Effect of miR-34a on Proliferation and Osteogenic Differentiation of Human Periodontal Stem Cells
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摘要:
目的 探讨miR-34a对人牙周膜干细胞增殖和成骨分化的影响。 方法 体外分离培养人牙周膜干细胞(hPDLSCs),构建miR-34a的模拟物转染至hPDLSCs中,实验分组为mimics组(miR-34a过表达组)、mimics-NC组(空载组)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检验转染效率、CCK-8检测hPDLSCs在转染后的增殖能力。诱导转染miR-34a的hPDLSCs成骨分化,收集成骨分化后第0天、14d hPDLSCs,qRT-PCR法检测成骨标志Runt相关转录因子2(Runx2)的表达水平、Western blotting法检测Runx2相关蛋白的表达水平、茜素红染色显示矿化结节形成情况。 结果 mimics组的miR-34a表达水平显著高于mimics-NC组(P < 0.05)。第1~5天,mimics组、mimics-NC组的增殖率差异无统计学意义(P > 0.05);第5~11天,mimics组增殖率明显低于mimics-NC组,差异有统计学意义(P < 0.05)。转染miR-34a的hPDLSCs经过成骨诱导后,在第0天和第14天mimics组Runx2的mRNA表达水平均高于mimics-NC组(P < 0.05),mimics组Runx2蛋白表达水平也高于mimics-NC组(P < 0.05),成骨诱导14 d后 mimics组矿化结节多于mimics-NC组。 结论 在体外条件下,miR-34a抑制hPDLSCs的增殖活性,促进人牙周膜干细胞的成骨分化。 Abstract:Objective To investigate the effects of miR-34a on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal stem cells. Methods Human periodontal stem cells (hPDLSCs) were isolated and cultured in vitro, and miR-34a mimetics were constructed and transfected into hPDLSCs. The experimental groups were subsequently categorized into the mimics group (miR-34a overexpression group) and the mimics-NC group (control group without load). The transfection efficiency was assessed using real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR), while CCK-8 assays were used to evaluate the proliferation capacity of hPDLSCs post-transfection. Osteogenic differentiation of miR-34a-transfected hPDLSCs was induced, with samples being collected at day 0 and day 14 after the osteogenic induction. The expression level of Runx2-associated transcription factor 2 (Runx2) was quantified via qRT-PCR, protein levels of Runx2-associated proteins were analyzed through Western blotting, and mineralized nodule formation was examined using alizarin red staining. Results The expression level of miR-34a in the mimics group was significantly higher than that in the mimics-NC group (P < 0.05). There was no significant difference in the value-added rate between the mimics group and the mimics-NC group on days 1~5 (P > 0.05), and the value-added rate between the mimics group and the mimics-NC group was significantly lower than that between the mimics-NC group and the mimics-NC group on days 5~11, and the difference was statistically significant. After the osteogenic induction, the mRNA expression level of Runx2 in the mimics group was higher than that in the mimics-NC group (P < 0.05), and the expression level of Runx2 protein in the mimics group was also higher than that in the mimics-NC group (P < 0.05), and there were more mineralized nodules in the mimics group than in the mimics-NC group after 14 days of osteogenic induction. Conclusion Under in vitro conditions, miR-34a inhibits the proliferative activity of hPDLSCs and promotes the osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells. -
Key words:
- MicroRNA-34a /
- Human periodontal ligament stem cells /
- Proliferation /
- Osteogenesis
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牙周炎是由牙菌斑引发的免疫反应,其典型症状包括牙龈红肿、牙周袋的形成、牙槽骨的逐步丧失,导致牙齿松动、移位,甚至脱落[1]。在牙周治疗后一定程度上能够抑制病原菌群,改善牙周附着水平,但在牙周组织再生和骨质缺损修复仍存在明显的局限性[2−3]。人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)作为牙周组织中的关键干细胞来源,具有自我更新和多向分化潜能。hPDLSCs不仅能够分化为脂肪细胞和骨细胞,还能在成骨分化后促进牙槽骨的重建,从而推动牙周组织的修复和再生[4−5]。hPDLSCs在维持牙周组织稳定性和实现牙周再生方面起着至关重要的作用,因而成为牙周组织工程研究的焦点[6]。miR-34a是一种microRNA,长约20~22个核苷酸的非编码RNA,通过与靶mRNA的3' 端非翻译区(3' -untranslatedregion,3' UTR)结合,在转录后水平调控基因的表达[7]。因其参与细胞生长、凋亡、周期调控和基因表达的调控,备受关注。miR-34a已被证实与多种疾病及生物过程相关,特别是在肿瘤的发生与发展中发挥着关键作用[8−9]。近年来的研究发现,miR-34a在间充质干细胞的成骨分化过程中也发挥了一定的作用[10−11]。目前关于miR-34a在hPDLSC的增殖和成骨分化中的作用机制尚不完全清楚。在hPDLSCs成骨分化过程中,Runx2基因作为一个关键转录因子,起着重要的作用。Runx2被广泛认为是成骨细胞分化的主要标志物之一,它能够激活成骨分化所需的多种下游基因的表达,从而有效促进成骨过程[12]。Runx2基因的表达水平通常被用作评估成骨分化的关键指标,因此本实验旨在通过体外研究miR-34a的过表达对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)增殖及成骨分化过程中Runx2的影响,为牙周组织再生及骨质缺损修复中涉及的分子机制提供新的研究思路,从而为牙周炎的治疗提供实验基础。
1. 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
α-MEM培养基(Gibco,美国);胎牛血清(FBS)(EvaCell,香港);地塞米松、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸(Sigma,上海);茜素红(海星生物,苏州) ;0.25%胰蛋白酶 (Gibco,美国);Tissue Total RNA Isolation Kit(Vazyme,南京);反转录PCR试剂盒(Takara,日本);实时定量PCR试剂盒(Takara,日本);miRNA提取试剂盒 (Tiangen,北京);miRNA反转录试剂盒(Tiangen,北京);miRNA实时定量PCR试剂盒 (Tiangen,北京);miR-34a过表达质粒及其阴性对照物(吉玛公司,上海);LipofectamineTM 2000转染试剂(Thermo Fisher,美国);GAPDH抗体(Affinity Biosciences,美国)和Runx2抗体(Proteintech,武汉);山羊抗兔IgG二抗(Affinity Biosciences,美国);CO2培养箱(Thermo,美国);高速冷冻离心机(Eppendorf,德国);实时荧光定量PCR 仪(Applied Biosystems,美国)。
本实验通过医院伦理委员会批准(KYKQ2022MEC0040)并得到患者的知情同意后,于2022年6月至2024年5月在昆明医科大学附属口腔医院口腔颌面外科收集了10~20岁患者因正畸治疗需要拔除的健康牙齿。
1.2 研究方法
1.2.1 hPDLSCs的分离培养
采用酶解组织块技术对hPDLSCs进行原代培养,并每3 d更换一次培养液含15%胎牛血清、1%青霉素、链霉素的α -MEM)。当细胞数量增加到70%时,进行消化和传代以扩增细胞。
1.2.2 细胞转染
当细胞达到大约70%的融合状态时,采用Lipo2000脂质体进行miRNA的转染,实验分组为mimics组、mimics-NC组,根据实验分组加入各种脂质体与miRNA的混合溶液,转染时丢弃原培养基,采用Opti-MEM无血清培养基,6 h后换用常规培养液持续培养,6 h后通过荧光显微镜下观察转染效率。RT-qPCR法检测细胞中miR-34a的表达水平;引物序列见表1。
表 1 实时定量PCR引物Table 1. Primersof RT-Qpcr基因 引物序列 miR-34a Forward 5' -ACTGGTACTCAGACAACGAGAT-3' Reverse 5' -ACGTCAATGTCCCTGATGTTATG-3' U6 Forward 5' -AAAGCAAATCATCGGACGACC-3' Reverse 5' -GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3' Runx2 Forward 5' -CCGCCTCAGTGATTTAGGGC-3' Reverse 5' -GGGTCTGTAATCTGACTCTGTCC-3' β-actin Forward 5' -TTGTCGCCCTTTTCTACTTTGCC-3' Reverse 5' -CAATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3' 1.2.3 CCK-8法检测细胞增殖活性
以3×103个/孔接种在96孔板中,每组5个复孔,培养24 h(37 ℃,5% CO2)以确保紧贴壁面后转染。每隔2 d换液,分别在转染后 1、3、5、7、9、11 d加入 CCK-8溶液,培养箱中孵育2 h。孵育完成后放入酶标仪测定吸光度 (450 nm)。
1.2.4 hPDLSCs成骨诱导
以3 ×104/mL的密度将hPDLSCs接种到6孔板上,待生长至70%时,转染miR-34a,6 h后使用成骨诱导液(含0.2 mmol/LL-抗坏血酸、10 mmol/Lβ-甘油磷酸盐和10 nmol/L 地塞米松、10%FBS的α -MEM培养液)进行培养。每3 d换一次液。
1.2.5 RT-qPCR法检测成骨相关基因Runx2的mRNA表达水平
转染miR-34a的hPDLSCs经过成骨诱导之后,分别在第0天,14天提取各组总RNA,并将其逆转录为cDNA。使用cDNA作为模板配制反应液,采用RT-qPCR法检测Runx2及β-actin的表达水平。在β-actin作为内参的情况下,使用2-ΔΔCt方法来估算目标基因的相对表达水平。引物的序列见表1。
1.2.6 Western blotting法检测成骨相关蛋白Runx2蛋白表达水平
转染miR-34a的hPDLSCs经过成骨诱导之后,分别在第0天,14 d提取各组总蛋白并测定浓度。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离目的蛋白后转膜。5%脱脂牛奶封闭90 min后,加入一抗,稀释比例为1∶
1000 ,4 ℃孵育过夜。二抗稀释比例为1∶10000 ,室温孵育1 h,TBST漂洗后,曝光显影及灰度值分析。1.2.7 茜素红染色
hPDLSCs在经过转染且成骨诱导14 d后,去除培养基,PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定30 min,然后滴加茜素红染色液染色5 min,PBS洗涤3次,观察形成的矿化结节情况,最后使用软件Image-J进行定量分析。
1.2.8 统计学分析
实验数据采用GraphPad Prism 9.0进行统计学分析,本研究所有实验结果均重复三次,数据使用Shapiro-Wilk法进行数据正态性检验。计量资料服从正态分布采用均值±标准差(Mean ± SD)描述,两组资料间比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 实验结果
2.1 牙周膜干细胞形态学观察
体外培养7 d左右原代细胞从组织块边缘爬出,见图1A。传代后细胞生长加速明显,第1代细胞为麦穗状,并呈漩涡状生长,见图1B。
2.2 脂质体转染效率
取转染后培养6 h 的细胞通过荧光显微镜观察可见mimics组的 hPDLSCs 显示红色荧光,见图2A,表明miRNA已转染进入细胞。通过qRT-PCR检测发现, mimics组miR-34a mRNA的相对表达量显著高于mimics-NC组(P <
0.0001 ),见图2B。2.3 CCK-8法检测细胞增殖活性
CCK-8法检测发现,1~5 d时,mimics组和mimics-NC组的增殖率差异无明显统计学意义(P > 0.05);5~11 d时,mimics组增殖率明显低于mimics-NC组,增殖率差异有统计学意义(P < 0.05),见图3。
2.4 RT-qPCR法检测成骨相关基因Runx2的mRNA表达水平
转染miR-34a的hPDLSCs在成骨第0天和成骨第14天时,成骨相关基因Runx2 的mRNA表达水平mimics组均高于mimics-NC组,差异有统计学意义(P < 0.05),见图4。
2.5 Western blotting法检测成骨相关蛋白Runx2蛋白表达水平
转染miR-34a的hPDLSCs在成骨第0天和成骨第14天时,成骨相关蛋白Runx2 的蛋白表达水平mimics组略高于mimics-NC组,差异有统计学意义(P < 0.05),见图5。
2.6 茜素红染色
茜素红染色结果显示,mimic组显色度高于mimics-NC组,显微镜下观察可见mimic组的矿化结节多于mimics-NC组(图6A)。通过灰度值分析,mimic组的矿化结节多于mimics-NC组,差异有统计学意义(****P <
0.0001 ),见图6B。3. 讨论
hPDLSCs是一类来源于牙周膜的多能干细胞,展现出显著的自我更新能力及多向分化的潜力,被视为牙周组织再生和骨质缺损修复的种子细胞[13],探究hPDLSCs增殖和成骨分化过程中涉及的分子调控机制对促进牙周支持组织再生尤为重要。
3.1 miR-34a瞬时转染和稳定转染的对实验结果的影响
miR-34a是一种微小RNA,在细胞增殖、凋亡和分化等生物学过程中扮演着重要的调控角色[14−15]。在本实验中,hPDLSCs经miR-34a模拟物转染48 h后发现过表达组miR-34a的mRNA的表达量显著升高,表明转染效率符合实验要求。本次实验转染过程采用的是脂质体转染,因其操作简单、转染效率较高、没有免疫原性等优势而被广泛应用,但是在实验操作时应注意其较大的细胞毒性和易被血清清除的特点[16],瞬时转染因miR-34a目标基因并没有进入hPDLSCs的染色体,只能在短时间内获得基因表达产物,效果维持不如慢病毒等永久转染,在后续研究miR-34a在hPDLSCs增殖和成骨分化的具体信号通路和更深入机制研究中,永久转染可能更为准确。
3.2 miR-34a对hPDLSCs增殖能力的影响
本次实验发现miR-34a的上调后,从第3天开始,抑制了hPDLSCs的增殖能力,与吴雪[17]发现miR-34a上调对牙周膜细胞增殖一直具有抑制增殖的作用稍有不同,这可能与瞬时转染后开始CCK-8检测的时间点稍有不同,本实验是转染后24 h开始检测,转染早期可能增殖抑制表现还不明显,但5 d以后mimics组增殖抑制逐渐明显。本结果表明miR-34a在hPDLSCs增殖过程中有负调节的趋势。有研究发现miR-34a通过与细胞周期调控相关的基因和信号通路相互作用,如p53、CDK4、CDK6等,来调控细胞增殖[18−19]。miR-34a对hPDLSCs增殖的调控的具体机制还有待进一步深入研究。
3.3 miR-34a对hPDLSCs成骨分化能力的影响
Runx2是骨特异性转录因子,在促进成骨分化中发挥重要作用,其表达水平能够反映干细胞向骨细胞转化的进程,同时,其蛋白质水平也受到微小RNA的调控[20]。本研究结果显示,miR-34a的上调促进了hPDLSCs的成骨分化能力。与Krzeszinski JY等研究发现miR-34a可以通过抑制破骨前体细胞的破骨分化作用来促进机体成骨的研究结果一致[21]。但与程孟文等研究发现在体外条件下,miR-34a抑制人牙周膜细胞成骨向分化研究结果相反[22]。miR-34a对hPDLSCs和hPDLCs对成骨分化的不同作用可能与不同信号调控通路、不同细胞来源、不同细胞种类之间的差异有关系。有研究[23−24]报道miR-34a可能通过调节与成骨分化相关的信号通路和靶蛋白,如Wnt/β-catenin、BMP/Smad、Runx2等,来影响hPDLSCs的成骨分化。早在2014年有研究指出miR-34a通过靶向人类间充质干细胞(hMSC)中的JAG1下调Notch信号,对细胞的成骨分化产生抑制[25],进而将miR-34a与骨代谢联系在一起。本次所选成骨标志Runx2参与Notch信号通路、Wnt信号通路等多种信号通路调控成骨过程,是调节成骨细胞分化和成骨细胞成熟的重要细胞转录因子[26]。但miR-34a对hPDLSCs成骨分化调控具体机制尚不完全清楚。
miR-34a对hPDLSCs增殖和成骨分化的调节作用可能涉及多种信号通路和靶蛋白的调控。本实验研究结果提示miR-34a在牙周组织再生中可能具有重要的应用潜力,但miR-34a的作用机制尚未完全阐明,还需要进一步深入研究其调节作用的分子机制和信号通路。此外,miR-34a在hPDLSCs体内实验仍需进一步验证,当hPDLSCs处于不同的微环境时,miR-34a对hPDLSCs增殖和分化的调节作用是否一致也需进一步研究。
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表 1 实时定量PCR引物
Table 1. Primersof RT-Qpcr
基因 引物序列 miR-34a Forward 5' -ACTGGTACTCAGACAACGAGAT-3' Reverse 5' -ACGTCAATGTCCCTGATGTTATG-3' U6 Forward 5' -AAAGCAAATCATCGGACGACC-3' Reverse 5' -GTACAACACATTGTTTCCTCGGA-3' Runx2 Forward 5' -CCGCCTCAGTGATTTAGGGC-3' Reverse 5' -GGGTCTGTAATCTGACTCTGTCC-3' β-actin Forward 5' -TTGTCGCCCTTTTCTACTTTGCC-3' Reverse 5' -CAATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3' -
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