Effect of Gossypol Acetate Acid on Invasion of Human Tongue Squamous Cell Carcinoma Cal-27 Cells in vitro
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摘要:
目的 研究醋酸棉酚（gossypol acetic acid，GAA）对体外培养的人舌鳞癌Cal-27细胞侵袭影响及其作用机制。 方法 制备0 μmol/L、2.5 μmol/L、5.0 μmol/L、10.0 μmol/L的GAA作用于人舌鳞癌Cal-27 细胞，通过Transwell实验检测GAA对人舌鳞癌Cal-27 细胞侵袭能力的影响；通过qRT-PCR及Western blot实验检测GAA对人舌鳞癌Cal-27 细胞基质金属蛋白酶-2（Matrix Metalloproteinase-2，MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9）mRNA及蛋白的表达变化。 结果 Transwell实验显示：GAA对人舌鳞癌Cal-27细胞细胞侵袭产生抑制作用，实验组和对照组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；qRT-PCR实验及Western blot显示，实验组人舌鳞癌Cal-27细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表达降低，与对照组相比差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 GAA能抑制人舌鳞癌Cal-27细胞的侵袭性，并降低人舌鳞癌Cal-27细胞MMP-2、MMP-9的mRNA及蛋白表达水平，这可能是GAA抑制肿瘤侵袭作用的机制之一。 Abstract:Objective To observe the effect of gossypol acetate acid（GAA）on the invasion of human tongue squamous cell carcinoma Cal-27 cells in vitro. Methods GAA of different concentrations（0 μmol/L, 2.5 μmol/L, 5.0 μmol/L, 10.0 μmol/L）was acted on Cal-27 cells, Transwell experiment was employed to detect the inhibitory effect of GAA on the invasion of Cal-27 cells. The effect of gossypol acetate on MMP-2 and MMP-9 mRNA expression was quantified by qRT-PCR. The effect of gossypol acetate acid on MMP-2 and MMP-9 protein expression was analyzed by Western-Blot experiment. Results Cell Transwell chamber experiment showed that GAA could inhibit the migration of human tongue squamous cell carcinoma Cal-27 cells, and the amount of invasion decreased with the increase in concentration. The difference between the control group and the experimental group was statistically significant（P < 0.05）. qRT-PCR experiment and Western-blot results showed that the expression of MMP-2 and MMP-9 mRNA and proteins was significantly reduced after Cal-27 cells of human tongue squamous cell carcinoma was treated with GAA, and the difference between the control group and the experimental group was statistically significant（P < 0.05）. Conclusions GAA can reduce the invasiveness of tongue squamous cell carcinoma Cal-27 cells. And GAA can reduce the mRNA and protein expression levels of MMP-2 and MMP-9 of human tongue squamous cell carcinoma Cal-27 cells. -
慢性盆腔炎（chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是女性上生殖道及其周围组织受到细菌感染而引起的慢性炎症性疾病，通常起源于阴道和宫颈内的上行性感染，是妇科常见和多发的疾病，具有迁延难愈、病程长、治疗难度较大、病情顽固等特点[1]。多见于未绝经、性活跃的女性，主要临床表现为发热、下腹痛、腰骶酸痛、月经不调、白带异常等[2]，CPID可对患者的生活质量和身心健康造成极大的危害。CPID若未能及时有效治疗容易导致患者盆腔粘连及不孕[3]，据统计盆腔炎所致不孕数占慢性盆腔炎患者总数的41.2%，严重者还会诱发盆腔癌[4]。目前慢性盆腔炎给药方案主要以β-内酰胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类和硝基咪唑类抗菌药物治疗为主，但由于抗菌药物使用频率和种类的增多，不良事件也越发严重，加上长期使用导致的耐药菌比例增加和菌群失调等问题，单纯采用抗菌药物治疗慢性盆腔炎的远期疗效和安全性并不能令人满意[5]。
中华医学会妇产科学分会等组织的多中心临床试验中发现，在抗菌药物治疗基础上，一些中药和物理治疗在慢性盆腔炎治疗及预后中起着至关重要的作用[6]。金刚藤胶囊作为CPID治疗常用的中成药，其主要成分为金刚藤，具有活血化瘀、燥湿止带、清热解毒的功效，还能有效抗菌消炎、提高免疫力及修复子宫炎性损伤，是CPID治疗的重要药物[7]。虽然诸多学者相继开展了金刚藤胶囊治疗慢性盆腔炎相关的随机对照实验研究，但目前仍缺乏金刚藤胶囊辅助治疗慢性盆腔炎相关的系统评价，因此有必要全面开展该药物在慢性盆腔炎患者中的临床疗效和安全性方面的分析。本文系统收集了金刚藤胶囊与抗菌药物联用治疗慢性盆腔炎的随机对照试验（randomized controlled trials，RCTs）研究，系统评价了金刚藤胶囊治疗慢性盆腔炎的疗效和安全性，以期为金刚藤胶囊的临床应用提供循证依据。
1. 资料与方法
1.1 资料来源与检索策略
以“主题=（金刚藤胶囊）and（慢性盆腔炎+盆腔炎性疾病）”和/或“TS=（Jingangteng）AND TS=（chronic pelvic inflammatory disease）”检索CNKI、VIP、Wan fang、PubMed、Cochrane Library、web of science数据库中金刚藤胶囊治疗慢性盆腔炎的RCTs，检索时间为建库至2023年10月31日。
1.2 纳入标准
1.2.1 研究类型
RCTs；语种限定为中、英文。
1.2.2 研究对象
明确诊断为慢性盆腔炎的患者，性别、年龄、种族、病程不限。诊断标准参考《盆腔炎症性疾病诊治规范（2019修订版）》[8]，并符合临床症状或病理组织检查。
1.2.3 干预措施
对照组正常使用抗菌药物（左氧氟沙星、替硝唑、甲硝唑、司帕沙星、头孢硫脒、克林霉素、阿奇霉素、罗红霉素等）；实验组在对照组的基础上加用金刚藤胶囊。2组均不限剂量、疗程。
1.2.4 结局指标
主要结局指标为：临床总有效率（临床总有效率=治愈率+显效率+有效率），不良事件发生率。次要结局指标为：炎性因子[C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、降钙素原（procalcitonin，PCT）、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF-α）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）]；血液流变学指标[白细胞计数（white blood cell，WBC）、红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、全血粘度、血浆粘度、血红素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）]；临床症状缓解时间（体温、下腹痛、白带异常、下腹坠痛、腰骶酸痛、盆腔肿块消失）；T淋巴细胞（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）。
1.3 排除标准
病例报告、动物实验、重复文献、不完整文献、会议论文摘要、综述、学位论文、无法获取全文或有效数据的文献、实验组联用除金刚藤胶囊以外的其他中成药或中药处方的文献。
1.4 文献筛选
文献筛选由2名研究者独立完成，将文献导入NoteExpress3.9.0，去重后阅读题目和摘要进行初次筛选。然后对初次筛选后留下的文献进行全文阅读，严格按照纳排标准进行筛选，确定最终纳入的文献，过程中遇到分歧先进行讨论，无法统一意见则由所有作者一起决定。
1.5 数据提取
数据提取由2名研究者独立完成，提取项目包括：第一作者、文献发表年份、样本量、患者年龄和病程、干预措施、结局指标等。
1.6 质量评估
由2位研究者独立按照Cochrane偏倚风险评估工具对纳入文献进行质量评价，根据偏倚风险程度评估为低风险、不确定和高风险。若评价过程出现分歧，先进行讨论，无法统一意见则由所有作者一起决定。
1.7 统计学处理
使用RevMan5.4和STATA16.0软件进行统计分析。使用相对危险度评价二分类变量（risk ratio，RR）、使用均数差（mean difference，MD）或标准化均数差（standard mean difference，SMD）评价连续型变量。以P、I 2值估计异质性，若无明显异质性（P > 0.1，I 2<50%），使用固定效应模型分析；若存在异质性（P≤0.1，I 2≥50%），进行亚组分析查找异质性来源，采用随机效应模型进行分析。以P < 0.05为差异具有统计学意义。若结局指标纳入的文献数量≥10篇，则绘制漏斗图检测是否存在发表偏倚。
2. 结果
2.1 文献筛选
初检文献574篇，经NoteExpress 3.9.0查重，剔除重复文献后剩余284篇，对文献题目及摘要进行阅读后纳入90篇进行全文阅读，最终纳入24篇符合标准的文献，具体流程见图1。
2.2 文献特征
共纳入24篇RCTs研究，发表时间为2015～2023年。总样本量2441例，其中实验组1220例，对照组1221例，对照组干预措施为常规抗菌药物治疗，实验组干预措施为对照组治疗方案的基础上加用金刚藤胶囊，实验组与对照组使用的抗菌药物的种类、剂量、给药方式等完全相同，见表1。
表 1 纳入文献的基本特征Table 1. Basic characteristics of included studies纳入文献
（年）样本（n） 年龄（岁） 病程（a） 干预措施 疗程 结局
指标T C T C T C T C 陈花兰[9] 2021 30 30 38.86±5.28 38.79±5.32 1.22±0.13 1.14±0.21 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d左氧氟沙星 2周 （1）（2）（6） 陈静[10] 2020 59 59 40.12±6.13 39.87±6.05 3.83±0.86 3.94±0.95 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d替硝唑 12周 （1）（2）（6） 陈晓琴[11] 2018 45 45 38.83±3.72 37.62±3.62 3.21±1.17 3.29±1.25 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d司帕沙星 2周 （1）（6） 管晓燕[12] 2019 54 54 34.01±3.46 33.56±2.89 2.26±0.55 2.29±0.59 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d头孢硫脒+
替硝唑12周 （1）（2） 郝霞[13] 2021 46 46 34.59±2.01 34.70±1.96 2.61±1.05 2.70±1.01 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d头孢曲松钠+
甲硝唑2周 （1）（2）（4） 郝玉珠[14] 2023 30 30 35.31±3.26 35.28±3.27 2.63±0.66 2.61±0.71 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d左氧氟沙星 2周 （1）（2）（3）（4）（5）（6） 胡开泰[15] 2019 30 30 36.1±1.4 35.5±1.5 − − 抗+金刚藤胶囊
2粒/次 3次/d甲硝唑 2周 （1）（2） 乐丽莎[16] 2019 60 60 35.37±5.41 35.45±5.26 2.23±0.49 2.17±0.58 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d克林霉素
磷酸2周 （1）（2）（3） 雷敏[17] 2022 60 60 32.15±4.45 32.20±4.50 12.32±1.45 12.35±1.50 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d司帕沙星 10d （1）（4） 冷晓华[18] 2020 28 28 38.0±3.0 38.3±3.2 13.0±2.4 13.3±2.6 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d司帕沙星 10d （1） 李春红[19] 2021 44 44 38.66±4.18 38.67±4.17 2.01±0.43 2.03±0.45 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d左氧氟沙星+
甲硝唑2周 （2）（4）（6） 李海霞[20] 2015 35 35 37.5±10.6 39.5±11.3 − − 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d头孢曲松钠+
奥硝唑10d （1） 莫培晖[21] 2018 60 60 54.8±7.2 54.3±7.4 5.2±1.4 5.1±1.8 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d司帕沙星 2周 （1）（2） 欧阳静[22] 2018 41 41 29.89±4.03 30.18±3.97 3.41±0.98 3.23±1.05 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d头孢唑肟钠+
奥硝唑2周 （4）（5）（6） 潘春芳[23] 2021 45 45 45.32±2.15 45.23+2.23 3.2±1.2 3.3+1.3 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d阿奇霉素 2周 （2）（4）（5）（6） 孙小梅[24] 2021 84 83 46.92±9.51 47.51±9.64 2.93±1.02 3.04±0.96 抗+金刚藤胶囊
6粒/次 3次/d头孢曲松钠+
替硝唑3周 （1）（4）（5）（6） 王静[25] 2021 38 38 31.29±3.19 31.73±3.56 3.58±0.35 3.55±0.21 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d克林霉素
磷酸酯2周 （1）（2）（3） 王文平[26] 2021 58 60 45.3±6.7 46.2±5.9 3.8±2.1 3.8±1.9 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d甲硝唑 2周 （1）（2） 王文霞[27] 2018 60 60 38.46±5.53 38.52±5.81 2.40±0.72 2.52±0.79 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d阿奇霉素 2周 （1）（2）（4） 杨建美[28] 2020 28 28 38.03±1.26 5.02±0.14 4.92±0.47 抗+金刚藤胶囊
4粒/次 3次/d头孢曲松钠+
阿奇霉素2周 （1）（2） 尹燕[29] 2016 150 150 36.67±10.1 37.74±11.01 14.11±9.35 14.57±10.16 抗+金刚藤胶囊
3粒/次 3次/d左氧氟沙星 6周 （1）（6） 余月萍[30] 2020 42 42 31.26±4.34 31.29±4.42 2.67±0.16 2.69±0.18 抗+金刚藤胶囊
4粒/次3次/d罗红霉素+
甲硝唑2周 （1）（6） 袁翀英[31] 2020 54 54 31.39±1.57 31.04±1.25 14.74±1.53 14.12±1.06 抗+金刚藤胶囊4粒/次3次/d 头孢美唑钠 2周 （1） 朱文婷[32] 2020 39 39 52.91±487 52.87±4.90 3.86±0.71 3.89±0.67 抗+金刚藤胶囊4粒/次 3次/d 司帕沙星 2周 （2）（5）（6） T：实验组；C：对照组；−：未提及；结局指标：（1）临床总有效率；（2）炎性因子（CRP、PCT 、IL-1、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、GM-CSF）；（3）血液流变学指标（WBC、ESR、全血粘度、血浆粘度、HO-1）；（4）临床症状缓解时间（体温、下腹痛、白带异常、下腹坠痛、腰骶酸痛、盆腔肿块消失）；（5）T淋巴细胞（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）；（6）不良反应事件。 2.3 文献质量评价
纳入的24篇RCTs中11篇文献报告了具体的随机方法，其中10篇[11-12，14，16，18-19，22，25，30，32]使用随机数字表法，1篇[9]使用计算机数字法，其中1篇[23]提及双盲的实施，文献结果数据均完整，所有文献均不存在其他偏倚，见图2。
图 2 纳入文献产生偏倚风险的项目所占比例Figure 2. Percentages of items of included articles that produced risks of bias2.4 Meta分析
2.4.1 临床总有效率
18篇[9-14，16，18，20-21，24-31]RCTs研究报告了临床总有效率，共涉及1923例患者，经异质性检验，I 2=0，P =0.89，各研究间无异质性，故采用固定效应模型，结果显示，与对照组相比，实验组显著提高了临床总有效率，差异具有统计学意义[RR=1.19，95%CI （1.15，1.23），P < 0.001]，见图3。
2.4.2 炎性因子
11篇[9-10，12-14，19-20，27-29，31]RCTs研究报告了CRP值，涉及1180例患者，经检验各研究间存在较强异质性（P < 0.001，I 2=94%），采用随机效应模型。Meta分析结果显示，与对照组相比，实验组CRP值显著降低，差异具有统计学意义[MD=2.35，95%CI（1.60，3.09），P < 0.001]，见表2。
表 2 Meta分析结果汇总表Table 2. Summary of meta-analysis results结局指标 纳入文献（篇） 样本量（n） 效应模型 异质性检验结果 Meta分析结果 P I2（%） MD 95%CI P 炎性因子 CRP 11篇[9，10，12-14，19，20，27-29，31] 1180 随机 <0.0001** 94 2.35 1.60～3.09 <0.0001** PCT 4篇[23，26，28，31] 372 随机 <0.0001** 85 0.15 0.12～0.19 <0.0001** IL-1 5篇[14，16，23，25，26] 464 随机 0.03* 64 6.48 5.23～7.73 <0.0001** IL-4 3篇[23，26，27] 328 固定 <0.0001** 0 10.87 9.56～12.18 <0.0001** IL-6 5篇[9，13，15，19，21] 420 随机 <0.0001** 94 14.43 7.29～21.57 <0.0001** IL-8 7篇[14-16，19，23，26，32] 614 随机 <0.0001** 96 16.32 10.55～22.08 <0.0001** IL-10 3篇[13，14，16] 271 随机 <0.0001** 65 6.79 4.93～8.64 <0.0001** TNF-α 6篇[19，21，23，26，27，32] 614 随机 0.0002** 100 21.17 10.11～32.22 <0.0001** GM-CSF 2篇[28，31] 164 随机 <0.0001** 54 4.28 3.03～5.52 <0.0001** 血液流变学 WBC 2篇[10，12] 226 固定 0.60 0 0.97 0.60～1.33 <0.0001** ESR 2篇[12，16] 228 固定 0.83 0 3.57 2.78～4.36 <0.0001** 全血粘度 2篇[16，25] 196 固定 0.82 0 1.52 1.27～1.77 <0.0001** 血浆粘度 2篇[16，25] 196 固定 0.17 46 0.32 0.27～0.38 <0.0001** HO-1 2篇[28，31] 164 固定 0.91 0 41.95 34.27～49.63 <0.0001** 症状恢复时间 体温 2篇[14，27] 180 固定 0.91 0 −1.94 −2.11～−1.78 <0.0001** 下腹痛 6篇[14，17，22-24，27] 639 固定 0.82 0 −2.20 −2.36～−2.03 <0.0001** 腰骶酸痛 2篇[13，19] 180 固定 0.31 1 −1.71 −2.20～−1.21 <0.0001** 白带异常 8篇[13，14，17，19，22-24，27] 819 随机 <0.0001** 91 −2.55 −3.06～−2.03 <0.0001** 下腹坠痛 6篇[13，17，19，22-24] 639 随机 0.01* 66 −2.57 −3.06～−2.08 <0.0001** 盆腔肿块消失 5篇[13，17，22-24] 551 随机 0.001** 78 −4.56 −5.79～−3.32 <0.0001** T淋巴细胞 CD3+ 3篇[14，22，24] 299 随机 <0.0001** 96 11.67 5.69～17.65 0.0001** CD4+ 5篇[14，22-24，32] 455 随机 <0.0001** 91 5.16 2.97～7.35 <0.0001** CD8+ 4篇[14，22，23，32] 310 固定 0.46 0 5.00 4.33～5.68 <0.0001** CD4+/CD8+ 4篇[14，22，23，32] 196 固定 0.91 0 0.52 0.48～0.56 <0.0001** *P < 0.05；**P < 0.01。 4篇[23，26，28，31]RCTs研究报告了PCT值，涉及372例患者，经检验各研究间存在异质性（P < 0.001，I 2=85%），采用随机效应模型。与对照组相比，实验组PCT值显著降低，差异具有统计学意义[MD=0.15，95%CI（0.12，0.19），P < 0.001]，见表2。
Meta分析显示IL-4各研究间无异质性（P=0.88，I 2=0），采用固定效应模型分析，与对照组相比，实验组能有效降低IL-4的值，差异具有统计学意义[MD=10.87，95%CI（9.56，12.18），P < 0.001]，见表2。
IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α及GM-CSF各研究间异质性较高（I 2>50%），采用随机效应模型。Meta分析显示，实验组能显著降低各炎性因子的值，差异具有统计学意义：IL-1[MD=6.48，95%CI（5.23，7.73），P < 0.001]、IL-6[MD=14.43，95%CI（7.29，21.57），P < 0.001]、IL-8[MD=16.32，95%CI（10.55，22.08），P < 0.001]、IL-10[MD=6.79，95%CI（4.93，8.64），P < 0.001]、TNF-α[MD=21.17，95%CI（10.11，32.22），P < 0.001]及GM-CSF[MD=4.28，95%CI（3.03，5.52），P < 0.001]，见表2。
2.4.3 血液流变学
WBC涉及2篇[10，12]RCTs研究，226例患者；ESR涉及2篇[12，16]RCTs研究，228例患者，全血粘度涉及2篇[16，25]RCTs研究，196例患者；血浆粘度涉及2篇[16，25]RCTs研究，196例患者；HO-1涉及2篇[28，31]RCTs研究，164例患者。Meta分析结果显示，各研究间无异质性（P > 0.1，I 2=0），采用固定效应模型分析，与对照组相比，实验组可以显著改善患者血液流变学指标，差异均具有统计学意义（P < 0.0001），见表2。
2.4.4 症状缓解时间
体温缓解时间涉及2篇[14，27]RCTs研究，180例患者；下腹痛缓解时间涉及6篇[14，17，22-24，27]RCTs研究，639例患者；腰骶酸痛缓解时间涉及2篇[13，19]RCTs研究，180例患者，Meta分析显示：体温（P=0.91，I 2=0）、下腹痛缓解时间（（P=0.82，I 2=0）、腰骶酸痛缓解时间（P=0.31，I 2=1）异质性均较小，采用固定效应模型分析，与对照组相比，实验组以下症状改善时间更明显，差异具有统计学意义：体温恢复时间[MD=-1.94，95%CI（-2.11，-1.78），P < 0.001]，下腹痛缓解时间[MD=-2.20，95%CI（-2.36，-2.03），P < 0.001]，腰骶酸痛缓解时间[MD=-1.71，95%CI（-2.20，-1.21），P < 0.001]，见表2。
白带异常缓解时间涉及8篇[13-14，17，19，22-24，27]RCTs研究，819例患者；下腹坠痛缓解时间涉及6篇[13，17，19，22-24]RCTs研究，639例患者；下盆腔肿块消失时间涉及5篇[13，17，22-24]RCTs研究，551例患者，各研究间存在异质性（I 2>50%），采用随机效应模型。与对照组相比，实验组以下症状改善时间更明显，差异具有统计学意义：白带异常缓解时间[MD=-2.55，95%CI（-3.06，-2.03），P<0.0001]、下腹坠痛缓解时间[MD=-2.57，95%CI（-3.06，-2.08），P<0.0001]、盆腔肿块消失时间[MD=-4.56，95%CI（-5.79，-3.32），P<0.0001]，见表2。
2.4.5 T淋巴细胞
CD8+涉及4篇[14，22-23，32]RCTs研究，310例患者；CD4+/CD8+涉及4篇[14，22-23，32]RCTs研究，196例患者，Meta分析结果显示，各研究间无异质性（P > 0.1，I 2=0），均采用固定效应模型分析。与对照组相比，实验组更有利于CD8+、CD4+/CD8+值的改善，差异具有统计学意义：CD8+[MD=5.00，95%CI（4.33，5.68），P < 0.001]和CD4+/CD8+[MD=0.52，95%CI（0.48，0.56），P < 0.001]，见表2。
CD3+涉及3篇[14，22，24]RCTs研究，299例患者，CD4+涉及5篇[14，22-24，32]RCTs研究，455例患者，Meta分析结果显示，各研究间异质性较高，对文献进行逐一排查，进行敏感性分析，均对最终合并效果影响较小，结果稳定，采用随机效应模型。与对照组相比，实验组更有利于CD3+、CD4+值的改善，差异具有统计学意义：CD3+[MD=11.67，95%CI（5.69，17.65），P < 0.001]，CD4+[MD=5.16，95%CI（2.29，7.35），P < 0.001]，见表2。
2.4.6 亚组分析
以CRP、白带异常恢复时间、下腹坠痛恢复时间、盆腔肿块消失时间、CD3+、CD4+为指标，按疗程为分组标准进行亚组分析。亚组分析结果显示：除疗程为10 d时，CRP 在2组间干预效果差异无统计学意义外（P > 0.05），其余指标实验组干预效果均明显优于对照组，差异具有统计学意义（P < 0.05），见表3。
表 3 不同疗程的亚组分析结果Table 3. Results of subgroup analysis for different courses of treatment亚组（疗程） 纳入文献（篇） 样本量（例） 效应模型 异质性检验结果 Meta分析结果 P I2（%） MD 95%CI P CRP 10 d 1篇[20] 70 − − − 2.97 −1.30～−7.24 0.17 2周 7篇[9，13-14，19，27，28，31] 584 随机 <0.0001** 97 0.15 0.12～0.19 <0.0001** 6周 1篇[29] 150 − − − 2.72 1.07～4.37 0.001** 12周 2篇[10，12] 226 随机 0.09 65 0.98 0.73～1.22 <0.0001** 白带异常 10 d 1篇[17] 120 − − − −2.00 −2.51～−1.49 <0.0001** 2周 6篇[14，15，19，22，23，27] 532 随机 <0.0001** 92 −2.62 −3.21～−2.03 <0.0001** 3周 1篇[24] − − − −2.74 −3.59～−1.89 <0.0001** 下腹坠痛 10 d 1篇[17] 120 − − − −3.00 −3.52～−2.48 <0.0001** 2周 4篇[13，19，22，23] 352 随机 0.02* 70 −2.49 −3.19～−1.79 <0.0001** 3周 1篇[24] 167 − − − −2.44 −3.10～−1.78 <0.0001** 盆腔肿块消失 10 d 1篇 120 − − − −3.00 −4.19～−1.81 <0.0001** 2周 3篇 264 随机 0.08 60 −4.61 −5.94～−3.28 <0.0001** 3周 1篇 167 − − − −5.91 −6.97～−4.85 <0.0001** CD3+ 299 随机 <0.0001** 96 11.67 5.69～17.65 0.0001** 2周 2篇[14，17] 141 随机 <0.0001** 94 11.67 7.48～20.51 <0.0001** 3周 1篇[19] 157 − − − 7.16 5.72～8.60 <0.0001** CD4+ 2周 4篇[14，22，23，32] 288 随机 <0.0001** 87 5.78 3.40～8.17 <0.0001** 3周 1篇[24] 167 − − − 2.88 1.94～3.82 <0.0001** −：不涉及；*P < 0.05；**P < 0.01。 2.4.7 不良事件
12篇[9-11，14，19，22-24，26-27，29，32]RCTs研究报告了不良事件发生率，涉及1371例患者，Meta分析结果显示，各研究间异质性较小（P=0.15，I 2=30%），采用固定效应模型，结果显示与对照组相比，实验组不良事件发生率更低[RR=0.70，95%CI（0.51，0.95），P=0.02]，见图4。不良事件发生情况，见表4。
表 4 不良事件发生情况统计表Table 4. Statistics on the occurrence of adverse events纳入文献 不良事件发生情况 对照组 实验组 陈花兰[9] 恶心3例、腹痛腹胀1例、头痛头晕3例、肝功能异常1例 恶心1例、头痛头晕1例 陈静[10] 恶心呕吐3例、腹痛腹胀1例、皮肤瘙痒2例 恶心呕吐4例、腹痛腹胀2例、皮肤瘙痒2例 陈晓琴[11] 胃痛4例、恶心4例、胃肠道反应5例、过敏3例 恶心2例、胃痛1例、胃肠道反应1例、过敏1例 郝玉珠[14] 恶心2例；皮疹3例 恶心2例；腹痛3例；皮疹1例 李春红[19] 呕吐3例；皮疹1例； 呕吐1例；头痛2例； 欧阳静[22] 呕吐1例；恶心2例；腹泻1例 呕吐2例；恶心3例；腹泻1例 潘春芳[23] 胃痛3例；过敏4例；胃肠道4例 胃痛1例；过敏1例；胃肠道1例 孙小梅[24] 呕吐2例；腹泻2例 乏力2例；头痛2例；呕吐1例；腹泻1例 王文平[26] 腹痛1例；恶心2例 恶心1例；皮疹1例 王文霞[27] 恶心1例；腹痛1例；皮疹1例 恶心2例；腹痛1例； 尹燕[29] 头晕、恶心和肠胃不适等不良反应事件共有17例 头晕、恶心和肠胃不适等不良反应事件共有16例 朱文婷[32] 过敏2例；胃肠道反应5例；胃痛1例 过敏1例；胃肠道反应1例 2.5 敏感性分析
以CRP为指标进行敏感性分析，结果显示在逐一剔除纳入文献后，异质性结果变化不大，差异无统计学意义（P > 0.05），提示本研究结果可信度较高。其余结局指标所得结果均较为稳定。
2.6 发表偏倚
以临床总有效率、CRP、不良事件发生率，绘制倒漏斗图。结果显示：临床总有效率的倒漏斗图左右分布大致对称，发表偏倚的可能性小，见图5A；CRP的倒漏斗图左右分布不对称，具有发表偏倚的可能性，见图5B；不良事件发生率的倒漏斗图左右分布大致对称，发表偏倚的可能性小，见图5C。进行Egger’ s检验，结果显示：临床总有效率（P=0.228）、CRP（P=0.255）、不良事件发生率（P=0.527），差异均无统计学意义（P > 0.05）。提示各研究间无明显发表偏倚，见图5。
图 5 临床总有效率、CRP、不良事件发生率相关研究的漏斗图Figure 5. Funnel plot of effective rate/CRP/adverse event rate3. 讨论
慢性盆腔炎多因急性盆腔炎治疗不彻底、患者免疫功能低下、感染部位迁徙等原因所致，目前临床以抗菌药物治疗作为慢盆腔炎发病时的主要处理措施[33]。但由于患病部位位于腹腔最低处，局部炎症反应强，致使血液流变学改变，不利于抗菌药物吸收，并且长期使用会产生耐药性和药物不良反应发生率的增加，导致患者的预后较差。而中成药具有不良反应少，对慢性疾病疗效显著等特点，中西医联合疗法替代单用西医抗菌药物逐渐得到广大临床工作者的青睐[34]。
金刚藤胶囊主要成份为金刚藤，含有黄铜、黄酮类、苯丙素类、甾体皂苷类成份[35]，药理作用主要包括：清热解毒、活血化瘀、抗炎、提高免疫力等，主要用于湿热下注所致的带下量多、黄绸，经期腹痛等，能有效缓解慢性盆腔炎引起的子宫炎症和炎性粘连等。金刚藤中含有的黄酮类物质具有抗氧化和抗炎的作用，能够通过SIRT1/活化受体γ共同激活因子-1α信号通路影响抗氧化酶的表达，从而达到清除氧自由基、减少细胞变性，改善氧化应激反应以及相关炎症反应的目的[36]。在慢性盆腔炎的治疗过程中，金刚藤胶囊可以加速局部病灶的微循环状态，促进患者病灶部位的血液循环，从而加快病菌的排出[37]。金刚藤多糖通过下调子宫组织成纤维细胞生长因子及成纤维细胞生长因子蛋白的表达，抑制炎症反应与盆腔粘连，最终达到治疗慢性盆腔炎的目的[38]。
本研究共纳入24篇金刚藤胶囊治疗慢性盆腔炎的RCTs研究，共计2441例慢性盆腔炎患者，其中22篇文献为近5 a发表。Meta分析结果显示，金刚藤胶囊联用常规抗菌药物，能有效促进患者炎性因子、T淋巴细胞和血液流变学指标修复，促进机体内环境稳态的恢复，减少脂质类物质的堆积，还能有效缩短体温、下腹痛、腰骶酸痛、白带异常、下腹坠痛和盆腔肿块消失等临床症状的缓解时间，达到减轻盆腔炎症的目的。考虑纳入的研究疗程跨度较大，这可能导致不同研究间存在一定的异质性。为寻找异质性来源，按疗程因素进行亚组分析，经分组后组内异质性仍然较大，所以疗程可能并不是主要的异质性来源，仍存在其他因素可能导致异质性：（1）本文纳入的研究中病情严重程度不同，部分结局指标基线值差异悬殊较大；（2）临床症状评价存在一定的主观性，可能造成合并结果的异质性；（3）不同的研究设计（金刚藤胶囊剂量、抗菌药物类别等）也可能是异质性的来源。
金刚藤胶囊对慢性盆腔炎患者的疗效与疾病严重程度有关。在本研究中发现：CRP、PCT、IL-6、IL-8等指标的基线值越高，实验组改善的幅度越大。提示金刚藤胶囊在重度慢性盆腔炎患者中的疗效更加显著。但是在邓高丕[39]的研究中发现，不同严重程度的慢性盆腔炎患者在给予金刚藤胶囊治疗6周后，总有效率分别为轻度（95.12%）、中度（96.15）和重度（93.65%），组间并无显著差异（P > 0.05），对中度和重度的慢性盆腔炎患者均能达到很好的治疗效果。在本研究的亚组分析中显示，当疗程为10 d时，组间比较CRP值下降无显著性差异（P > 0.05）。有研究发现[40]，慢性盆腔炎患者使用金刚藤胶囊，4～6周的疗效优于2周，差异具有统计学意义（P < 0.01），提示长疗程使用金刚藤胶囊，患者临床获益可能更多，对于重度慢性盆腔炎患者，建议延长药物疗程。在安全性分析方面，共计12篇RCTs研究报道了药物不良事件，结果显示实验组药物不良事件发生率显著低于对照组（P=0.02），提示实验组的安全性较好。2组不良反应症状主要包括：恶心、呕吐、胃痛、头痛、头晕、皮疹和腹泻等。在任妮[41]的研究中显示，金刚藤胶囊联合抗菌药物的方案，在6种治疗慢性盆腔炎的中成药中不良反应发生率最低。
本文也存在一些局限性：（1）未使用统一的规范评价方式，如症状缓解时间、药物不良事件判定等具有一定的主观性；（2）各研究的结局指标较为分散，部分指标研究样本量较少，影响了本研究的可信度；（3）部分结局指标的基线值有很大的差异，导致出现较高的异质性；（4）由于国外应用中成药的情况较少，且所有纳入的文献均为国内研究，可能会限制研究结果的应用和推广。
综上所述，本研究使用多个结局指标评估金刚藤胶囊联合使用抗菌药物治疗慢性盆腔炎的有效性和安全性，结果证实金刚藤胶囊在慢性盆腔炎治疗过程中发挥着重要的作用。金刚藤胶囊与抗菌药物联用可显著提高临床总有效率，促进炎性因子和淋巴细胞的恢复，还能有效缩短临床症状的改善时间，降低药物不良事件的发生率。若疾病进展程度较为严重时，在抗菌药物治疗的基础上加用金刚藤胶囊，可以提高疗效，缩短病程，减少抗菌药物的用量，提高安全性。但是目前仍然需要开展更多的大样本、多中心、高质量的RCTs研究进行验证。
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图 1 各组细胞Transwell迁移实验（×100）
Figure 1. The light microscope photos of the migration of Cal-27 cell（×100）
图 3 各组细胞Transwell侵袭实验（×100）
Figure 3. The light microscope photos of the invasion of Cal-27 cell（×100）
图 5 GAA对人舌鳞癌Cal-27细胞MMP-2、MMP-9 蛋白表达水平的影响
Figure 5. The protein expression level of MMP-2，MMP-9 in Cal- 27 cells by GAA
表 1 MMP-2、MMP-9、GAPDH的引物序列
Table 1. Primer sequences of MMP-2，MMP-9 and GAPDH
基因 引物序列 大小（bp） MMP-2（F） 5′-GAACCAGATCACATACAGGATC-3′ MMP-2（R） 5′-ATCCACTGTCTCTGGGTCCA-3′ 66 bp MMP-9（F） 5′-ACCTCAAGTGGCACCACCAC-3′ MMP-9（R） 5′-GCGGCAAGTCTTCCGAGTAG-3′ 63 bp GAPDH（F） 5′-GCCATCAATGACCCCTTCAT-3′ GAPDH（R） 5′-TTGGAACATGTAAACCATGT -3′ 51 bp 
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表 2 GAA对Cal-27细胞Transwell迁移个数对比（个）[（
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ，n = 3）]Table 2. Comparison of the migration of Cal-27 cell in different concentration of GAA（each）[（
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ，n = 3）]组别 0 h 6 h 12 h 18 h 24 h 对照组 14.00 ± 3.61 15.00 ± 3.00▽ 43.00 ± 2.65▽△ 75.33 ± 3.51▽△☆ 100.33 ± 4.93▽△☆◇ 2.5 μmol/L组 5.00 ± 1.00▲ 13.00 ± 2.65▲▽ 26.33 ± 3.51▲▽△ 43.00 ± 2.00▲▽△☆ 64.00 ± 3.00▲▽△☆◇ 5 μmol/L组 4.33 ± 2.08▲★ 10.33 ± 2.52▲★▽ 24.67 ± 1.53▲★▽△ 38.67 ± 2.52▲★▽△☆ 54.67 ± 3.51▲★▽△☆◇ 10 μmol/L组 2.33 ± 1.15▲★■ 7.00 ± 2.00▲★■▽ 8.67 ± 2.08▲★■▽△ 12.67 ± 2.08▲★■▽△☆ 21.33 ± 3.51▲★■▽△☆◇ 相同作用时间与对照组比较，▲P < 0.05；相同作用时间与2.5 μmol/L比较，★P < 0.05；相同作用时间与5 μmol/L比较，■P < 0.05；相同GAA浓度作用与0 h比较，▽P < 0.05；相同GAA浓度作用与6 h比较，△P < 0.05；相同GAA浓度作用与12 h比较，☆P < 0.05；相同GAA浓度作用与18 h比较，◇P < 0.05。
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表 3 GAA对Cal-27细胞Transwell侵袭个数对比（个）[（
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ），n = 3]Table 3. Comparison of the invasion of Cal-27 cell in different concentration of GAA（each） [（
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ），n = 3]组别 0 h 6 h 12 h 18 h 24 h 对照组 12.00 ± 2.65 13.33 ± 3.06▽ 39.00 ± 1.00▽△ 75.67 ± 5.69▽△☆ 100.67 ± 7.77▽△☆◇ 2.5 μmol/L组 6.00 ± 2.00▲ 12.33 ± 3.51▲▽ 28.33 ± 4.51▲▽△ 40.33 ± 1.53▲▽△☆ 62.67 ± 5.69▲▽△☆◇ 5 μmol/L组 5.33 ± 3.51▲★ 9.33 ± 4.73▲★▽ 24.33 ± 3.51▲★▽△ 32.33 ± 3.51▲★▽△☆ 52.33 ± 6.51▲★▽△☆◇ 10 μmol/L组 3.33 ± 1.53▲★■ 8.67 ± 3.06▲★■▽ 9.00 ± 1.00▲★■▽△ 10.67 ± 2.08▲★■▽△☆ 19.67 ± 1.53▲★■▽△☆◇ 相同作用时间与对照组比较，▲P < 0.05；相同作用时间与2.5 μmol/L比较，★P < 0.05；相同作用时间与5 μmol/L比较，■P < 0.05；相同GAA浓度作用与0 h比较，▽P < 0.05；相同GAA浓度作用与6 h比较，△P < 0.05；相同GAA浓度作用与12 h比较，☆p < 0.05；相同GAA浓度作用与18 h比较，◇P < 0.05。
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表 4 GAA对Cal-27细胞中MMP-2、MMP-9 mRNA表达的影响（
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ，n = 9）Table 4. The mRNA expression level of MMP-2，MMP-9 in Cal- 27 cells by GAA（
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ，n = 9）组别 MMP-2 MMP-9 对照组 1.02 ± 0.24 1.01 ± 0.15 2.5 μmol/L组 0.25 ± 0.04▲ 0.83 ± 0.10▲ 5 μmol/L组 0.16 ± 0.06▲ 0.69 ± 0.03▲★ 10 μmol/L组 0.10 ± 0.03▲★ 0.46 ± 0.18▲★■ 与对照组比较，▲P < 0.05；与2.5 μmol/L比较，★P < 0.05；与5 μmol/L比较，■P < 0.05。
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表 5 不同浓度GAA作用于人舌鳞癌Cal-27细胞MMP-2、MMP-9蛋白表达相对值（MMP-2、MMP-9/GAPDH）（
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ，n = 3）Table 5. The protein expression level of MMP-2、MMP-9 in cal- 27 cells by GAA（MMP-2、MMP-9/GAPDH） （
$\bar{{{x}}}\pm {{s}}$ ，n = 3）组别 MMP2/GAPDH MMP9/GAPDH 对照组 1.20 ± 0.02 1.20 ± 0.01 2.5 μmol/L组 0.98 ± 0.00▲ 0.91 ± 0.01▲ 5 μmol/L组 0.76 ± 0.00▲★ 0.75 ± 0.00▲★ 10 μmol/L组 0.61 ± 0.01▲★■ 0.53 ± 0.00▲★■ 与对照组比较，▲P < 0.05；与2.5 μmol/L比较，★P < 0.05；与5 μmol/L比较，■P < 0.05。
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