miR-212-3p Targeted Regulation of NAP1L1 Inhibits Glioma Cell Proliferation，Migration and EMT
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摘要:
目的 探究miR-212-3p在胶质瘤细胞增殖、侵袭和上皮-间充质转化（EMT）中的分子机制。 方法 RT-qPCR用于衡量胶质瘤细胞中miR-212-3p和NAP1L1表达，构建NC mimic、miR-212-3p mimic、oe-NC和oe-NAP1L1转染至细胞中，利用CCK-8 、Transwell和伤口实验评估细胞生物学行为。通过Western blot分析EMT相关标志物的蛋白表达。miR-212-3p与NAP1L1的关系通过双荧光素酶报告基因和AgO2-RIP实验进行证实。 结果 miR-212-3p的表达水平在胶质瘤细胞中显著下调（P < 0.0001 ），过表达miR-212-3p 可以显著降低胶质瘤细胞增殖（P <0.0001 ）、侵袭（P =0.0011 ）和迁移能力（P <0.0001 ），并且抑制了EMT标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）（P =0.000861 ）和波形蛋白（Vimentin）（P =0.007430 ）的表达，而上调了E-钙黏蛋白（E-cadherin）（P <0.0001 ）的表达。miR-212-3p靶向负调控NAP1L1的表达。过表达NAP1L1逆转了miR-212-3p对胶质瘤细胞增殖（P <0.0001 ）、迁移（P <0.0001 ）和EMT（P <0.0001 ）的抑制作用。结论 miR-212-3p通过靶向负调节NAP1L1的表达抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和EMT。 -
关键词:
- 胶质瘤 /
- miR-212-3p /
- NAP1L1 /
- 上皮-间充质转化 /
- 细胞增殖
Abstract:Objective To explore the molecular mechanism of miR-212-3p in glioma cell proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition （EMT）. Methods The expression of miR-212-3p and NAP1L1 were detected by RT-qPCR in glioma cells. NC mimic, miR-212-3p mimic, oe-NC and oe-NAP1L1 were built and transfected in cells. CCK-8, Transwell and wound healing assay were used to evaluate the cell biological behaviour. Western blot was used to detect the expression of EMT-related biomarkers. The relationship between miR-212-3p and NAP1L1 was confirmed by the dual-luciferase reporter gene and AgO2-RIP assay. Results miR-212-3p was lowly expressed in glioma cells （P < 0.0001 ）. miR-212-3p mimic significantly inhibited the glioma cell proliferation （P <0.0001 ）, invasion （P =0.0011 ） and migration （P <0.0001 ）, and reduced the expression of EMT-related biomarkers N-cadherin （P =0.000861 ） and Vimentin （P =0.007430 ）, while upregulating the expression of E-cadherin （P <0.0001 ）. miR-212-3p targeted and negatively regulated the NAP1L1 expression. Overexpression of NAP1L1 reversed the inhibitory effects of miR-212-3p on glioma cell proliferation （P <0.0001 ）, migration （P <0.0001 ）, and EMT （P <0.0001 ）.Conclusion miR-212-3p inhibits the glioma cell proliferation, migration and EMT by targeting the negative regulation of NAP1L1 expression. -
Key words:
- Glioma /
- miR-212-3p /
- NAP1L1 /
- Epithelial-mesenchymal transition /
- Cell proliferation
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胶质瘤（Glioma）是脑部最常见的恶性肿瘤，伴随着较高的死亡率和发病率[1]。胶质瘤细胞具有侵袭能力强，肿瘤微环境复杂，特异性高等特点，造成临床手术治疗、化疗等方法的效果不佳等现象[2]。因此，发现新的潜在的治疗靶点对于胶质瘤的治疗和诊断十分迫切。
MicroRNA（miRNA）是1种长度约为22 nt的非编码 RNA，在各种细胞中发挥其生物学功能[3]。许多研究已经表明，miRNA通过调节各种细胞的发展过程，在各种人类疾病发挥重要作用，包括恶性肿瘤[4]、糖尿病[5]和心肌梗死[6]等。在胶质瘤中，已发现miR-500a-5p[7]，miR-141[8]和miR-106a[9]等参与调节胶质瘤细胞的增殖，侵袭和凋亡过程，进而影响胶质瘤的进展。miR-212-3p已被证实在多种癌症中具有抑癌作用，miR-212-3p过表达可以抑制膀胱癌细胞增殖、促进细胞凋亡[10]。然而，miR-212-3p在治疗胶质瘤中的功能机制并未完全明了。miRNA通过调节不同靶基因的表达充分发挥其生物学功能，在卵巢癌中发现，miR-212-3p通过直接靶向负调控MAP3K3的表达，有效地抑制了卵巢癌的进展，并与患者预后相关[11]。近年来，越来越多的研究报道，核小体组装蛋白1样蛋白1 （nucleosome assembly protein 1-like protein 1，NAP1L1）是1种潜在的致癌基因之一，异常表达于多种肿瘤细胞中，促进了癌细胞的分化和侵袭能力[12]。NAP1L1在结直肠癌中高水平表达，敲除NAP1L1可以有效的抑制结直肠癌细胞的恶性进展[13]。在肝细胞癌中，靶向调控NAP1L1被报道可以抑制细胞的恶性生物学行为，已成为治疗肝细胞癌的潜在靶点[14]。因此，本研究旨在阐明miR-212-3p和NAP1L1在胶质瘤细胞恶性增殖和侵袭中的作用机制，为胶质瘤的临床诊断和治疗提供新的潜在靶点与策略。
1. 材料与方法
1.1 细胞与培养
通过中国上海细胞库获得了人星形胶质细胞（NHA，BFN60808805），人胶质瘤细胞系H4（CL-0087）、A172（CL-0012）、LN229（CL-0578）、U87 （CL-0238）和U251（CL-0237）均购买于武汉普诺赛生命科技有限公司，购买的细胞通过含10%胎牛血清（FBS；A5669701，Thermo Fisher Scientific），1%双抗（Sigma-Aldrich）的DMEM细胞培养液（Sigma-Aldrich，MO，USA）进行培养。将其置于含5%CO2的细胞恒温（37 ℃）培养箱内孵育培养，当细胞长满培养皿的80%～90%时进行传代培养。
1.2 细胞转染
取出培养好的U87 和 U251细胞按照1×105/孔的浓度转移到24孔板内，构建NCmimic、miR-212-3p mimic、oe-NC和oe-NAP1L1，利用Lipofectamine 3000试剂（Invitrogen，Grand Island，NY，USA）将其分别转染到细胞中，参照试剂厂家的说明书，在无菌环境下严格进行细胞转染实验，结束实验后，将其置于含5% CO2的细胞恒温（37 ℃）培养箱内孵育48 h，取出细胞利用RT-qPCR评估转染成功与否。
1.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测
收集实验所需的各组细胞，细胞的RNA提取则是利用TRIzol试剂（Invitrogen），然后采用One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Kyoto，Japan）试剂盒，按照试剂盒操作步骤将RNA反转录合成单链互补DNA（cDNA），最后严格通过SYBR Green PCR Master Mix（Life Technologies，CA，USA）试剂盒进行实验，并检测mRNA水平。笔者分别以GAPDH和U6用作基因和miRNA内参，并使用2-ΔΔCt方法[15]计算相对表达量。本实验所用的所有引物序列见表1。
表 1 PCR引物序列Table 1. PCR primer sequences基因 引物 序列（5'-3'） miR-212-3p forward 5'-GCGCGTAACAGTCTCCAGTC -3' reverse 5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT -3' U6 forward 5'-CAAATTCGTGAAGCGTTCCA-3' reverse 5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3' NAP1L1 forward 5'-GGCAGACATTGACAACAA-3' reverse 5'-TTCCTCCGAAATCTCATC-3' GAPDH forward 5'-TGACCACAGTCCATGCCATCAC-3' reverse 5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3' 1.4 结合序列查询
检索中山大学开发的RNA信息网站Starbase （https://starbase.sysu.edu.cn/）。
1.5 双荧光素酶报告基因
将含有miR-212-3p结合位点的NAP1L1-3'UTR克隆到荧光素酶基因上游的pGL3-Basic载体（Promega，WI，USA）中，生成野生型（wild-type，WT）重组荧光素酶报告质粒。按双萤光素酶报告基因检测试剂盒（碧云天，北京，China）说明书将报告基因细胞充分裂解，
10000 ～15000 r/min离心3～5 min，取上清。按照厂家试剂盒说明书进行实验，并通过多功能酶标仪测定，最后将海肾萤光素酶作为内参，RLU值是通过萤火虫萤光素酶检测获得的，将其与海肾萤光素酶检测获得的RLU值作比值。1.6 AgO2实验
将NC mimics、miR-212-3p mimic分别转染到细胞中，孵育24 h后，利用Magna RIP RNA试剂盒（17-700，Millipore，Burlington，MA，USA），按照之前[16]描述的方法对U251细胞进行RIP分析。采用SYBR Green PCR mix（QIAGEN）实时PCR检测argonaut-2蛋白（AGO2）或IgG免疫沉淀中的miR-212-3p水平；IgG作为阴性对照。
1.7 生存率预测
NAP1L1在胶质瘤中的生存率预测通过检索PrognoScan网站（http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html）。通过GSE4412-GPL96数据集预测NAP1L1在胶质瘤中的生存率，总样本数为74例。
1.8 CCK-8实验
通过北京碧云天生物技术公司获得了CCK-8分析试剂盒，进行细胞增殖水平检测。收集各组处理后的细胞按3×103个/孔的浓度分别迅速的加入96孔板中，按照试剂盒说明书进行操作，每组需要设置6个重复孔。按要求进行实验后，弃去原培养液，加入新的100 μL细胞培养液后，再加入10 μL CCK-8溶液，于37℃避光孵育1～3 h。使用酶标仪在450 nm处测量所有吸光度值。
1.9 Transwell检测细胞侵袭
取各组对数生长期的细胞，侵袭实验在Transwell小室（Corning ，USA）中进行，各组细胞用无血清DMEM培养基调整浓度为1×105个/mL。将Transwell小室上室中均匀涂满Matrigel，然后吸取200 μL细胞悬液到上室中。吸取600 μL含10%FBS的DMEM细胞培养液到24孔板下室中，等待培养24 h结束后，通过结晶紫染色（Solarbio，China）加入下室细胞进行染色，于倒置显微镜下（CKX53，OLYMPUS，Japan）观察每个孔内固定位置的细胞数量，并选取5个视野进行计数拍照，计算平均值。
1.10 划痕实验
收集各组处理后的细胞，以2.5×105个/孔的浓度均匀迅速吸取到24孔板中，然后将其放于细胞恒温（37 ℃）培养箱内孵育，观察细胞生长到90%以上的密度时，采用无菌枪头进行划痕后，加入PBS缓慢清洗掉多余细胞，加入不含FBS的DMEM细胞培养液，并利用倒置显微镜拍照记录，再放入细胞恒温培养箱内24 h后，再次进行拍照记录，采用Image J进行分析。
1.11 蛋白印迹法分析（Western blot）
收集各组细胞后，并提取总蛋白，用10% SDS-PAGE凝胶进行分离后，通过湿转到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（Millipore，MA，USA）。置于常温下，加入5%脱脂牛奶放于摇床上2 h进行封闭膜，清洗后加入一抗，并将其放于4 ℃冰箱中孵育过夜，第2天取出后加入HRP conjugated二抗（1∶
2000 ，cat.no.ab205718，Abcam，UK），置于常温1 h。用化学发光法观察蛋白质。anti-GAPDH抗体（1∶1000 ，cat.no.ab181602，Abcam，UK）为对照。使用ECL化学发光液显影（BD Biosciences），化学发光仪进行曝光和观察，使用Image J进行蛋白条带分析。本实验中所有的一抗信息如下：Anti-N-cadherin （1∶1000 ，ab76011，Abcam，UK），Anti-E-cadherin （1∶1000 ，ab40772，Abcam，UK），Anti-Vimentin （1∶1000 ，ab92547，Abcam，UK）。1.12 统计学处理
所有研究数据都采用平均值±标准偏差（$\bar x \pm s $）表示。数据分析和统计图是通过Graphpad Prism 8完成的，2组间的比较采用t检验（T tests），超过2组则通过单因素方差分析（One-way ANOVA）进行分析。P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 miR-212-3p在胶质瘤细胞中低表达
首先，通过RT-qPCR衡量了5株胶质瘤细胞中miR-212-3p的mRNA表达水平，将正常人星形胶质细胞（normal human astrocyte，NHA）作为对照组，发现miR-212-3p在5株细胞（H4、A172、LN229、U87和U251）中的表达水平均呈现低表达趋势，尤其是U87和U251细胞中最为显著（P <
0.0001 ），见图1，因此后续实验将选择U87和U251 2株细胞进一步探讨miR-212-3p在胶质瘤中的作用机制。
图 1 miR-212-3p在胶质瘤细胞中低表达与NHA组比较，***P < 0.001。Figure 1. Low expression of miR-212-3p in glioma cells2.2 miR-212-3p抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和EMT
为了明确miR-212-3p在胶质瘤中的作用机制，将NC-mimic和miR-212-3p mimic转染至U87和U251细胞中，并用RT- qPCR分析转染是否成功，见图2A，与NC组相比，NC-mimic组差异无统计学意义，而miR-212-3p mimic组中miR-212-3p的表达水平显著升高（P =
0.0006 ），提示转染成功。通过CCK-8检测细胞增殖活力，与NC组相比，NC-mimic组差异无统计学意义，而miR-212-3p mimic组显著抑制了U87和U251细胞增殖（P <0.0001 ），见图2B。侵袭和划痕实验进一步表明，与NC组和NC-mimic组相比，miR-212-3p mimic组显著降低了细胞侵袭能力（P =0.0011 ），见图2C，和迁移能力（P <0.0001 ），见图2D。Western blot结果提示，与NC组和NC-mimic组比较，miR-212-3p mimic组中N-cadherin（P =0.000861 ）和Vimentin（P =0.007430 ）的表达被显著抑制，而E-cadherin的表达显著上调（P <0.0001 ），见图2E，该结果表明过表达miR-212-3p抑制了U87和U251细胞增殖，侵袭和迁移，以及EMT。
图 2 miR-212-3p抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和EMTA：RT- qPCR检测miR-212-3p转染效率；B：CCK-8分析；C：Transwell评估细胞侵袭；D：伤口愈合实验评估细胞迁移；E：Western blot分析EMT相关标志物的表达（N-cadherin、E-cadherin和Vimentin）的蛋白水平。与NC组比较，**P < 0.01，***P < 0.001。Figure 2. miR-212-3p inhibits glioma cell proliferation，migration and EMT2.3 miR-212-3p靶向调控NAP1L1的表达
利用生物信息学网站Star Base预测了miR-212-3p与NAP1L1的结合序列，结果表明，NAP1L1包含miR-212-3p的靶向结合位点，见图3A。进一步通过双荧光素酶基因报告与AgO2-RIP验证miR-212-3p与NAP1L1的靶向关系，双荧光素酶结果显示，将miR-212-3p mimic与NAP1L1-MUT（NAP1L1突变型）、NAP1L1-WT（NAP1L1野生型）共转染至细胞中后，敲高miR-212-3p后显著抑制了NAP1L1-WT载体的双荧光素酶活性（P <
0.0001 ），而对NAP1L1-MUT无显著影响（P =0.8386 ），见图3B。AgO2-RIP结果显示，以IgG组作为阴性对照，将miR-212-3p mimic转染至U251细胞中，对AgO2进行免疫纯化（immuno-purification，IP），在沉淀AgO2蛋白来源的RNA中进行NAP1L1的RIP测定，过表达miR-212-3p中NAP1L1表达上调（P <0.0001 ），见图3C。综上结果表明，miR-212-3p与NAP1L1之间相互作用。生存率预测结果如图3D所示，NAP1L1在胶质瘤患者中具有较好的预测结果。进一步通过RT-qPCR检测细胞中NAP1L1的表达，发现与NC组和NC-mimic组相比，miR-212-3p mimic组显著下调了NAP1L1的表达水平（P <0.0001 ），见图3E。以上结果表明，miR-212-3p靶向负调控NAP1L1的表达。
图 3 miR-212-3p靶向调控NAP1L1的表达A：miR-212-3p与NAP1L1的结合序列；B：双荧光素酶基因报告验证miR-212-3p与NAP1L1的靶向关系；C：AgO2-RIP检测miR-212-3p与NAP1L1的关系；D：生存率预测，high-risk样本33例，low-risk样本41例，P-value=0.023500；E：RT-qPCR检测细胞中NAP1L1的表达；与NC-mimic组比较，***P < 0.001。Figure 3. miR-212-3p targets and regulates NAP1L1 expression2.4 miR-212-3p通过下调NAP1L1抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和EMT
为了进一步阐明miR-212-3p和NAP1L1在胶质瘤中的具体作用机制，笔者将oe-NC和oe-NAP1L1进一步共转染至细胞内，并利用RT-qPCR评估转染时是否成功，见图4A，与NC组比较，oe-NC组无统计学意义（P >
0.9999 ），而oe-NAP1L1组NAP1L1的表达水平显著升高（P <0.0001 ），提示转染成功。共转染后进一步检测U87和U251细胞中NAP1L1的表达水平，与NC组比较，miR-212-3p mimic组显著降低了NAP1L1的表达（P <0.0001 ），与miR-212-3p mimic组相比，miR-212-3p mimic +oe-NAP1L1组NAP1L1的表达水平显著升高（P <0.0001 ），见图4B。CCK-8结果显示，与NC组相比，miR-212-3p mimic显著抑制细胞增殖（P <0.0001 ），而共转染oe-NAP1L1后显著促进细胞增殖（P <0.0001 ），见图4C。侵袭和划痕实验进一步证明，miR-212-3p mimic对U87和U251细胞侵袭（P =0.0001 ）和迁移（P <0.0001 ）的抑制作用，被共转染oe-NAP1L1回复，促进了细胞侵袭（P =0.0061 ）和迁移（P <0.0001 ），见图4D～4E。最后Western blot检测结果表明，miR-212-3p mimic组中N-cadherin（P <0.0001 ）和Vimentin（P =0.0048 ）的表达降低，而E-cadherin的表达升高（P <0.0001 ），同样均被过表达NAP1L1逆转，miR-212-3p mimic+oe-NAP1L1组中N-cadherin（P =0.0003 ）和Vimentin（P =0.0224 ）的表达显著增加，而E-cadherin的表达显著减少（P =0.011885 ），见图4F。以上结果表明，NAP1L1回复了过表达miR-212-3p对胶质瘤细胞增殖、迁移和EMT的抑制作用。
图 4 miR-212-3p通过下调NAP1L1抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和EMTA：RT- qPCR检测NAP1L1转染效率；B：RT- qPCR检测NAP1L1的表达；C：CCK-8分析；D：Transwell评估细胞侵袭；E：伤口愈合实验评估细胞迁移；F：Western blot检测N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的蛋白水平。与NC组比较，**P < 0.01，***P < 0.001；与miR-212-3p mimic组比较，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。Figure 4. miR-212-3p inhibits glioma cell proliferation，migration and EMT through down-regulation of NAP1L13. 讨论
众所周知，胶质瘤是1种最具侵袭性和致死率的人类脑部癌症，并且被发现癌细胞容易扩散到其他脑组织，患者往往会产生严重的不良预后[17]。目前，胶质瘤患者的治疗仍局限于手术切除和化疗辅助，然而患者治疗后的生存率依旧很不乐观[18]。因此，进一步阐明胶质瘤细胞的高度侵袭和迁移的分子机制，寻找有效的、新的生物标志物有助于胶质瘤患者的早期诊断、指导治疗、预测预后和监测疾病进展。
目前尚未确定特定的生物标志物可以广泛应用于胶质瘤的诊断和治疗，各种不同类型的胶质瘤可能具有不同的生物标志物，miRNA被认定为与胶质瘤相关，并可能用作诊断和预后评估的标志物[19]。miRNA是大小约为22 nt的短链非编码RNA，通过调节靶基因mRNA的转录和翻译，在肿瘤中既可能发挥促进作用，也可能发挥抑制作用[20]。许多研究关注于miRNA在胶质瘤中的作用机制，例如miR-29a[21]和miR-200c[22]被发现在胶质瘤组织中的表达显著降低，可作为胶质瘤的抑癌因子。本研究中，笔者在胶质瘤细胞系中发现miR-212-3p呈低表达，因此推测miR-212-3p在胶质瘤中可能具有抑癌作用。先前研究已证实miR-212-3p在多种癌症中发挥抑癌作用，在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）中，miR-212-3p可以抑制细胞增殖和侵袭，促进细胞凋亡[23]。笔者的研究结果表明miR-212-3p抑制了胶质瘤细胞增殖和侵袭，以及EMT。EMT是肿瘤恶性发展的重要调控过程，EMT的特征包括上皮标志物的减少，间质标志物的增加以及细胞外基质降解酶的表达增加。这种转变使得肿瘤细胞从紧密连接的上皮态转变为间质态，增强了其迁移、浸润和转移的能力[24]。在胶质瘤中，EMT被认为与肿瘤的侵袭性生长、血管生成、免疫逃逸以及耐药性等多种重要生物学过程相关[25]。Chen等[26]的研究也证实，miR-212-3p通过下调靶基因结缔组织生长因子（connective tissue growth fact，CTGF）来抑制细胞侵袭和EMT，发挥了重要的抗肝细胞癌作用。因此，寻找miR-212-3p的靶基因，进一步明确其在胶质瘤中的功能机制至关重要。
核小体组装蛋白1样1（nucleosome assembly protein 1-like 1，NAP1L1）被报道在多种组织中表达，在细胞增殖、迁移和分化中具有关键的调节作用[27]。NAP1L1促进肝细胞癌细胞增殖并导致化疗耐药性[28]。已有研究证实NAP1L1是miR-532-5p的靶基因，miR-532-5p通过直接下调NAP1L1的表达抑制肾癌细胞增殖[29]。然而，miR-212-3p与NAP1L1的关系尚未清楚。在本研究中，进一步预测与证实NAP1L1是miR-212-3p的靶基因，且发现NAP1L1在胶质瘤患者中具有较好的生存预测效果。NAP1L1被证实是胶质瘤细胞增殖的促进剂，肌球蛋白重链9（myosin heavy chain 9，MYH9）通过与NAP1L1相互作用，促进神经胶质瘤细胞增殖和对替莫唑胺的耐药性[30]。Chen等[31]也证实NAP1L1在胶质瘤中的表达增强，敲除 NAP1L1在体内外抑制胶质瘤细胞的增殖。在本研究中，发现miR-212-3p靶向负调控NAP1L1的表达，miR-212-3p对胶质瘤细胞增殖、迁移和EMT的抑制作用，均被过表达NAP1L1逆转。
综上所述，miR-212-3p和NAP1L1在胶质瘤细胞恶性进展中都具有关键的调节作用，miR-212-3p通过靶向负调控NAP1L1在胶质瘤中发挥了抑制细胞增殖、迁移和EMT的作用，本研究结果表明miR-212-3p通过靶向负调控NAP1L1可能是胶质瘤的潜在生物标志物。但由于胶质瘤的分类较多，胶质瘤细胞的恶性发展复杂，仍需要进一步的研究来验证这些潜在的生物标志物，并确定其在临床实践中的可靠性和有效性。我们仍然需要更多的研究来识别和验证特定的生物标志物，并将其与现有的诊断和治疗策略相结合，以改善胶质瘤患者的管理和结果。
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图 1 miR-212-3p在胶质瘤细胞中低表达
与NHA组比较，***P < 0.001。
Figure 1. Low expression of miR-212-3p in glioma cells
图 2 miR-212-3p抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和EMT
A：RT- qPCR检测miR-212-3p转染效率；B：CCK-8分析；C：Transwell评估细胞侵袭；D：伤口愈合实验评估细胞迁移；E：Western blot分析EMT相关标志物的表达（N-cadherin、E-cadherin和Vimentin）的蛋白水平。与NC组比较，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 2. miR-212-3p inhibits glioma cell proliferation，migration and EMT
图 3 miR-212-3p靶向调控NAP1L1的表达
A：miR-212-3p与NAP1L1的结合序列；B：双荧光素酶基因报告验证miR-212-3p与NAP1L1的靶向关系；C：AgO2-RIP检测miR-212-3p与NAP1L1的关系；D：生存率预测，high-risk样本33例，low-risk样本41例，P-value=0.023500；E：RT-qPCR检测细胞中NAP1L1的表达；与NC-mimic组比较，***P < 0.001。
Figure 3. miR-212-3p targets and regulates NAP1L1 expression
图 4 miR-212-3p通过下调NAP1L1抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和EMT
A：RT- qPCR检测NAP1L1转染效率；B：RT- qPCR检测NAP1L1的表达；C：CCK-8分析；D：Transwell评估细胞侵袭；E：伤口愈合实验评估细胞迁移；F：Western blot检测N-cadherin、E-cadherin和Vimentin的蛋白水平。与NC组比较，**P < 0.01，***P < 0.001；与miR-212-3p mimic组比较，#P < 0.05，##P < 0.01，###P < 0.001。
Figure 4. miR-212-3p inhibits glioma cell proliferation，migration and EMT through down-regulation of NAP1L1
表 1 PCR引物序列
Table 1. PCR primer sequences
基因 引物 序列（5'-3'） miR-212-3p forward 5'-GCGCGTAACAGTCTCCAGTC -3' reverse 5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT -3' U6 forward 5'-CAAATTCGTGAAGCGTTCCA-3' reverse 5'-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3' NAP1L1 forward 5'-GGCAGACATTGACAACAA-3' reverse 5'-TTCCTCCGAAATCTCATC-3' GAPDH forward 5'-TGACCACAGTCCATGCCATCAC-3' reverse 5'-CGCCTGCTTCACCACCTTCTT-3' 
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