留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

PCR-反向点杂交法耐药基因检测和BD960结核菌药敏在耐药结核病检测中的应用价值

李晓琴,  周敏,  王霖,  曾海燕,  骆鹏举,  林丽佳

downloadPDF
文章导航 > 昆明医科大学学报  > 2020 >  41(12): 138-141
李晓琴, 周敏, 王霖, 曾海燕, 骆鹏举, 林丽佳. PCR-反向点杂交法耐药基因检测和BD960结核菌药敏在耐药结核病检测中的应用价值[J]. 昆明医科大学学报, 2020, 41(12): 138-141. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20201238
引用本文: 李晓琴, 周敏, 王霖, 曾海燕, 骆鹏举, 林丽佳. PCR-反向点杂交法耐药基因检测和BD960结核菌药敏在耐药结核病检测中的应用价值[J]. 昆明医科大学学报, 2020, 41(12): 138-141. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20201238
shu
Xiao-qin LI, Min ZHOU, Lin WANG, Hai-yan ZENG, Peng-ju LUO, Li-jia LIN. Efficacy of PCR-reverse Dot Hybridization in Drug Resistance Gene Detection and Drug Sensitivity of BD960 Tuberculosis in Drug Resistance Tuberculosis Detection[J]. Journal of Kunming Medical University, 2020, 41(12): 138-141. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20201238
Citation: Xiao-qin LI, Min ZHOU, Lin WANG, Hai-yan ZENG, Peng-ju LUO, Li-jia LIN. Efficacy of PCR-reverse Dot Hybridization in Drug Resistance Gene Detection and Drug Sensitivity of BD960 Tuberculosis in Drug Resistance Tuberculosis Detection[J]. Journal of Kunming Medical University, 2020, 41(12): 138-141. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20201238
shu

PCR-反向点杂交法耐药基因检测和BD960结核菌药敏在耐药结核病检测中的应用价值

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20201238
  • 1.

    昆明市第三人民医院检验科

  • 2.

    综合结核科，云南 昆明　650301

基金项目: 昆明市卫计委医药卫生科技计划基金资助项目(2018-03-02-001)
详细信息
    作者简介:

    李晓琴（1979～），女，云南昆明人，本科，副主任检验师，主要从事感染性疾病临床医学检验工作

    通讯作者:

    周敏，E-mail： 952025400@qq.com

  • 中图分类号: R446.6

Efficacy of PCR-reverse Dot Hybridization in Drug Resistance Gene Detection and Drug Sensitivity of BD960 Tuberculosis in Drug Resistance Tuberculosis Detection

  • 1.

    Dept. of Laboratory

  • 2.

    Dept. of Tuberculosis，The 3rd People’ s Hospital of Kunming，Kunming Yunnan 650301，China

摘要

    摘要
  • 摘要:   目的   分析PCR-反向点杂交法耐药基因检测和BD960结核分枝杆菌药物敏感性试验在结核分枝杆菌耐药性方面的差异，并探讨其临床应用价值。   方法   收集356例昆明市第三人民医院结核科住院患者的痰和灌洗液标本，分别用2种方法检测异烟肼（H）、利福平（R）、链霉素（S）、乙胺丁醇（E）的药物敏感性，结果通过校正卡方检验对比分析。   结果   2种检测方法对单耐药、多耐药、耐多药结核菌检测，在99%的置信区间，校正χ2均是P < 0.01。   结论   可认为2种方法对3种耐药的检测有差异性。结核菌药敏试验耐多药PCR-反向点杂交法优于BD960检测；单耐药、多耐药BD960药敏优于PCR-反向点杂交法。
    Abstract:   Objective   To analyze the difference between PCR-reverse dot hybridization drug resistance gene detection and BD960 Mycobacterium tuberculosis drug sensitivity test in identifying drug resistance of Mycobacterium tuberculosis, and to discuss its clinical efficacy.   Methods   The drug sensitivity of isoniazid (H), rifampicin (R), ethambutanol (E) and streptomycin (S) in sputum and lavage samples of 356 hospitalized TB patients were collected in The 3rd People's Hospital of Kunming were detected simultaneously by two testing methods. The results were compared and analyzed by correction χ2 test.   Results   Single drug resistance, multi-drug resistance and MDR were detected by the two testing methods. On the 99% confidence interval, the adjusted chi-square values are all P < 0.01.   Conclusion   The two methods have differences in the detection of three kinds of resistance. The multidrug resistance PCR-reverse dot blot hybridization method of Mycobacterium tuberculosis drug sensitivity test is better than BD960 detection. The drug sensitivity of single drug resistance and multi-drug resistance BD960 is better than PCR-reverse dot hybridization.
    • HTML全文

  • 结核病（tuberculosis，TB）是广泛关注和重点防控的的公共卫生问题之一 [1]。目前临床工作中在结核病的诊断方面，尤其是在涂阳肺结核及结核病耐药方面的诊断主要是通过结核病的相关实验室检测结果来进行证实[2]。随着医学检测技术的不断更新发展，不规律治疗后发生耐药或原始耐药等耐药肺结核患者检出率不断提高，2015年全球结核病诊治过程中，耐药结核病被发现和治疗的只占20%。近年来，耐药结核病的比例在逐年上升。根据2018年全球结核病的调查报告显示，全球2017年结核病患者约1000万例，死亡人数约为130万例，是全球10大死亡原因之一，其中有55.8万人为耐利福平或耐多药的结核病。全国结核病流行病学抽样调查显示，我国的结核病具有高感染率、患病率及病死、高耐药率、低病例发现率、低递减率等特点[3]。云南省结核病疫情因地理特殊和经济原因，防痨工作任重而道远，如何进行准确而快速的结核分枝杆菌耐药性检测，成为防治结核病工作中的首要任务[4]。

    1.   资料与方法

    1.1   病例资料

    回顾性对照研究，选取2 427例昆明市第三人民医院结核科2017年1月至2019年12月住院的肺结核患者阳性标本356例作为研究对象，其中男性173例（173/356，48.59%），女性183例（183/356，51.41%），年龄15～74岁，平均（34.37±0.2）岁。经PCR-反向点杂交法耐药基因与BACTEC MGIT 960 System表型药敏两种方法检测，所有诊断均按照《WS288-2017肺结核诊断》中的诊断标准进行[5]。利用两种方法对356例患者的痰或灌洗液标本同时完成四种一线抗结核药物：异烟肼（H）、利福平（R）、链霉素（S）、乙胺丁醇（E）检测，其中痰126例（126/356，35.39%），灌洗液230例（230/356，64.61%）。本研究经昆明市第三人民医院伦理委员会批准。

    1.2   实验方法及检验步骤

    1.2.1   PCR-反向点杂交法[6]

    PCR-反向点杂交法采用分枝杆菌DNA 22项菌种鉴定+耐药基因检测，实验主要仪器为ETC811 088基因扩增仪（苏州东胜兴业科学仪器有限公司生产）。

    （1）提取DNA，样本通过加入等量4%NaOH前处理后，再加入MTB洗液充分洗涤后加入MTB裂解液提取样本中的DNA；（2）PCR扩增，加待测样品DNA于PCR反应管，之后置于基因扩增仪自动扩增3 h，待温度从50 ℃降至30 ℃左右时取出扩增物并杂交。实验反应条件：50 ℃ 2 min，变性95 ℃ 10 s，退火68 ℃ 60 s，循环30次，95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，循环30次，68 ℃ 10 s；（3）杂交、洗膜、显色，扩增结束后取出离心管，加入扩增物和菌种鉴定膜条，并置于恒温杂交仪，沸水浴10 min。杂交结束后取出膜条，置于洗涤液15 min后放入孵化液，室温孵化30 min。孵化结束后取出膜条于显色液5～10 min，根据膜条显色程度来判读实验结果。

    1.2.2   BACTEC MGIT 960 System实验方法[7]

    使用快速分枝杆菌培养+药敏检测系统（美国BD公司生产）进行实验，运用瓶外非侵入性连续检测技术及荧光检测原理，24 h不间断监测，对结核培养结果自动判断，一般1～2周即可生长。BACTEC MGIT 960 System药敏系统采用Method of Proportion（MOP）的方法来进行结核分枝杆菌的药物敏感性检测，结果判断的临界度取1%。

    同时用2种方法对356例样本进行异烟肼（H）、利福平（R）、乙胺丁醇（E）、链霉素（S）药敏结果分析，以BACTEC MGIT 960 System为标准。

    1.3   统计学处理

    运用SPSS24.0统计软件包对数据进行统计学处理，计数资料用[（n）%]表示，采用配对χ2检验进行结果比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

    2.   结果

    2.1   2种方法单耐药检测的比较

    采用PCR反向杂交法检出单耐药34例，采用BACTEC MGIT 960 System检出单耐药36例，2种检测方法结果符合32例，PCR反向杂交法符合率88.89%（32/36），差异有统计学意义（χ2 = 286.58，P < 0.01），见 表1。

    表  1  PCR反向杂交法和BACTEC MGIT 960 System单耐药检测结果
    Table  1.  PCR Reverse Hybridization and BACTEC MGIT 960 System Single Drug Resistance Detection Results
    PCR反向杂交法 BACTEC MGIT 960 合计（%）
    检出单耐药（n） 未检出单耐药（n）
    检出单耐药（n） 32 2 94.12
    未检出单耐药（n） 4 324 1.22
    合计（%） 88.89 0.61
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    2.2   2种方法多耐药检测的比较

    采用PCR反向杂交法检出多耐药34例，采用BACTEC MGIT 960 System检出多耐药17例，2种检测方法结果符合14例，PCR反向杂交法符合率82.35%（14/17），差异有统计学意义（χ2 =236.78，P < 0.01），见 表2。

    表  2  PCR反向杂交法检和BACTEC MGIT 960 System多耐药检测结果
    Table  2.  PCR Reverse Hybridization and BACTEC MGIT 960 System Multidrug Resistance Detection Results
    PCR反向杂交法 BACTEC MGIT 960 合计（%）
    检出多耐药（n） 未检出多耐药（n）
    检出多耐药（n） 14 2 87.50
    未检出多耐药（n） 3 342 0.86
    合计（%） 82.35 0.58
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    2.3   2种方法耐多药检测的比较

    采用PCR反向杂交法检出耐多药34例，采用BACTEC MGIT 960 System检出耐多药46例，2种检测方法结果符合45例，PCR反向杂交法符合率97.83%（45/46），差异有统计学意义（χ2 =317.49，P < 0.01），见 表3。

    表  3  PCR反向杂交法和BACTEC MGIT 960 System耐多药检测结果
    Table  3.  PCR Reverse Hybridization and BACTEC MGIT 960 System MDR Test Results
    PCR反向杂交法 BACTEC MGIT 960 合计（%）
    检出耐多药（n） 未检出耐多药（n）
    检出耐多药（n） 45 3 93.75
    未检出耐多药（n） 1 311 0.32
    合计（%） 97.87 0.96
    下载: 导出CSV 
    | 显示表格

    3.   讨论

    随着分子生物学检测方法的快速发展，基因芯片技术对结核分枝杆菌利福平及异烟肼的耐药性检测研究被越来越多地应用于临床[8]。利用基因检测可快速检出结核分枝杆菌耐药基因，并作出药物敏感的判别，应用于指导临床诊断及药物方案调整。BACTEC MGIT 960液体培养是建立在MTB培养的基础上，典型的MTB结果呈索状生长（非浑浊的，成颗粒或团块）[9]。国内常用的耐药基因突变检测方法目前主要有：探针杂交技术、高分辨溶解曲线技术、实时荧光定量PCR技术等[10]。PCR-反向点杂交法的技术原理是将聚合酶链式反应（PCR）和高通量反向点杂交技术相结合的基因检测。设计特定的具有生物素标记5′端的PCR引物，扩增得到一定长度的包含所要检测基因耐药突变位点的MTB基因片段。根据不同检测位点碱基的差异，设计特异性识别某种碱基的寡核苷酸探针遵循碱基互补配对原则，用氨基标记探针5′端，将引物以及探针固定在尼龙膜的特定位置上，制成相应的膜条阵列[11-13]。

    本研究以传统药敏结果为标准，356例标本分别用PCR-反向杂交法和BACTEC MGIT 960 System 2种方法分别进行单耐药、多耐药及耐多药3类结核菌耐药检测，样本中单耐药PCR检测出34例，BD960检测出36例；多耐药PCR检测出16例，BD960检测出17例；耐多药PCR检测出48例，BD960检测出46例；差异有统计学意义（P < 0.01），说明PCR-反向点杂交法和BACTEC MGIT 960 System两种方法对样本单耐药、多耐药和耐多药的检测结果均有差异。结合昆明市第三人民医院长期对耐药结核病的诊断治疗经验，探讨结核分枝杆菌耐药检测及其临床意义，鉴于BACTEC MGIT 960 System法检测费用相对较高，检测时间较长。笔者认为在此样本量水平上，在结核分枝杆菌单耐药及多耐药检测中BACTEC MGIT 960 System法优于PCR-反向杂交法，在结核分枝杆菌耐多药检测中PCR-反向杂交法优于BACTEC MGIT 960 System法。有临床研究 [14]认为基因芯片对耐多药结核病的诊断灵敏度和特异度分别为82.5%和99.4%，符合率高达97.8%，这提示基因芯片技术对耐多药结核病的筛查与排除有较高的诊断价值。

    通过PCR-反向杂交法耐药基因检测和BD960结核菌药敏的对比研究分析，本研究认为结核菌培养+药敏实验是目前诊断结核菌耐药的金标准，对单耐药、多耐药检测结果较可靠；PCR-反向杂交法耐药基因检测检出时效性高，可以快速、精准鉴定分枝杆菌菌种，对耐多药检测结果优于传统药物敏感性检测方法。

  • 表  1  PCR反向杂交法和BACTEC MGIT 960 System单耐药检测结果

    Table  1.   PCR Reverse Hybridization and BACTEC MGIT 960 System Single Drug Resistance Detection Results

    PCR反向杂交法 BACTEC MGIT 960 合计（%）
    检出单耐药（n） 未检出单耐药（n）
    检出单耐药（n） 32 2 94.12
    未检出单耐药（n） 4 324 1.22
    合计（%） 88.89 0.61
    下载: 导出CSV

    表  2  PCR反向杂交法检和BACTEC MGIT 960 System多耐药检测结果

    Table  2.   PCR Reverse Hybridization and BACTEC MGIT 960 System Multidrug Resistance Detection Results

    PCR反向杂交法 BACTEC MGIT 960 合计（%）
    检出多耐药（n） 未检出多耐药（n）
    检出多耐药（n） 14 2 87.50
    未检出多耐药（n） 3 342 0.86
    合计（%） 82.35 0.58
    下载: 导出CSV

    表  3  PCR反向杂交法和BACTEC MGIT 960 System耐多药检测结果

    Table  3.   PCR Reverse Hybridization and BACTEC MGIT 960 System MDR Test Results

    PCR反向杂交法 BACTEC MGIT 960 合计（%）
    检出耐多药（n） 未检出耐多药（n）
    检出耐多药（n） 45 3 93.75
    未检出耐多药（n） 1 311 0.32
    合计（%） 97.87 0.96
    下载: 导出CSV
    • 参考文献(14)
  • [1] 李晓晓, 梁亚萍, 赵涛, 等. 结核病患者422例耐药情况调查研究[J].陕西医学杂志,2020,49(2):250-253. doi: 10.3969/j.issn.1000-7377.2020.02.033
    [2] Massi M N, Biatko K T, Handayani I, et al. Evaluation of rapid genexpert MTB/RIF method using DNA tissue specimens of vertebral bones in patients with suspected spondylitis TB[J]. Journal of Orthopaedics,2017,14(1):189. doi: 10.1016/j.jor.2016.12.003
    [3] World Health Organization. Global tuberculosis report 2016[M]. Gnenva: WHO Press, 2016: 1-5.
    [4] Hsiao C H, Lin Y T, Lai C C, et al. Identification of nonyuberculous mycobacterial infection by IS6110 and hsp65 gene analysis on lung tissues[J]. Diagn Microbiol Infect Dis,2010,68(3):241-246. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2010.05.017
    [5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 肺结核诊断标准(WS 288-2017)[J].新发传染病杂志,2018,3(1):59-61.
    [6] Ahmad S, Mokaddas E. Recent advances in the diagnoisis and treatment of multidrug-resistant tuberculosis[J]. Respir Med,2009,103(12):1777-1790. doi: 10.1016/j.rmed.2009.07.010
    [7] Munkhdelger J, Wang H Y, Choi Y, et al. Idengtifacation of mycobacterium species in FFPE granulomatous lymphadenitis tissue using REBA Myco-ID[J]. Int J Tuberc Lung Dis,2013,17(7):898-902. doi: 10.5588/ijtld.12.0818
    [8] 孙桂英, 赵刚, 沈燕, 等. 基因芯片技术对结核分枝杆菌利福平及异烟肼的耐药性检测研究[J].国际检验医学杂志,2019,40(23):2924-2927. doi: 10.3969/j.issn.1673-4130.2019.23.026
    [9] 赵立平, 于霞, 姜广路, 等. 对BACTECTM MGIT 960培养报 告结果为阴性的培养管中颗粒性物质的研究[J].中国防痨杂志,2013,35(1):27-31.
    [10] 车南颖, 张海青, 中华医学会结核病学分会结核病病理学专家共识编写组. 中国结核病病理学诊断专家共识2017年学术汇编[C]. 厦门: 中华医学会结核病学分会, 2017: 10.
    [11] 张卓然, 夏梦岩, 倪语星. 微生物耐药的基础与临床[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2007: 194.
    [12] 谭景尹, 韦世录, 李翠萍, 等. PCR-膜芯片检测石蜡包埋组织中结核杆菌耐药基因突变[J].临床与实验病理学杂志,2012,28(8):895-899. doi: 10.3969/j.issn.1001-7399.2012.08.015
    [13] 甘辛, 陈玲, 王建华, 等. 结核分枝杆菌耐利福平 rpoB 基因突变的序列分析[J].基础医学与临床,2010,30(3):268-271.
    [14] 许榕青, 李丹, 林银霞, 等. 基因芯片技术检测结核分枝杆菌利福平和异烟肼耐药性临床应用评价[J].中国人兽共患病学报,2017,33(1):43-48. doi: 10.3969/j.issn.1002-2694.2017.01.008
    • 相关文章(20)
  • [1] 陈诗, 付什, 谭智勇, 王剑松, 王海峰.  自噬在膀胱癌发展和治疗中的研究进展, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230503
    [2] 王双双, 李亚玲, 陈丽琴, 韩永慧, 麻明彪, 李小娟.  儿童重症监护病区CRE感染的危险因素及耐药情况分析, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230918
    [3] 陈连勇, 杨星, 茹浩浩, 陈涛, 闫双群, 许琳.  云南省结核分枝杆菌分子特征和传播相关因素分析, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20230821
    [4] 金晓媚, 何杰艳, 施吉昌, 邢辉, 王洪, 张桔, 董莉娟, 黄丽花, 陈敏, 陈志娟, 陈会超.  大理白族自治州2018年HIV/AIDS病毒基因型和抗病毒治疗前耐药研究, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20231123
    [5] 万鑫蕊, 王晓燕, 王霖, 马志强, 李才信, 许世涛, 唐兴蕊, 毛红艳.  非结核分枝杆菌感染者肝肾功能、免疫功能和耐药性分析, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20231117
    [6] 余婷婷, 王红英, 张润武, 白经, 普冬, 李冬玲.  昆明地区1 452例低病毒载量慢乙肝患者耐药突变相关位点的分析, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220927
    [7] 余婷婷, 李冬玲, 王红英, 李丽华, 普冬, 武昆利.  昆明地区艾滋初治病例感染、免疫及耐药情况调查, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220133
    [8] 李柳, 王亚茹, 张娣, 陈勤聪, 王明, 王硕.  高血压个体化用药基因检测在Ⅲ级高血压患者中的应用, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220430
    [9] 顾津伊, 邓德耀, 袁文丽, 杨秋萍, 宋健梅, 沈彦均, 郭媛媛, 徐红云.  2014年～2020年鲍曼不动杆菌的临床分布及耐药性分析, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220504
    [10] 陈连勇, 茹浩浩, 杨星, 闫双群, 陈涛, 倪沁璇, 许琳.  云南省异烟肼耐药结核分枝杆菌katG和inhA基因突变特征, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20220803
    [11] 周灵, 胡凤娣, 李蓉, 廖冶丹, 耿证琴, 唐嘉黛, 张雪琪, 谢琳, 杨祚璋.  预测骨肉瘤化疗耐药的临床评分系统, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210144
    [12] 孙文婧, 胡曼婷, 李娜, 葛菲, 陈文林, 刘洋.  乳腺癌内分泌治疗耐药及其逆转的研究进展, 昆明医科大学学报. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210724
    [13] 陈连勇, 茹浩浩, 杨星, 闫双群, 陈金瓯, 杨蕊, 陈涛, 许琳.  云南省846株结核分枝杆菌药敏试验结果, 昆明医科大学学报.
    [14] 李晓琴, 周敏, 王霖, 曾海燕, 骆鹏举, 李颖, 冉丽权.  结核分枝杆菌利福平耐药突变基因检测与BD960药敏的对比, 昆明医科大学学报.
    [15] 程思根, 罗志刚, 刘德华, 杨姝.  幽门螺杆菌清除治疗中甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林的耐药性, 昆明医科大学学报.
    [16] 廉阳秧.  中晚期宫颈癌组织HIF-1α、Twist、MDR1的表达及意义, 昆明医科大学学报.
    [17] 代薇.  昆明地区幽门螺杆菌耐药情况分析, 昆明医科大学学报.
    [18] 陈连勇.  279株结核分枝杆菌耐药情况分析, 昆明医科大学学报.
    [19] 李晓非.  噬菌体生物扩增技术在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用, 昆明医科大学学报.
    [20] .  878株鲍曼不动杆菌的耐药分析及流行调查, 昆明医科大学学报.
    • 施引文献

  • 期刊类型引用(0)

    其他类型引用(1)

    • 资源附件(0)
  • 加载中
WeChat 点击查看大图
表(3)
计量
  • 文章访问数:  3508
  • HTML全文浏览量:  2886
  • PDF下载量:  17
  • 被引次数: 1
出版历程
  • 收稿日期:  2020-04-14
  • 刊出日期:  2019-12-26

目录

摘要
HTML全文

  • 1.   资料与方法

  • 1.1   病例资料

  • 1.2   实验方法及检验步骤

  • 1.3   统计学处理

  • 2.   结果

  • 2.1   2种方法单耐药检测的比较

  • 2.2   2种方法多耐药检测的比较

  • 2.3   2种方法耐多药检测的比较

  • 3.   讨论

参考文献(14)
相关文章(20)
施引文献
资源附件(0)

/

返回文章
返回

版权所有 © 《昆明医科大学学报》编辑部  滇ICP备00000000号-0

编辑出版：昆明医科大学学报编辑部

本系统由 北京仁和汇智信息技术有限公司 开发    百度统计