Effect of Osteoking on Bone Density and Bone Biomechanics of Tree Shrews in a Postmenopausal Osteoporotic Fracture Model
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摘要:
目的 研究恒古骨伤愈合剂对绝经后骨质疏松性骨折（OPF）模型树鼩骨密度及骨生物力学的影响。 方法 雌性滇西亚种树鼩双侧卵巢及子宫切除术建立骨质疏松（OP）模型，180 d后，对树鼩进行骨密度（BMD）测定，将20只OP模型造模成功的树鼩随机平均分为给药组（3 mL/kg）、模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）。10只仅切除同体积大网膜树鼩分为正常组（等体积0.9%氯化钠溶液）。将给药组和模型组树鼩进行右侧后肢胫骨骨折术建立OPF模型。给药组每2天给药1次，连续给药90 d，其余组给予同剂量的生理盐水。处死树鼩后，进行双能X射线吸收法检测实验以及股骨三点弯曲实验。 结果 与正常组比较，给药组和模型组全身（含头部）、腰 + 盆骨、颈椎-尾椎、左骨盆、右骨盆、腰椎、腰 + 骶骨、全身（不含头部）BMD均有不同程度显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与模型组比较，给药组全身（含头部）、腰 + 盆骨、颈椎-尾椎、左骨盆、腰椎、腰 + 骶骨BMD均有显著提升，差异有统计学意义（P < 0.05），而右骨盆、全身（不含头部）BMD无统计学差异（ P > 0.05）。骨生物力学方面，与正常组相比，给药组能量吸收能力显著提升，而最大载荷和结构刚度无统计学差异（ P > 0.05）；模型组最大载荷、结构刚度、能量吸收能力均有显著降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）；与给药组相比，模型组最大载荷、结构刚度、能量吸收能力均有显著降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 恒古骨伤愈合剂对OPF模型树鼩的BMD和骨生物力学方面均有改善作用。 Abstract:Objective To observe the effect of osteoking on bone density and bone biomechanics in a postmenopausal osteoporotic fracture（OPF）model tree shrew. Methods Female western Yunnan subspecies tree shrews were subjected to bilateral ovariectomy and hysterectomy to establish an osteoporosis（OP）model, and after 180 days, bone density（BMD）was measured in tree shrews, and 20 OP modeling successes were randomly and equally divided into administration（3 mL/kg）and model groups（equal volume of 0.9% sodium chloride solution）. Ten tree shrews with the same volume of large omentum removed were divided into normal groups（equal volume of 0.9% sodium chloride solution）. The tree shrews in the drug-administered and model groups were subjected to right hindlimb tibial fracture surgery to establish the OPF model. The administration group was given one dose of saline every 2 d for 90 d, and the remaining group was given the same dose of saline. Results Compared with the normal group, the BMD of whole body（including head）, lumbar + pelvic, cervical-caudal, left pelvis, right pelvis, lumbar spine, lumbar + sacral, and whole body（excluding head）were significantly reduced to different degrees in the administered and model groups, and the differences were statistically significant（P < 0.05）. Compared with the model group, the BMD of the whole body（including the head）, lumbar + pelvic, cervical-caudal, left pelvis, lumbar spine, and lumbar + sacral were significantly increased in the administration group, and the differences were statistically significant（P < 0.05）, while the BMD of the right pelvis and whole body（excluding the head）were not statistically different. In terms of bone biomechanics, energy absorption was significantly increased in the administered group compared to the normal group, while maximum load and structural stiffness were not statistically difference; the maximum load, structural stiffness, and energy absorption capacity of the model group were all significantly reduced, and the differences were statistically significant（P < 0.05）. The maximum load, structural stiffness, and energy absorption capacity of the model group were all significantly reduced compared to the drug-administered group, and the differences were statistically significant（P < 0.05）. Conclusion Osteoking can improve both BMD and bone biomechanics in the OPF model of tree shrew. -
Key words:
- Osteoking /
- Tree shrew /
- Osteoporosis /
- Bone density /
- Bone biomechanics
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骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由多种原因引起的骨病，是以单位体积骨量减少为特点的代谢性骨病变。引起OP的原因有很多，其中与年龄、遗传、绝经、饮食、疾病等有关[1]。绝经后的骨质疏松症，在临床上的表现多是以骨骼疼痛和易于骨折为特点，还包括身长缩短、驼背、气短、胸闷和呼吸困难等症状[2]。骨生物力学是生物力学的一个分支，以工程力学为基础，研究骨组织在外力作用下的力学特性和生物学效应，是评价骨组织质量的常用和可靠方法[3]。骨密度（bone mineral density，BMD）测定多用于对骨的脆性及骨折的危险性进行预测，对骨矿盐含量有比较直观的表现。本研究采用了BMD和骨生物力学两种测定方法，对骨组织进行综合性评价。
云南省重点开发的滇西亚种树鼩是一种较为理想的实验动物，与传统的实验用大鼠、兔、犬等非灵长类动物相比，其身体结构、月经周期等与人高度相似；全基因组序列比大鼠、兔等与人有更高的同源性，且滇西亚种树鼩还具有体型小、易于饲养、成本低等诸多优点，更加适用于人类绝经后OP和OPF模型的研究[4-6]。本实验通过切除双侧卵巢及子宫建立绝经后OP和OPF树鼩模型更加适用于人类绝经后OP和OPF模型的研究[7]，并将恒古骨伤愈合剂利用灌胃方式给予，检测实验树鼩全身（含头部）、腰+盆骨、颈椎-尾椎、左骨盆、右骨盆、腰椎、腰 + 骶骨及全身（不含头部）部位BMD，同时，对实验树鼩股骨的强度（最大载荷）、能量吸收能力及结构刚度几项骨生物力学基本指标进行评估，最后为临床合理使用恒古骨伤愈合剂提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 主要仪器、药品与试剂
TK-252D/RDT（TK-252D）骨生物力学仪（日本MUROMACHI KIKAI CO.，LTD.）；Lunar Prodigy双能X线高端骨密度仪（美国GE）；恒古骨伤愈合剂[云南克雷斯天然药物制药有限公司，批准文号：国药准字Z20025103，批号：20150406，规格：25 mL/瓶（每1 mL含生药0.36 g）]；所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水。
1.2 动物
滇西亚种树鼩，10月龄，雌性，体质量110～120 g，由昆明医科大学实验动物学部提供，动物使用许可证号：SYXK（滇）2015-0002。饲养环境：温度22 ℃～25 ℃，相对湿度45%～60%，每日光照时间12 h。实验期间动物饲喂颗粒饲料，自由饮水。
1.3 方法
1.3.1 实验分组、造模及给药
实验树鼩于鼠房适应性喂养1周，检测树鼩全身BMD，随机将树鼩分为正常组和手术组，同时禁食12 h，各组鼠鼩腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后，手术组切除树鼩双侧卵巢及子宫建立骨质疏松（osteoporosis，OP）模型，正常组仅切除同体积的大网膜。切除手术等实验过程严格遵守无菌操作的原则，手术后为预防感染，在伤口处给予适量青霉素，连续3 d。180 d后，对各组树鼩进行BMD测定，并与自身手术前后BMD数据进行对比，以BMD数值降低大于25%为依据，确定手术组OP模型建模成功，将20只造模成功的手术组树鼩随机平均分为给药组（3 mL/kg）、模型组（等体积0.9%氯化钠溶液）。10只仅切除同体积大网膜树鼩分为正常组（等体积0.9%氯化钠溶液）。对给药组和模型组树鼩进行右侧后肢胫骨骨折术，建立树鼩OPF模型。给药组每2天1次进行相应药物的灌胃，连续90 d，其余组给予同剂量的生理盐水，每周固定时间称量树鼩体质量以调整给药剂量。按照药品说明书的使用剂量，以树鼩体质量/体表面积折算等效剂量给药[8]。
1.3.2 指标检测
（1）BMD：实验树鼩于最后一次给药后禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，采用Lunar Prodigy双能X线高端骨密度仪检测树鼩全身（含头部）、腰 + 盆骨、颈椎-尾椎、左骨盆、右骨盆、腰椎、腰 + 骶骨及全身（不含头部）部位的BMD。（2）骨生物力学：行股骨三点弯曲实验：取各组树鼩左侧大腿股骨段，分离骨肉，用生理盐水清洗干净，自由放置在TK-252D/RDT（TK-252D）骨生物力学仪支架上，将股骨的中点、两个支点的中心和加载点重合，选用加载速度5 mm/min，支座跨距20 mm，分别测定股骨的强度（最大载荷）、能量吸收能力及结构刚度。
1.4 统计学处理
采用SPSS 22.0软件进行统计分析。实验数据以均数±标准差（
$ \bar x$ ±s）表示，三组间的比较采用单因素方差分析，如有差异用q检验进一步两两比较。P < 0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 各组树鼩BMD数据比较
与正常组比较，给药组和模型组的改变是全身（含头部）、腰 + 盆骨、颈椎-尾椎、左骨盆、右骨盆、腰椎、腰 + 骶骨、全身（不含头部）BMD均有不同程度降低，差异具有统计学意义（P < 0.05）。与模型组比较，给药组的改变是全身（含头部）、腰 + 盆骨、颈椎-尾椎、左骨盆、腰椎、腰 + 骶骨BMD均有显著提升，差异均有统计学意义（P < 0.05），而右骨盆、全身（不含头部）BMD无统计学差异，见表1，图1。
表 1 各组树鼩骨密度比较结果[（$\bar x \pm s$ ），g/cm2]Table 1. Comparison of bone density of tree shrews in each group[（$\bar x \pm s$ ），g/cm2]区域 正常组（n = 10） 给药组（ n = 10） 模型组（ n = 10） 全身（含头部） 0.103 ± 0.012 0.097 ± 0.005* 0.087 ± 0.005**.# 腰 + 盆骨 0.097 ± 0.004 0.088 ± 0.003** 0.083 ± 0.004**.# 颈椎−尾椎 0.096 ± 0.003 0.084 ± 0.004** 0.078 ± 0.005**.## 左骨盆 0.099 ± 0.011 0.087 ± 0.006** 0.082 ± 0.004**.# 右骨盆 0.098 ± 0.005 0.091 ± 0.004* 0.088 ± 0.005** 腰椎 0.096 ± 0.002 0.090 ± 0.004** 0.083 ± 0.005**.# 腰 + 骶骨 0.093 ± 0.006 0.087 ± 0.004* 0.081 ± 0.005**.# 全身（不含头部） 0.092 ± 0.003 0.084 ± 0.004* 0.082 ± 0.004** 与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与给药组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 2.2 各组树鼩骨生物力学数据比较
与正常组相比，给药组的变化是能量吸收能力显著提升，而最大载荷和结构刚度无统计学差异（P > 0.05）；模型组的改变是最大载荷、结构刚度、能量吸收能力均有显著降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。与给药组相比，模型组的改变是最大载荷、结构刚度、能量吸收能力均有显著降低，差异均有统计学意义（P < 0.05），见表2。
表 2 各组树鼩骨生物力学特性统计分析结果[（$\bar x \pm s$ ），n = 10]Table 2. Results of statistical analysis of the biomechanical properties of tree shrew bone in each group[（$\bar x \pm s$ ），n = 10]项目 正常组 给药组 模型组 最大载荷（N） 50.13 ± 7.75 47.75 ± 4.43 41.31 ± 4.43**.## 结构刚度（N/mm） 72.52 ± 19.76 76.63 ± 6.42 53.18 ± 7.99**.## 能量吸收能力（N/mm） 53.64 ± 12.21 59.95 ± 9.81* 41.52 ± 8.32**.## 与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与给药组比较，##P < 0.01。 3. 讨论
目前临床上治疗骨质疏松症的药物多以改善BMD为主，例如维生素D、钙剂、雌激素等，对于BMD的提高有较好效果，但对于骨质疏松引发骨折的危险性评价以及反应骨代谢的情况不能只考虑BMD一个方面，还需要对骨生物力学方面进行探讨，进行综合性评价[9-10]。骨生物力学是对骨结构和骨量的综合研究，很大程度上能直接反应骨的抗骨折能力。骨生物力学中骨的脆弱性和机械完整性研究，通常需要对骨的强度（最大载荷）、能量吸收能力及结构刚度进行评估[11-12]。
恒古骨伤愈合剂源自于云南彝族古方，由三七、黄芪、人参和红花等中药材制成，具有活血益气、接骨续筋、促进骨折愈合等疗效。在临床上，恒古骨伤愈合剂也常用作治疗骨折、骨关节炎、骨质疏松、股骨头坏死、腰椎间盘突出等疾病。孙岩等[13]研究云南彝药恒古骨伤愈合剂对去势雌性大鼠BMD的影响，在第10周通过对给药组和手术组的比较，全身BMD增加1.84%，结果显示其可以延缓去势大鼠骨质疏松中骨量的丢失。Lifen Dai等[14]构建雌激素缺乏型骨质疏松症的新西兰大白兔模型，采用恒古骨伤愈合剂治疗后，通过治疗组与模型组的比较，骨的最大载荷、最大挠度、结构刚度和能量吸收能力均有显著提升，提示了恒古骨伤愈合剂能够有效预防雌激素缺乏性骨质疏松症。
本实验显示：通过对去势树鼩进行90 d药物干预后，给药组与模型组比较，恒古骨伤愈合剂对BMD和骨生物力学均有显著提升，对治疗骨质疏松和预防骨折都有一定作用。其作用机制可能与促进骨分化，抑制骨吸收，促进人骨髓间充质干细胞的增殖及向成骨细胞的分化[15]，上调骨吸收标志物（BALP、OC、PINP）、骨形成蛋白-7等的含量[16]；下调血清中Dickkopf相关蛋白1的水平，增强对Wnt信号通路的刺激[17]；改善脂质代谢紊乱，降低血液中低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油含量以及血浆黏度等方面有联系[18]，影响骨的吸收和形成，提高坚韧性，增强抗骨折能力[19]；提高血管内皮细胞生长因子（VEGF）水平，刺激骨折部位新血管生成[20]；上调碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板衍生因子（PDGF）等调节因子，加速了骨折部位的愈合[21]。另外，在树鼩骨生物力学特性统计分析结果中，给药组在结构刚度和能量吸收能力中，与正常组数值比较有不同程度提高，与2015年Lifen Dai等[14]“兔骨质疏松恒古骨伤愈合剂治疗后骨小梁BV/Tv、Tb.Th、Tb.N增加，BS/Bv、Tb.Sp降低，提高椎体骨密度，降低骨转换率，改善骨微结构，增加骨的强度、刚度和能量吸收，但对脆性没有影响”的结果一致。本研究再次验证了恒古骨伤愈合剂提高骨强度和降低脆性的罕见治疗作用。
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表 1 各组树鼩骨密度比较结果[（
$\bar x \pm s$ ），g/cm2]Table 1. Comparison of bone density of tree shrews in each group[（
$\bar x \pm s$ ），g/cm2]区域 正常组（n = 10） 给药组（ n = 10） 模型组（ n = 10） 全身（含头部） 0.103 ± 0.012 0.097 ± 0.005* 0.087 ± 0.005**.# 腰 + 盆骨 0.097 ± 0.004 0.088 ± 0.003** 0.083 ± 0.004**.# 颈椎−尾椎 0.096 ± 0.003 0.084 ± 0.004** 0.078 ± 0.005**.## 左骨盆 0.099 ± 0.011 0.087 ± 0.006** 0.082 ± 0.004**.# 右骨盆 0.098 ± 0.005 0.091 ± 0.004* 0.088 ± 0.005** 腰椎 0.096 ± 0.002 0.090 ± 0.004** 0.083 ± 0.005**.# 腰 + 骶骨 0.093 ± 0.006 0.087 ± 0.004* 0.081 ± 0.005**.# 全身（不含头部） 0.092 ± 0.003 0.084 ± 0.004* 0.082 ± 0.004** 与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与给药组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 
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表 2 各组树鼩骨生物力学特性统计分析结果[（
$\bar x \pm s$ ），n = 10]Table 2. Results of statistical analysis of the biomechanical properties of tree shrew bone in each group[（
$\bar x \pm s$ ），n = 10]项目 正常组 给药组 模型组 最大载荷（N） 50.13 ± 7.75 47.75 ± 4.43 41.31 ± 4.43**.## 结构刚度（N/mm） 72.52 ± 19.76 76.63 ± 6.42 53.18 ± 7.99**.## 能量吸收能力（N/mm） 53.64 ± 12.21 59.95 ± 9.81* 41.52 ± 8.32**.## 与正常组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与给药组比较，##P < 0.01。
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