宫颈癌是全球女性中第四大常见肿瘤，主要致病因素是高危型人乳头瘤病毒的持续性感染^[1]。80%以上的女性在一生中经历过至少1次人乳头瘤病毒（human pappilomavirus，HPV）感染，但90%以上的HPV感染可在2 a内自然清除，仅不足1%的患者可能发展成为癌前病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），甚至引发宫颈癌（cervical cancer，CC）^[2]。癌前病变一般依据宫颈上皮内瘤变的严重程度划分为CIN1、CIN2、CIN3。目前，与宫颈癌发生相关的高危型HPV型别主要包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68等^[3]。

1989年，Lörincz等^[4]在华盛顿特区1名妇女的CIN组织样本中首次发现了HPV56基因型。尽管HPV56感染导致宫颈癌发生的比例在全球范围来看相对较小，但在亚洲地区，特别是中国，HPV56具有相对较高的检出率。2014年，Yang等^[5]在中国西南地区74例宫颈癌组织标本中发现HPV56阳性率为1.64%（1/74）。2019年，Zhao等^[6]对华北地区HPV56的感染率研究表明，在宫颈正常组中单一感染HPV56型阳性率为0.66%（61/9256）；在癌前病变组中单一感染HPV56型在CIN1期的阳性率为6.80%（7/103），在CIN2期为0%（0/97）。以上研究数据表明，HPV56在癌前病变组和宫颈癌组中的感染率远高于宫颈正常组， HPV56可能在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用。

HPV基因组分为3个功能区，分别是长控制区，早期基因区和晚期基因区^[7]。长控制区主要调控病毒的转录和复制，控制病毒蛋白和感染颗粒的产生；早期基因区编码产生E1，E2，E4，E5，E6和E7蛋白，其中E6和E7蛋白为病毒癌蛋白，在细胞癌变过程中发挥极其重要的作用；晚期基因编码产生在病毒颗粒自我组装以及侵入目标细胞时起协调和识别作用的L1和L2病毒衣壳蛋白^[7]。研究表明^[8-11]HPV基因变异可导致致癌风险发生改变，特别是E6和E7。E6和E7基因变异可导致编码氨基酸改变而使致癌能力发生改变。另外，L1基因变异导致的L1氨基酸序列变化可能会对病毒的抗原性和感染能力造成影响^[12]。研究表明^{[13- 14]}，根据L1基因的序列变异特征，HPV56分为A谱系和B谱系。

本研究以云南省宫颈癌癌前病变患者为研究对象，将患者组织样本进行HPV分型，选取单一感染HPV56的样本提取基因组，扩增得到HPV56 E6，E7和L1基因，并对获得基因序列进行测序，以此分析云南地区HPV56谱系分布特征及E6，E7和L1基因的遗传变异数据，为进一步HPV56疫苗研发及相应的诊断和治疗提供参考数据。

1.   资料与方法

1.1   样本采集

选取2022年2月至2023年2月昆明医科大学第三附属医院妇瘤科宫颈癌癌前病变患者作为研究对象，采集宫颈组织样本，将组织样本保存于组织保存液中，-80℃保存。诊断标准依据《临床诊疗指南-妇产科学分册》^[15]，研究对象纳入标准为：（1）所有患者有性生活史；（2）单一宫颈、无其它宫颈病变。研究对象排除标准为：（1）未接受过化疗、放疗、手术等抗肿瘤治疗；（2）未合并或继发其他恶性肿瘤。所有研究对象均为彼此之间无血缘关系并且长期居住于云南地区的汉族个体，研究方案经昆明医科大学第三附属医院伦理审查委员会批准（KYCS2021193），所有样本采集均征得本人知情同意。

1.2   样本DNA提取

取-80℃冷冻保存的宫颈组织样本30～60 mg，于室温融化。加入钢珠及600 mL Buffer RLT，置于超声破碎仪，50 HZ破碎2 min，取出钢珠，8 000 r/min离心3 min。取上清置于新的离心柱，8000 r/min离心1 min，而后加入500 μL AW1于8 000 r/min离心30 s，弃上清。每个样本中再加入500 μL AW2后14000 r/min离心2 min。加入100 μL EB，室温孵育10 min，然后8 000 r/min离心1 min。得到的溶液即含释放的DNA，取出备用。

1.3   HPV检测分型

使用基于核酸分子导流杂交系统的HPV分型检测试剂盒（凯普生物科技有限公司）对样本DNA进行HPV分型。

1.4   HPV56 E6、E7、L1基因扩增测序

根据分型结果，选取检测出单一HPV56阳性的患者作为研究对象，扩增HPV56 E6、E7、L1基因。根据参考文献^[13]设计针对HPV56 E6、E7、L1基因的扩增和测序引物，交由生工生物工程（上海）有限公司合成。用于设计扩增引物和测序引物的HPV56序列为X74483.1，各基因的扩增引物和测序引物，见表1。PCR反应体积为50 μL，反应条件为98℃预变性2 min，98℃变性10 s，Tm℃退火5 s，72℃延伸45 s，72℃延伸5 min，共35个循环。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳成像验证后，把PCR原液送交生工生物工程（上海）有限公司测序。

表  1  HPV56 E6、E7、L1基因的扩增引物和测序引物

Table  1.  The amplification primers and sequencing primers of E6 E7 and L1 genes of HPV56

基因	方向	序列5′-3′	退火温度℃
E6	Forward	ATTGGGAGTGACCGAAAAGG	63
	Reverse	ACAACACGCAGGTCCTCTTT
E7	Forward	GCTACAGATGTCAAAGTCCG	61
	Reverse	GCCTCTACTTCAAACCATCC
L1-1	Forward	GCCCCTTTAGGTAATGTGTGG	63
	Reverse	CCACATAGAATCACCATAGGCAT
L1-1	Forward	ATGATAGACACAGGATTTGGCG	63
	Reverse	ATACAACACACAAACACAGTTACAC

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1.5   HPV56 E6、E7、L1基因变异和系统发生树分析

将测序所得的HPV56 E6、E7、L1基因序列分别用Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）v 7.0软件中的Clustal W多重比对工具进行比对，而后分析基因序列的变异情况。用于分析基因变异情况的参考序列下载于GenBank，登录号为X74483.1。选用Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA）v 7.0软件中的ML法来构建系统发育树，通过bootstrap值为1000对树的可信度进行评估，选用模型为Kimura 2-parameter（Kimura-2参数）。构树参考序列从GenBank序列数据库下载，参考序列的登录号分别为：EF177176.1、EF177177.1、EF177178.1、EF177179.1、EF177180.1、EF177181.1、KU298915.1、KU298916.1、KU298917.1，KU298918.1和KU298919.1。

1.6   统计学处理

本研究HPV56型E6、E7和L1基因变异发生数的录入及基因变异发生频率的计算等处理均采用Microsoft Excel软件完成。

2.   结果

2.1   HPV56 E6、E7、L1基因扩增情况

本研究通过对300例癌前病变患者组织样本进行检测，发现单一感染HPV56的样本有32例，其中CIN1期16例，CIN2期16例。从32个样本中分别扩增出完整HPV56 E6序列25条（CIN1期14条，CIN2期11条）、HPV56 E7序列23条（CIN1期11条，CIN2期12条）、HPV56 L1序列28条（CIN1期16条，CIN2期12条）。

2.2   HPV56 E6、E7、L1基因的系统发生树分析

本研究用从样本中扩增得到的HPV56 E6，E7和L1序列来构建系统发生树，结果表明，扩增得到的HPV56 E6序列中A谱系23例（CIN1期14例，CIN2期9例），B谱系2例（CIN1期0例，CIN2期2例），见图1；HPV56 E7序列中A谱系21例（CIN1期11例，CIN2期10例），B谱系2例（CIN1期0例，CIN2期2例），见图2；28例HPV56 L1序列中A谱系26例（CIN1期16例，CIN2期10例），B谱系2例（CIN1期0例，CIN2期2例），见图3。

图  1  HPV56 E6基因系统发生树

Figure  1.  Phylogenetic tree of E6 of HPV56

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图  2  HPV56 E7基因系统发生树

Figure  2.  Phylogenetic tree of E7 of HPV56

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图  3  HPV56 L1基因系统发生树

Figure  3.  Phylogenetic tree of L1 of HPV56

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2.3   HPV56 E6、E7、L1基因的变异分析

经比对扩增得到的HPV56 E6，E7和L1基因系列，发现共存在13个遗传变异位点，其中E6基因中6个、E7基因中4个、L1基因中3个，见表2。E6基因中发现6个核苷酸变异，分别是A141C（S14R）、T158C（S19S）、A241G（N47S）、A263C（K54N），G279A（D60N）和G437A（P112P），其中A141C（S14R）、A241G（N47S）、A263C（K54N）变异占扩增序列的8.0%，T158C（S19S）、G279A（D60N）、G437A（P112P）变异占扩增序列的92.0%，见表2。E7基因中发现4个核苷酸变异，分别为C601A（D10E）、G605A（V12I），G770C（E67Q）和G802C（Q77H），其中C601A（D10E）和G770C（E67Q）变异占扩增序列的91.3%，G605A（V12I）变异占扩增序列的8.7%，G802C（Q77H）变异占扩增序列的13.0%，见表2。L1基因中发现3个核苷酸变异，分别为A5867G（N126D），G6454T（P321P）和A6868C（I459I），其中G6454T（P321P）发生100%变异，A5867G（N126D）和A6868C（I459I）变异占扩增序列的96.4%，见表2。

表  2  HPV56 E6、E7、L1基因变异情况

Table  2.  E6，E7 and L1 gene variation of HPV56

核苷酸位置	E6							E7					L1
	141	158	241	263	279	437		601	605	770	802		5867	6454	6868
X74483.1-E6	A	T	A	A	G	G		C	G	G	G		A	G	A
cin1-2	−	C	−	−	A	A		A	−	C	C		G	T	C
cin1-4	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-5	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		0	0	0
cin1-6	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		0	0	0
cin1-7	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-8	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-9	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-10	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-12	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-14	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-16	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin1-17	−	C	−	−	A	A		0	0	0	0		G	T	C
cin1-19	−	C	−	−	A	A		0	0	0	0		0	0	0
cin1-20	−	C	−	−	A	A		0	0	0	0		G	T	C
cin1-21	0	0	0	0	0	0		0	0	0	0		G	T	C
cin1-22	0	0	0	0	0	0		0	0	0	0		G	T	C
cin2-2	0	0	0	0	0	0		A	−	C	−		0	0	0
cin2-5	0	0	0	0	0	0		A	−	C	−		0	0	0
cin2-12	0	0	0	0	0	0		A	−	C	−		0	0	0
cin2-16	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin2-18	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		0	0	0
cin2-19	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin2-22	0	0	0	0	0	0		A	−	C	−		0	0	0
cin2-28	−	C	−	−	A	A		0	0	0	0		G	T	C
cin2-29	−	C	−	−	A	A		0	0	0	0		0	0	0
cin2-32	−	C	−	−	A	A		0	0	0	0		G	T	C
cin2-33	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		0	0	0
cin2-34	−	C	−	−	A	A		0	0	0	0		0	0	0
cin2-35	−	C	−	−	A	A		A	−	C	−		G	T	C
cin2-37	0	0	0	0	0	0		A	−	C	−		G	T	C
cin2-42	C	−	G	C	−	−		−	A	−	C		0	0	0
cin2-46	C	−	G	C	−	−		−	A	−	C		0	0	0
氨基酸变化	S14R	−	N47S	K54N	D60N	−		D10E	V12I	E67Q	Q77H		N126D	−	−
标记为“0”的部分表示未扩增/测出基因序列; 标记为“-”的部分表示未检测到变异。

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3.   讨论

HPV56是导致宫颈癌发生的高危型HPV之一^[16]，其感染率在1.1%～10.9%之间，尤其在亚洲地区具有相对较高检出率^{[6, 17-19]}。因此，本研究对云南地区CIN患者中HPV56型E6、E7和L1基因进行了测序，并基于以上3个基因的序列数据对云南地区HPV56谱系特征及其变异特征进行了分析。

在本研究中，HPV56 L1基因系统发生树结果显示，92.9%的患者感染的HPV56病毒属于A谱系（26/28），而仅有7.1%的患者属于B谱系（2/28）。2018年，Jing等^[13]对四川地区HPV56分布特征进行研究，结果显示，50.0%的患者感染属于A谱系（8/16），50.0%的患者属于B谱系（8/16）。该结果表明，在四川地区和云南地区流行的HPV56型的L1基因存在一定的差异，所以造成了基于L1获得的谱系分析结果存在差异。2015年，Wu等^[20]对四川地区宫颈癌患者中HPV16进行分子流行病学调查后发现，四川地区HPV16类型主要属于欧洲谱系（病例组：86.7%），但是在云南地区HPV16以亚洲谱系为主导地位（病例组：72.7%）^[21]。该研究结果之间的差异也充分说明四川和云南人群所感染的HPV谱系是存在一定差异的。

E6蛋白是HPV主要的2个致癌蛋白之一，在宫颈癌的发生发展中发挥着极其重要的作用。HR-HPV E6蛋白可通过直接或间接调控PI3K/AKT/mTOR、p53等细胞凋亡信号传导中的关键蛋白、从而促进肿瘤的发生发展^[22-23]。HPV E6蛋白含有2个CXXC-X29 -CXXC锌指结构，分别位于E6蛋白的33-69和106-142氨基酸序列区域。本研究发现A241G（N47S），A263C（K54N）和G279A（D60N）非同义突变均位于HPV56 E6蛋白的第1个锌指结构区域内，这些位点的变异可能会导致HPV56 E6蛋白的锌指结构区域折叠结构的改变或是与E6靶标的结合而影响E6蛋白的功能^[23-24]。同时，本研究发现A141C（S14R）和A263C（K54N）变异，但2008年，Hiller等^[25]研究发现携带A141C（S14R）和A263C（K54N）突变的HPV56变异株的E6蛋白与HPV56原型的E6蛋白在促使p53 降解的功能上并无差异。因此，尽管A141C（S14R）和A263C（K54N）在云南地区CIN患者中存在变异，但这2个变异可能与CIN和宫颈癌的进展无关。

E7蛋白是HPV另一个重要的致癌蛋白，主要是通过与视网膜母细胞瘤蛋白质（Rb）家族结合促使Rb家族蛋白水解而刺激细胞周期失控，进而促进宫颈癌的发生发展。HPV E7蛋白N端一般含有2个保守区域（CR1和CR2），与Rb家族蛋白结合的LXCXE基序和酪蛋白激酶II磷酸化位点位于CR2区域内，另外，在E7蛋白的C端含有1个和E6蛋白相似的CXXC-X29 -CXXC锌指结构^[26]。本研究发现4个非同义突变中的C601A（D10E）和G605A（V12I）位于E7蛋白的CR1区域内，G770C（E67Q）和G802C（Q77H）位于E7锌指结构区域，CR2区域的LXCXE基序未发现突变，提示CR2区域可能在E7基因中较CR1及锌指结构保守。

HPV L1蛋白是HPV病毒的衣壳蛋白，是HPV病毒的主要结构蛋白，在病毒DNA导入宿主细胞并整合进入宿主细胞染色体过程中起着重要作用。研究表明L1蛋白可以作为人体细胞免疫反应靶蛋白被用于HPV疫苗的研究中^[26]。有研究表明，HPV L1基因变异而引起的氨基酸改变会影响L1蛋白的自我组装和免疫细胞对VLPS的识别从而导致免疫原性产生差异以及造成免疫逃逸发生^{[27- 28]}。Jing等^[13]发现HPV56 L1基因中引起K116M 和N126D氨基酸变化的变异可能具有破坏性，而本研究所发现的HPV56 L1基因的3个变异位点中有仅A5867G（N126D）为非同义突变，而未发现存在导致K116M氨基酸改变的变异。

在HPV疫苗研究中，预防性疫苗主要关注点在于HPV L1的特征研究，而治疗性疫苗则主要关注于HPV E6和E7的特征研究，为此，本研究为了解HPV56的变异特征和疫苗研发提供了参考数据。本研究的局限性主要在于由于HPV56在人群中感染比例较小，故纳入本研究的样本数量有限，从而导致在分析基因变异及HPV56谱系分布特征代表性可能不足。