_{\rm{t}}-{\rm{A}}_{\rm{r}})/{\rm{A}}_0]\times100 $$ (3)

    (2) ABTS+自由基清除能力。将5 mL的7 mmol/L ABTS和88 μL的140 mmol/L K2S2O8混合,常温避光条件下静置过夜(12 h),形成ABTS+自由基储备液。使用前用无水乙醇稀释成在734 nm波长下的吸光度为0.7±0.02工作液[17]。测定时,在96孔板中加入ABTS+工作液100 μL和100 μL待测液,振荡混匀,10 min后测定反应液在734 nm处的吸光值At,用乙醇代替ABTS+工作液测定本底吸光度值Ar,用超纯水代替样品溶液测得参比溶液吸光度A0。采用Vc作为阳性对照,同一测定设计3个平行,清除率由公式(4)计算:

    $$ {\rm{ABTS}}^+{\text{自由基清除率}}(\%)=[1-({\rm{A}}_{\rm{t}}-{\rm{A}}_{\rm{r}})/{\rm{A}}_0]\times100 $$ (4)

    (3) 羟基自由基清除能力。配置2.25 mmol/LFeSO4水溶液、9 mmol/L水杨酸乙醇溶液,分别取50 μL加入96孔板,取50 μL待测液加入,再加入50 μL 8.80 mmol/L H2O2溶液,37 ℃反应30 min,测定510 nm处吸光度At。用超纯水代替H2O2测得对应待测溶液的本底吸光度值Ar,用超纯水代替待测液测得参比溶液吸光度A0[18]。采用Vc作为阳性对照,同一测定设计3个平行,清除率由公式(5)计算:

    $$ {\text{羟基自由基清除率}}(\%)=[1-({\rm{A}}_{\rm{t}}-{\rm{A}}_{\rm{r}})/{\rm{A}}_0]\times 100 $$ (5)

    1 000 g三七药渣采用经水提醇沉法,共提取到34.97g CPPN,得率为3.49 %。采用DEAE Sepharose Fast Flow对CPPN进行纯化,以超纯水、0.1、0.2、0.3 M NaCl溶液洗脱,共得到4个洗脱峰(洗脱曲线见图1),得率分别为27.68%、11.89%、15.41%、21.04%,对CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的含量测定结果如表1所示。

    图  1  DEAE Sepharose Fast Flow洗脱曲线
    Figure  1.  Elution curve with DEAE Sepharose Fast Flow
    表  1  三七多糖的含量测定结果(%)
    Table  1.  Determined the contents of Panax notoginseng polysaccharide(%)
    样品中性糖含量糖醛酸含量总糖含量
    CPPN 32.4 36.25 68.65
    NPPN 73.33 - 73.33
    APPNⅠ 48.33 27.5 75.83
    APPNⅡ 21.67 57.92 79.59
    APPNⅢ 13.75 79.58 93.33
    注:总糖含量 = 中性糖含量 + 糖醛酸含量。
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    在RH43%环境中,水分的含量随时间的变化结果如图2所示,三七多糖及各组分的吸湿率均逐渐上升,吸湿率大小依次为甘油>APPNⅢ>海藻酸钠>CPPN>APPNⅡ>APPNⅠ>NPPN,36 h时,吸湿率分别为37.21%、25.50%、23.55%、19.10%、18.43%、16.99%、13.20%。从图3可以看出,在高湿度(RH81%)环境中,在0~12 h,CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿率上升较快,12 h~36 h变化缓慢,36 h时,吸湿率大小为甘油>APPNⅢ>海藻酸钠>APPNⅡ>APPNⅠ>CPPN>NPPN,吸湿率大小依次为83.57%、42.58%、39.76%、30.81%、27.80%、24.59%、20.80%。由两图对比显示,APPNⅢ在高湿度和低湿度下都具有良好的吸湿性,其吸湿性高于海藻酸钠。

    图  2  三七多糖在RH43%环境中的吸湿率变化情况
    Figure  2.  Relationship between moisture retention rate and time
    图  3  三七多糖在RH81%环境中的吸湿率变化情况
    Figure  3.  Relationship between moisture retention rate and time

    保湿性考察实验结果如图4,在干燥硅胶环境中,CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ、甘油和海藻酸钠保湿率均持续下降,保湿率大小依次为APPNⅢ>海藻酸钠>CPPN>APPNⅡ>甘油>APPNⅠ>NPPN,在36 h时,保湿率分别为45.64%、40.35%、38.40%、36.15%、35.38%、34.35%、33.59%。

    图  4  三七多糖在干硅胶环境中的保湿率变化情况
    Figure  4.  Relationship between moisture retention rate and time

    图5可知,CPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ对DPPH均具有较好的清除能力,且呈明显的量效关系,当多糖浓度为8 mg/mL时,CPPN对DPPH自由基的清除效果最好,达58.36%,而NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除率分别为12.90%、50.66%、37.26%、47.71%。抗氧化活性顺序为CPPN>APPNⅠ>APPNⅢ>APPNⅡ>NPPN。艾于杰等[18]发现纯化后的茶多糖清除DPPH清除能力纯化前强于纯化后,推测粗多糖对DPPH的清除作用可能为各组分结合后协同作用。本研究中三七粗多糖清除效果最好,推测其原因为七粗多糖中各组分协同发挥抗氧化作用。

    图  5  三七多糖对DPPH的清除能力
    Figure  5.  Scavening rate of DPPH of Panax notoginseng polysaccharide

    ABTS 可被活性氧氧化,生成蓝绿色的ABTS+自由基,在734 nm 处有特征吸收,当抗氧化剂存在时,自由基被抗氧化剂清除时,蓝绿色会逐渐褪色或消失[19]。三七多糖及纯化后各组分对ABTS+的清除效果图6所示,随着多糖浓度的增大,其清除ABTS+自由基的效果也不断增强。当多糖浓度为8 mg/mL时,CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的清除率分别为95.91%、36.41%、87.37%、68.34%、83.34%,抗氧化活性顺序为CPPN>APPNⅠ>APPNⅢ>APPNⅡ>NPPN。三七粗多糖对ABTS+自由基的清除效果最好,分离纯化得到的4个组分中,APPNⅠ的清除效果较强,NPPN的清除能力较弱。有研究表明,多糖对ABTS+自由基的清除能力与DPPH自由基的清除能力具有一致性[20],本研究中CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ对ABTS+的清除能力与对DPPH自由基清除能力趋势一致。

    图  6  三七多糖对ABTS+的清除能力
    Figure  6.  Scavening rate of ABTS+ of Panax notoginseng polysaccharide

    羟基自由基是机体内攻击性最强的活性氧,多糖是具有多羟基的醛或多羟基的酮,该结构上带有还原性的半缩醛羟基,使自由基被还原,从而阻止自由基进行连锁反应[21]。由图7可知,各浓度的VC对羟自由基的清除率最高,不同浓度的CPPN及纯化后各组分对羟自由基均具有一定的清除作用,随多糖浓度的升高,对羟自由基的清除能力也不断升高,当CPPN浓度为8 mg/mL,CPPN的清除能力为98.95%,与VC接近。同一浓度下,抗氧化活性顺序为CPPN>APPNⅢ>APPNⅡ>APPNⅠ>NPPN。

    图  7  三七多糖对·OH的清除能力
    Figure  7.  Scavening rate of ·OH of Panax notoginseng polysaccharide

    本文采用水提醇沉法成功从三七药渣中提取出三七多糖,并经过DEAE Sepharose Fast Flow对其纯化,成功分离出NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ,并对CPPN、NPPN、APPNⅠ、APPNⅡ、APPNⅢ的吸湿和保湿性能首次初步探究,发现APPNⅢ的吸湿性能优于海藻酸钠,其保湿性能也优于海藻酸钠及常用保湿剂甘油,表明APPNⅢ是一种优良的保湿剂。

    自由基,是生物体新陈代谢的正常产物,在正常的生理状态下,人体内自由基的产生处于动态平衡中,受体内各种内源性抗氧化网络的严格调控。当机体平衡一旦被打破,体内自由基过多时,自由基会引发氧化应激损伤,诱导各种疾病的发生和发展,如炎症、肿瘤等疾病。现有研究表明,诸多植物多糖具有抗氧化活性,如:枸杞多糖[22]、茯苓多糖[23]。多糖的抗氧化活性常与多糖分子量、糖基组成、糖苷键类型、高级结构等相关[18]。三七多糖体外抗氧化活性研究显示:三七粗多糖与分离纯化后的各组分比较,其对三种自由基的清除效果最佳,抗氧化能力最强,推测三七粗多糖中各组分多糖的抗氧化性有协同作用;纯化后的三种酸性多糖的抗氧化活性均强于中性多糖,说明三七多糖的抗氧化性与其酸性基团密切相关。综上,通对三七多糖具有吸湿、保湿性能及体外抗氧化活性,表明三七多糖具有应用于日化行业、保健食品、药品的潜力,为工业三七药渣的综合利用提供了新思路,有利于三七资源的综合利用。

  • 表  1  2组血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平比较($ \bar x \pm s $)

    Table  1.   Comparison of serum levels of anti-HBC,CHE and ApoAI between the two groups($ \bar x \pm s $)

    组别 血清抗-HBC(log10PEIU/mL) CHE(kU/L) 载脂蛋白AI(mg/dL)
    观察组(n = 388) 4.52 ± 0.63 4.09 ± 0.91 102.54 ± 5.95
    对照组(n = 68) 1.12 ± 0.26 10.65 ± 1.73 120.17 ± 6.06
    t −43.822 46.580 22.477
    P < 0.001* < 0.001* < 0.001*
      *P < 0.05。
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    表  2  观察组慢性肝炎患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平比较($ \bar x \pm s $)

    Table  2.   Comparison of serum anti-HBC, CHE, and apolipoprotein AI levels in patients with chronic hepatitis in the observation group($ \bar x \pm s $)

    病情严重程度 血清抗-HBC(log10PEIU/mL) CHE(kU/L) 载脂蛋白AI(mg/dL)
    慢性肝炎轻度(n = 52) 2.13 ± 0.35 9.36 ± 2.62 117.02 ± 2.78
    慢性肝炎中度(n = 56) 3.39 ± 0.68a 6.82 ± 1.68a 113.09 ± 2.51a
    慢性肝炎重度(n = 50) 4.52 ± 0.73ab 3.69 ± 1.83ab 110.02 ± 2.35ab
    F 195.636 95.114 96.410
    P < 0.001* < 0.001* < 0.001*
      与慢性肝炎轻度组比较,aP < 0.05;与慢性肝炎中度比较,bP < 0.05;与慢性肝炎重度比较,cP < 0.05。
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    表  3  观察组不同疾病类型患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI检测阳性例数比较 [n(%)]

    Table  3.   Comparison of the number of cases of positive serum anti-HBC, CHE, and ApoAI tests in patients with different disease types in the observation group [n(%)]

    疾病类型 血清抗-HBC阳性 CHE(kU/L)阳性 载脂蛋白AI阳性
    慢性肝炎轻度(n = 52) 17(32.69) 4(7.69) 13(25.00)
    慢性肝炎中度(n = 56) 21(37.50) 10(17.86) 17(30.36)
    慢性肝炎重度(n = 50) 45(90.00)ab 45(90.00)ab 40(80.00)ab
    肝硬化(n = 166) 142(85.54)ab 151(90.96)ab 147(88.55)ab
    肝癌(n = 64) 48(73.85)ab 58(90.63)ab 42(65.63)ab
      与慢性肝炎轻度组比较,aP < 0.05;与慢性肝炎中度比较,bP < 0.05。
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    表  4  观察组肝硬化不同分级患者血清抗-HBC、CHE、载脂蛋白AI水平($ \bar x \pm s $)

    Table  4.   Serum anti-HBC, CHE, and apolipoprotein AI levels in patients with different grades of cirrhosis in the observation group($ \bar x \pm s $)

    不同分级 血清抗-HBC(log10PEIU/mL) CHE(kU/L) 载脂蛋白AI(mg/dL)
    肝硬化A级(n = 60) 3.32 ± 0.33 5.06 ± 1.01 180.03 ± 10.17
    肝硬化B级(n = 56) 5.39 ± 0.41a 3.29 ± 1.27a 130.01 ± 11.37a
    肝硬化C级(n = 50) 6.15 ± 0.39ab 2.22 ± 0.78ab 100.30 ± 12.37ab
    F 850.166 104.203 709.973
    P < 0.001* 0.013* < 0.001*
      与肝硬化A级比较,aP < 0.05;与肝硬化B级比较,bP < 0.05。
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出版历程
  • 收稿日期:  2024-05-09
  • 网络出版日期:  2024-11-23
  • 刊出日期:  2024-12-31

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