Mechanism of Biliverdin in Improving Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats
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摘要:
目的 探讨胆绿素对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用以及机制。 方法 采用线栓法建立大鼠大脑中动脉栓塞模型（middle cerebral artery occlusion model，MCAO），给予胆绿素治疗后，采用改良版神经功能缺损评分评价大鼠神经功能缺损情况，干湿重法测定脑组织含水量，TTC染色测定脑梗死面积，Iba-1/DAPI染色标记缺血侧脑组织小胶质细胞活化情况，免疫荧光染色检测脑组织炎症因子TNF-α表达，Western blot测定脑组织Iba-1/CD68的蛋白表达。 结果 和IR组比较，胆绿素治疗可改善MCAO大鼠的神经功能缺损（P < 0.05），同时，还能减轻脑组织含水量（P < 0.05），降低大脑梗死面积（P < 0.05），以及降低缺血侧脑组织中小胶质细胞的表达和Iba-1/CD68蛋白的表达（P < 0.05）。此外，胆绿素治疗还能减少缺血侧脑组织中炎症因子TNF-α的表达（P < 0.05）。 结论 胆绿素在MCAO大鼠中可能通过抑制小胶质细胞活化而减轻大鼠脑缺血再灌注损伤。 Abstract:Objective To investigate the protective effect and underlying mechanism of biliverdin on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Methods The middle cerebral artery occlusion model（MCAO）was established by inserting nylon thread, after biliverdin treatment, the neurological deficit were evaluated by modified neurological severity score, the brain water content were detected by dry and wet weight method, the cerebral infarction were detected by TTC staining, the activation of microglia in ischemic brain tissue were marked by Iba-1/DAPI staining, the expression of TNF-α were detected by immunofluorescence staining, the protein expression of Iba-1/CD68 were detected by Western blot. Results Compared with the IR group, after biliverdin treatment, the neurological deficits were improved（P < 0.05）, Meanwhile, the brain water content was reduced（P < 0.05）, and the cerebral infarction were attenuated（P < 0.05）. What's more, the microglia expression and Iba-1/CD68 protein expression were decreased（P < 0.05）and the inflammatory factor TNF-α expression was also reduced（P < 0.05）. Conclusion Biliverdin may attenuate cerebral ischemia-reperfusion injury by inhibiting microglia activation in rats. -
Key words:
- Biliverdin /
- Microglia /
- Cerebral ischemia reperfusion injury
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脂质体（Liposomes）是一种类生物膜结构磷脂双分子层构成的封闭囊泡，兼具佐剂和载体功能[1]。脂质体大小从几十纳米到十几微米，按结构和粒径的不同可以将其分为小单室脂质体（10～200 nm）、大单室脂质体（0.2～1 µm）和多室脂质体（1～5 µm）[2]。脂质体能够包裹多种分子，如抗原或免疫调节化合物，并促进将这些物质靶向输送到特定的免疫细胞[3]。研究表明[4-6]，脂质体与抗原单纯混合使得抗原免疫原性增强，脂质体包裹的抗原免疫原性更强，且可改变免疫应答的类型和方式，可同时诱导体液和细胞免疫，明显优于细胞免疫诱导力差的铝佐剂，增强体液免疫，抗体滴度升高、免疫持续时间长，还可产生免疫记忆。
本实验采用薄膜分散法和冻融冻干法制备流感疫苗脂质体，通过比较包封率、粒径和免疫原性，选择最佳制备方法；采用最佳制备方法制备流感疫苗脂质体冻干粉，筛选出适合的流感疫苗脂质体粒径。
1. 材料与方法
1.1 流感疫苗
H1N1（批号：201910001），血凝素含量：299 µg/mL；H3N2（批号：201911001），血凝素含量：282 µg/mL；B（V）（批号：201911003），血凝素含量：223 µg/mL；B（Y）（批号：201912005），血凝素含量：147 µg/mL；均由江苏沃森生物技术有限公司提供。
1.2 实验动物
SPF级KM种小鼠，雌性，标准体重（18～22 g），昆明医科大学实验动物中心提供[合格证号为SCXK9（滇）2005-0008]。
1.3 主要试剂及仪器
大豆卵磷脂（北京美亚斯磷脂技术公司）、胆固醇（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、Folin-酚蛋白定量试剂盒（北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司）、特级胎牛血清（美国eBioscience公司）、MTT（北京博奥拓达科技有限公司）、RDE（Ⅱ）受体破坏酶（Denka），超声破碎仪（美国SONICS VCX-150），冷冻干燥机（美国LABCONCO 4.5L），低温超高速离心机（日本日立，SCP85H），BIO-RAD iMark TM酶标仪（美国伯乐公司）。
1.4 四价流感疫苗的配制方法
将4个单价的流感疫苗血凝素按比例稀释：H1N1稀释8.31倍，H3N2稀释7.83倍，B（V）稀释6.19倍，B（Y）稀释4.08倍，使每个单价流感的血凝素含量为36 μg/mL，然后将36 μg/mL的单价流感疫苗充分混合形成36 μg/mL的四价流感疫苗原液。
1.5 两种方法制备脂质体冻干粉
（1）薄膜分散法：精密称取胆固醇80 mg和大豆卵磷脂300 mg溶于20 mL无水乙醇中，完全溶解后减压旋转蒸发至成膜状态，四价流感疫苗和磷酸盐缓冲溶液（PBS）按1.4∶1混合，得流感疫苗脂质体混悬液，0.06 mbar，-52℃下冷冻干燥28 h即得脂质体冻干粉[7]；（2）冻融冻干法：精密称取胆固醇80 mg和大豆卵磷脂300 mg溶于20 mL无水乙醇中，完全溶解后减压旋转蒸发至成膜状态后加入PBS 30 mL，50℃水化旋转45 min，间歇超声（超30 s停30 s，功率60%），50℃水浴孵育1 h，取出冷至常温，四价流感疫苗溶液和脂质体混悬液按1.4∶1混合，-40℃冻融2次，0.06 mbar，-52℃下冷冻干燥28 h即得脂质体冻干粉[8]。
1.6 粒径分析
取脂质体冻干粉用一定量PBS充分溶解后取少量滴于载玻片上进行显微观察，Nano measurer 1.2软件对脂质体粒径进行分析。
1.7 包封率的测定
采用低温超高速离心法分离脂质体与游离药物，用Lowry法测定包封率[9]。
包封率（En%） = 总蛋白含量（µg） - 游离蛋白含量（µg）/总蛋白含量（µg）×100%
1.8 免疫原性考察
小鼠随机分为PBS阴性对照组、疫苗原液阳性对照组、冻融冻干法组和薄膜分散法组，每组5只。（1）细胞免疫：小鼠免疫7 d，无菌条件下，取脾脏研磨，制备脾淋巴细胞悬液，将细胞数调整为3.0×106个/mL。参照文献[10]采用MTT法检测细胞增殖水平，以刺激指数（SI）评价其细胞免疫；（2）体液免疫：小鼠免疫7 d，取免疫后小鼠血清，参照文献[11]采用血凝抑制法（HI）测定血清的抗体滴度，评价其体液免疫，免后与免前抗体滴度比≥4认为产生有效体液免疫。
1.9 粒径对流感疫苗脂质体冻干粉免疫原性影响
制备脂质体混悬液，通过调整超声功率和时间，制备出不同粒径的脂质体，超声后具体操作步骤同1.2.3。小鼠随机分为PBS阴性对照组、原液阳性对照组、3.7 µm组、2.0 µm组、1.0 µm组、0.45 µm组，每组5只。免疫7 d、14 d、28 d后通过MTT法检测脾淋巴细胞增殖水平[9]评价粒径对细胞免疫原性影响；采用血凝抑制法（HI）测定血清的抗体滴度，探讨粒径对体液免疫原性的影响。
1.10 统计学处理
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析，多组间比较选择单因素方差分析，以P < 0.05认为差异有统计学意义，统计结果以均值±标准差（
$ \bar x \pm s $ ）表示。2. 结果
2.1 2 种制备方法脂质体的平均粒径和包封率
薄膜分散法制备（图1A）的脂质体分布不均一，粒径范围稍大，冻融冻干法（图1B）制备的脂质体分布均一，且粒径范围小；2种方法制备流感疫苗脂质体冻干粉包封率和平均粒径，见表1。
表 1 2种制备方法脂质体的平均粒径和包封率Table 1. Average particle size and encapsulation efficiency of liposomes prepared by the two methods制备方法 平均粒径（µm） 包封率（%） 薄膜分散法 3.71 82.43 冻融冻干法 2.82 87.48 2.2 2 种制备方法脂质体的细胞免疫
小鼠腹腔免疫7 d后，淋巴细胞增殖能力实验结果见表2。通过单因素方差分析，各免疫组与PBS阴性组比较差异有统计学意义（P < 0.05），各实验组与冻融冻干法组比较差异有统计学意义（P < 0.05），且冻融冻干法组SI值高于各实验组，表明冻融冻干法制备的流感疫苗脂质体前期能增强细胞免疫效应。
表 2 制备方法筛选时的ConA SI（n = 5，$ \bar x \pm s $ ）Table 2. ConA SI during preparation method screening （n = 5，$ \bar x \pm s $ ）制备方法 SI值 薄膜分散法 1.2512 ± 0.0340*# 冻融冻干法 1.3386 ± 0.0136** 疫苗原液组 1.1681 ± 0.1377*# PBS阴性对照组 0.9503 ± 0.0621## 与PBS阴性对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01；与冻融冻干法组比较，#P < 0.05，##P < 0.01。 2.3 种制备方法脂质体的体液免疫
小鼠腹腔免疫7 d后，免后与免前的HI值实验结果如表3。免疫第7天，各免疫组的抗体滴度比HI均≥4，冻融冻干组和薄膜分散组的抗体滴度比大于原液组，且冻融冻干组的抗体滴度比大于薄膜分散组，结果表明冻融冻干法和薄膜分散法制备的流感疫苗脂质体具有良好的免疫原性，且冻融冻干法免疫效果较好。
表 3 制备方法筛选时HI值（n = 5）Table 3. HI value at the time of preparation method screening （n = 5）制备方法 HI值 薄膜分散法 5.50 冻融冻干法 5.75 疫苗原液组 4.10 PBS阴性对照组 - 注：免后免前抗体滴度比 > 4表明具有免疫效应。 2.4 不同粒径流感疫苗脂质体包封率
通过调整细胞破碎仪超声时间和功率，显微观察，用Nano measurer 1.2 软件对脂质体粒径进行分析得到平均粒径为3.7 µm、2.0 µm、1.0 µm、0.45 µm 4种不同粒径的脂质体，包封率测定结果，见表4。
表 4 不同粒径脂质体的包封率（%）Table 4. Encapsulation efficiency of liposomes with different particle sizes粒径大小 3.7 µm 2.0 µm 1.0 µm 0.45 µm 包封率 92.92 89.16 88.25 86.35 2.5 不同粒径流感疫苗脂质体的细胞免疫
小鼠免疫7 d、14 d和28 d的脾淋巴细胞增殖能力如表5。在一个免疫周期内，各实验组和原液组与PBS组比较差异有统计学意义（P < 0.05）， 较大粒径组（3.7 µm组和2.0 µm组）的SI值高于原液组，且3.7 µm组SI值大于2.0 µm组，与疫苗原液组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。说明粒径较大的脂质体疫苗使脾淋巴细胞增殖能力增强，产生细胞免疫，且3.7 µm组产生细胞免疫更强。
表 5 7 d、14 d、28 d时ConA SI（n = 5，$ \bar x \pm s $ ）Table 5. ConA SI at 7，14，28 d （n = 5，$ \bar x \pm s $ ）分组 SI值 7 d 14 d 28 d 3.7 µm 1.3386 ± 0.0136**# 1.1739 ± 0.0771**# 1.1722 ± 0.1420**# 2.0 µm 1.3128 ± 0.0522**# 1.1675 ± 0.0764**# 1.1209 ± 0.1218**# 1.0 µm 1.1417 ± 0.1470* 1.1341 ± 0.1214* 1.0979 ± 0.1120* 0.45 µm 1.0816 ± 0.0594* 1.0550 ± 0.0330* 1.0618 ± 0.0492* 原液 1.1681 ± 0.1377* 1.0418 ± 0.0910* 1.0421 ± 0.0413* PBS 0.9503 ± 0.0621# 0.8898 ± 0.1129# 0.8414 ± 0.0159# 与PBS阴性对照组比较, *P < 0.05，**P < 0.01；与原液组比较,#P < 0.05，##P < 0.01。 2.6 不同粒径流感疫苗脂质体的体液免疫
血凝抑制实验结果如下表6所示。由表5可知，在一个免疫周期内，各免疫组HI值均≥4，表明产生有效体液免疫；较大粒径组（3.7 µm组和2.0 µm组）的HI值明显高于其他组，且3.7 µm组的HI值大于2.0 µm组。结果表明在一个免疫周期内各免疫组都能刺激机体产生有效的体液免疫，且3.7 µm组产生体液免疫效应最强。
表 6 7 d、14 d、28 d时抗体滴度比（n = 5）Table 6. Antibody titer ratio at 7，14，28 d （n = 5）分组 HI值 7 d 14 d 28 d 3.7 µm 5.25 5.54 7.84 2.0 µm 5.09 5.47 7.55 1.0 µm 4.72 5.26 7.11 0.45 µm 4.60 5.05 6.44 原液 4.36 5.15 6.88 PBS - - - 注：免后免前抗体滴度比 > 4表明具有免疫效应。 3. 讨论
最佳制备方法冻融冻干法制备的脂质体流感疫苗包封率为87.48%，脂质体粒径均一。冻融冻干法在反复冻融的过程中能包封更多的疫苗，使得包封率增大，免疫效应也增强。通过改变超声功率和时间制得平均粒径为3.7 µm、2.0 µm、1.0 µm和0.45 µm 4种不同粒径脂质体，随着粒径的减小，包封率也逐渐下降，较大粒径脂质体流感疫苗能产生较好的细胞和体液免疫，且3.7 µm免疫效果更强。
脂质体作为佐剂的流感疫苗能产生良好的免疫原性，且粒径较大的脂质体疫苗产生的免疫较强。研究表明[12-13]，脾脏对脂质体的吸收与巨噬细胞的吞噬能力有关，体内的吞噬细胞会较快的识别相对较大的脂质体，吞噬能力随粒径增大而增强，较大粒径的脂质体疫苗能被网状吞噬系统快速识别，携带至靶向器官，有利于抗原刺激免疫器官，诱导机体产生免疫反应，增强免疫原性。然而，脂质体粒径过大血管通透性差，导致脂质体不能通过肝血管的细胞间隙，易被网状内皮系统吞噬清除，较小粒径的脂质体（180 nm）使药物的血药浓度和生物利用度明显的提高，虽能增加靶部位聚集和延长半衰期，但易相互聚集融合致抗原渗漏[14-15]。安全性良好，可生物降解，生物相容性好是脂质体最大的优点，但是脂质体稳定性差限制它的广泛运用，且目前流感疫苗大多数为液体制剂，存在稳定性差和冷链运输压力等不足，本实验采用冻融冻干法制备流感疫苗脂质体冻干粉，制备过程简单易行，且稳定性得到一定改善。
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图 1 mNSS评分结果（n = 8）
与Sham组比较，***P < 0.001；与IR组比较，#P < 0.05。
Figure 1. The result of mNSS score(n = 8)
图 2 大鼠脑组织含水量测定结果
与Sham组比较，*P < 0.05；与IR组比较，#P < 0.05。
Figure 2. The results of water content detection in brain tissues of in MCAO rats
图 3 胆绿素对MCAO大鼠缺血侧脑梗死面积的影响
A：不同组大鼠脑组织TTC染色结果。B：三组大鼠脑梗死面积比的统计结果。与Sham组比较，***P < 0.001；与IR组比较，#P < 0.05。
Figure 3. Effects of Biliverdin on brain infarction volume in MCAO rats
图 4 胆绿素对MCAO大鼠缺血侧小胶质细胞活化的影响
A：小胶质细胞在三个实验组中的免疫荧光双染结果。B：Iba-1和CD68在三个实验组中的WB结果；C：Iba-1和CD68在三个实验组中的WB结果分析。与Sham组比较，**P < 0.01；与IR组比较，#P < 0.05。
Figure 4. Effects of Biliverdin on activation of microglia in MCAO rats
图 5 胆绿素对MCAO大鼠缺血侧小胶质细胞释放TNF-α的影响
A：Iba-1/TNF-α的免疫荧光双染结果；B：TNF-α阳性细胞数比统计结果。与Sham组比较，***P < 0.001；与IR组比较，#P < 0.05。
Figure 5. Effect of biliverdin on the release of TNF-α from microglia in MCAO rats
表 1 动物分组和处理
Table 1. Animal grouping and treatment
组别 处理 检测指标 数量 Sham组 只暴露颈内动脉，不做其他处理 mNSS/干湿重 n = 8 TTC染色 n = 4 WB n = 4 免疫荧光双染 n = 8 IR组 缺血2 h再灌注24 h mNSS/干湿重 n = 8 TTC染色 n = 4 WB n = 4 免疫荧光双染 n = 8 IR + BV组 缺血2 h再灌注24 h + 胆绿素治疗 mNSS/干湿重 n = 8 TTC染色 n = 4 WB n = 4 免疫荧光双染 n = 8 
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