甲基苯丙胺（Methamphetamine，Meth）具有强效的成瘾性，在全世界范围内滥用，严重损害社会秩序和身体健康^[1]。反复摄入Meth会对中枢神经系统造成众多负面影响，长期滥用Meth会激活胶质细胞，使炎症介质和毒性分子过度积累诱导神经毒性，同时改变大脑的结构和功能，导致大脑的认知功能发生障碍^[2]。海马对药物成瘾的调节受到广泛关注，海马体在调节药物相关行为的联想记忆中起重要作用，而这些行为可能会在药物再次暴露时引起复发^[3]。已有众多研究发现Meth滥用会导致海马结构和功能发生改变，诱导神经炎症的发生。神经炎症会改变神经元的兴奋性、可塑性，引发星形胶质细胞功能障碍，血脑屏障通透性受损和神经变性等一系列的过程，最终可能导致抑郁、精神障碍和认知障碍等神经精神疾病的发生^[4-5]。Toll样4受体（Toll like receptor 4，TLR4）作为一个跨膜识别受体，主要是通过MyD88途径在免疫和炎症中发挥关键作用^[6]。肿瘤坏死因子受体相关因子6 （Tumor necrosis factor receptorassociated factor 6，TRAF6）和磷酸化的NF-κB抑制因子（Inhibitor of NF-κB，IκB）是TLR4的下游蛋白，是炎症反应的进程和NF-κB转导过程中的重要调控因子^[7-8]。NF-κB的活性程度与机体炎症反应的发生和众多生理功能的形成密切相关，其中p65是NF-κB的主要活性亚单位^[9]。TLR4/MyD88/NF-κB通路可能参与Meth诱导的神经炎症的发生，该通路是探索炎症发生机制和选择药物治疗靶点的研究热点之一。

天麻素（Gastrodin，Gas）是从传统中药材天麻的根茎中经化学方法获得的生物活性化合物，具备安眠、抗炎、抗惊厥、改善学习与记忆的药理作用。大量研究发现，天麻素在治疗焦虑、抑郁、脑损伤等中枢神经系统疾病有重要作用。基于上述背景，天麻素的抗炎作用是否通过TLR4/MyD88/NF-κB这条经典的炎性通路发挥作用具有较大的研究价值。本研究拟采用不同剂量的天麻素干预CPP大鼠，探索天麻素是否通过对TLR4/MyD88/NF-κB通路关键因子的调控，而发挥对Meth依赖CPP大鼠海马的保护作用。

1.   材料与方法

1.1   实验动物

健康SD大鼠 60只，雄性，体重（190±10）g，购自昆明医科大学实验动物部[许可证号：SCXK（滇）K2015-002]。实验大鼠常规饲养，在实验开始前，先将大鼠放于CPP箱内适应性饲养3 d。

1.2   实验主要药品和试剂

实验使用的Meth由云南省公安厅公安部重点实验室合法提供，经过萃取、分离纯化。干燥后将其制成盐酸盐结晶体保存，纯度在98%以上。实验使用的天麻素纯度98.0%，由昆明医科大学生物医学工程中心陆地教授提供，为白色粉状物，室温干燥后保存。TLR4抗体（sc-293072、美国Santa Cruz Biotechnology公司）；MyD88抗体（ab2064，美国Abcam公司）；NF-κB p65抗体（8142s、德国CST公司）；p-NF-κB p65抗体（sc-136548、美国Santa Cruz Biotechnology公司）；IκB-α抗体（9242、德国CST公司）；p-IκB-α抗体（2859、德国CST公司）；TRAF6抗体（66494、美国Proteintech公司）；β-actin抗体（ab6276，美国Abcam公司）； HRP标记羊抗兔二抗（L3012、美国SAB公司）；HRP标记羊抗鼠二抗（A21010、美国Abbkine公司）；荧光定量试剂盒（DBI-2043、德国DBI 公司）；BestarTMqPCR RT Kit（DBI-2220、德国DBI 公司）；引物合成由擎科生物科技有限公司合成。

1.3   主要实验仪器

大鼠 CPP 实验箱（XR-XT401，上海欣软信息有限公司）；酶标仪（Touch 2，美国BioTek公司）；普通PCR仪、荧光定量 PCR 仪（T100^TM Thermal Cycler、C1000 Touch ^TM Thermal Cycler，美国Bio-Rad 公司）；垂直电泳仪、半干转膜仪（552BR、221BR，美国Bio-Rad 公司）。

1.4   动物分组及处理

实验动物以随机的形式被分为6组，每组10只。这6组包括对照组、Meth组、天麻素组、Meth+低中高剂量天麻素干预组（10、30、100 mg/kg）。对照组和Meth组分别给予10 mg/kg 生理盐水和10 mg/kg Meth；天麻素组给予100 mg/kg天麻素。给药方式皆使用腹腔注射（intraperitonealinjection，IP），1次/d，连续不间断给药14 d。根据给药方法，Meth依赖CPP大鼠模建立成功^[10]。Meth+低中高剂量天麻素干预组（10、30、100 mg/kg），前14 d和Meth组操作相同；在Meth依赖模型建立成功后，根据组别分别予以对应剂量的天麻素（10、30、100 mg/kg）干预，每天1次，持续14 d。

1.5   CPP实验

CPP实验适应阶段（d1～3），打开2个箱体之间的隔板，让大鼠自由探索，每次30 min，每日1次。在d4，让大鼠在CPP箱内训练15 min，测定每只大鼠15 min内在两箱的停留时间，评判大鼠的天然偏爱性，将大鼠停留时间短的箱体指定为伴药箱。CPP训练阶段（Day5-Day18），封闭2箱体连接通道，连续14 d对大鼠采用腹腔注射后，立刻放入伴药箱进行适应30 min。d19，将隔板打开，使大鼠在CPP箱体内自由探索15 min，测定大鼠在伴药箱的停留时间。天麻素干预阶段（d20-35），确保大鼠产生CPP效应后，再采用低中高剂量的天麻素（10、30、100 mg/kg）连续不间断干预14 d，干预结束后再将大鼠放入箱体内进行CPP测试，用时15 min。

1.6   实验大鼠海马组织取材

CPP测试结束后，经乙醚吸入麻醉所有大鼠，暴露其胸腔和腹腔，灌注生理盐水至肝脏发白，断头取出全脑，参照《大鼠立体定位图谱》（第2版），暴露海马组织并分离，-80 ℃保存备用。

1.7   Western Blot实验

将海马组织清洗剪碎，加入适量RIPA组织裂解液，将组织超声破碎后室温放置30 min，每10 min上下振摇1次。离心15 min后进行蛋白定量分析。进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育（抗体配制比例除β-actin为1∶10000，TLR4、MyD88、TRAF6、IκB -α、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α配制比例均为1∶1000），置于4℃孵育过夜。洗膜后孵育二抗（室温/2 h），再次洗膜，利用ECL显影。以β-actin作为标准化的对照。Image J软件计算条带的平均灰度值（OD值）。

1.8   荧光定量PCR实验

海马组织中加入适量Trizol裂解液，获取组织内总RNA，使用酶标仪测定RNA浓度，一般测定两次取平均值。之后按照说明书逆转录合成cDNA。之后扩增目标基因，经预变性（5 min /94 ℃），变性（10 s/ 94 ℃），退火（10 s/53 ℃），延伸（20 s/60 ℃）共展开40个循环。完成后检测得到扩增曲线从而计算出Ct值。目标基因相对表达量采取２^-ΔΔCt法进行计算。引物序列，见表1。

表  1  引物序列

Table  1.  Primer Sequences

基因名称	引物序列	Tm
TLR4	上游引物：5′-TGCCTGAGACCAGGAAGCTTG 3′ 下游引物：5′-CTTAAGATCTTCAGGGGGTTG3′	54 ℃
MyD88	上游引物：5′-TGAGAAAAGGTGTCGTCGCA3′ 下游引物：5′-GGGTCCAGAACCAGGACTTG′	54 ℃
TRAF6	上游引物：5′-GCCCATGCCGTATGAAGAGA 3′ 下游引物：5′-CGTGACAGCCAAACACACTG3′	54 ℃
NF-κB p65	上游引物：5′-GAGACCTGGAGCAAGCCATT3′ 下游引物：5′-AGTTCCGGTTTACTCGGCAG3′	54 ℃
IκB -α	上游引物：5′-GAATCCTGACCTGGTCTCGC′ 下游引物：5′-CACAGTCATCGTAGGGCAACT3′	55 ℃
β-actin	上游引物：5′-AGACAGCCGCATCTTGT-3′ 下游引物：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′	55 ℃

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1.9   统计学处理

使用SPSS 19.0、GraphPad Prism 5.0等软件进行数据处理，实验数据以均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，采取单因素方差分析及t 检验对数据进行比较分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

实验结果见图1、图2，与对照组比较，Meth组TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65的蛋白和mRNA表达均升高（P < 0.01、P < 0.05或P < 0.001），p-NF-κB p65、p-IκB-α的蛋白表达升高（P < 0.01或P < 0.05），IκB-α蛋白和mRNA表达均降低（P < 0.01）。与Meth组相比，经低中高不同剂量的天麻素（10、30、100 mg/kg）持续作用14 d后，天麻素呈剂量相关性地升高了IκB-α 的蛋白和mRNA表达（P < 0.01或P < 0.05）。TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65的蛋白和mRNA表达 （P < 0.001、P < 0.01或P < 0.05）与p-NF-κB p65的蛋白表达（P < 0.01或P < 0.05）均降低，且与天麻素给药呈剂量相关性。p-IκB-α的蛋白表达降低（P < 0.01）。

图  1  不同剂量天麻素对甲基苯丙胺依赖CPP大鼠海马TLR4、MyD88、TRAF6、p-IκB-α、IκB-α、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达的影响

A～G：TLR4、MyD88、TRAF6、p-IκB-α、IκB-α、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白的定量分析。与对照组比较，^*P < 0.05；^**P < 0.01；与Meth组比较，^#P < 0.05， ^##P < 0.01。

Figure  1.  The effect of different doses of gastrodin on the expression of TLR4，MyD88，TRAF6，p-IκB-α，IκB-α，p-NF-κB p65，NF-κB p65 proteins in the hippocampus of methamphetamine-dependent rats

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图  2  不同剂量天麻素对Meth依赖大鼠海马TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、NF-κB p65 mRNA表达的影响

A-E：TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、NF-κB p65 mRNA的定量分析。与对照组比较，^**P < 0.01；^***P < 0.001。与Meth组比较，^#P < 0.05， ^##P < 0.01，^###P < 0.001。

Figure  2.  The effect of different doses of gastrodin on the mRNA expression of TLR4，MyD88，TRAF6，IκB-α，NF-κB p65 in the hippocampus of meth-dependent rats

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3.   讨论

甲基苯丙胺作为一种高度成瘾的精神兴奋剂，是世界上滥用最广泛的药物之一。持续使用Meth会导致神经退行性病变和认知功能障碍，炎症可能是Meth导致神经毒性的一个重要原因。大量研究表明，Meth通过激活小胶质细胞，影响海马等大脑相关区域炎症因子的变化，最终影响海马的多种生理功能^[3，11-13]。海马是大脑中与学习和记忆密切相关的脑区，在研究成瘾物质的复吸性和成瘾记忆形成方面有着重要价值^[14]。CPP模型是研究情景关联和奖励相关行为的经典动物模型^[15-17]。本研究通过连续不间断给予10 mg/kg Meth 14d（ip，qd）成功建立Meth依赖CPP大鼠模型。

TLR4作为天然免疫识别受体，通过MyD88通路发挥作用。其过程为TLR4与MyD88桥接，其中涉及TRAF6的激活，增强IκB的磷酸化，从而导致NF-κB级联的活化^[18，19]。TLR4/MyD88/NF-κB信号的过度活化可引起机体产生大量炎性物质，从而诱发或加重神经炎症反应。在Meth大鼠毒性模型中，大鼠纹状体中的神经炎症反应与TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB等蛋白的高表达相关，大鼠海马CA1区也会因炎性因子表达增加而产生神经炎症^{[8, 20]}。Re G F等^[21]发现，在急性戒断期间，Meth会导致小鼠纹状体和海马释放的小胶质细胞活化和促炎细胞因子增加，引起神经炎症。本研究采用Western Blot和RT-qPCR同时检测通路相关蛋白和mRNA的表达情况，笔者发现，与空白对照组相比，Meth组的通路相关蛋白和mRNA表达显著增加，结果提示Meth激活TLR4/MyD88/NF-κB通路诱导Meth依赖大鼠海马产生神经炎症。天麻素是一种酚类糖苷，具有镇静、抗眩晕、抗焦虑、改善记忆、抗炎、抑制胶质细胞活化等药理作用，对神经系统疾病的治疗具有潜力^[22]。现有研究表明^[23-25]，天麻素在炎症调控方面效果显著，从而发挥神经保护作用。刘英杰等的研究以毛果芸香碱诱发癫痫大鼠为模型，发现天麻素会产生抗炎作用，主要表现在天麻素可降低大鼠海马组织中TLR4/NF-κB信号通路关键蛋白的表达^[26]。Mei Z X 等^[27]的研究发现天麻素可降低先兆子痫引起的 MyD88表达上调。文欢等^[28]研究发现天麻素干预使NF-κB p65 、p-NF-κB p65 等炎症相关信号分子的表达下调，从而减轻皮层神经细胞糖氧剥夺再复供的炎性损伤。Zheng X等学者^[29]研究发现天麻素通过影响TLR4/NF-κB/NLRP3通路改善由脂多糖诱导的大鼠海马神经炎症。课题组前期的研究也证实天麻素在Meth成瘾和Meth诱导的神经毒性损伤方面皆有积极意义^[30-31]。因此，从炎症方面着手对Meth依赖进行干预治疗或许有很好的效果。本研究发现，与Meth组相比，经低中高剂量的天麻素干预14 d后，Meth依赖CPP大鼠海马中TLR4、MyD88、TRAF6、NF-κB p65的蛋白和mRNA表达，p-NF-κB p65的蛋白表达皆随天麻素剂量呈依赖性降低；IκB-α的蛋白和 mRNA 表达皆随天麻素剂量呈依赖性升高；p-IκB-α的蛋白表达降低。结果提示天麻素可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路关键因子的表达，改善Meth依赖导致的神经炎症。本研究在Meth依赖大鼠CPP模型中通过蛋白和mRNA水平首次提出天麻素可通过抑制 TLR4/MyD88/NF-κB通路关键因子的表达，缓解Meth依赖导致的神经炎症。

综上所述，本研究重点阐述不同剂量的天麻素对Meth依赖CPP大鼠的干预作用。研究发现，Meth依赖诱导的神经炎症与TLR4、MyD88、NF-κB等蛋白的高表达相关，天麻素可通过介导TLR4/MyD88/NF-κB信号转导通路，调节Meth诱导的神经炎症，发挥神经保护作用。进一步为天麻素对Meth依赖所致的神经炎症的治疗提供了新的思路。