OCT Evaluation on the Establishment of A Mouse Model of Chronic Ocular Hypertension Induced by Magnetic Beads Injection
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摘要:
目的 探索磁性微珠前房注射诱导高眼压模型的可行性及特点，OCT在模型评估中的作用。 方法 将C57BL/6小鼠分为正常组、对照组与实验组。实验组前房内注射磁性微珠诱导高眼压，对照组前房内注射等量生理盐水，正常组不做任何处理。术前及术后第1天开始隔天检测眼压波动；建模3周后行荧光金逆行标记，建模4周后使用OCT检测两组小鼠视盘旁神经纤维厚度，并行视网膜行铺片计数各组RGCs数量。 结果 小鼠前房内注射磁性荧光微珠后，微珠可均匀分布于房角处堵塞房角。实验组小鼠眼压自注射术后1 d开始升高，平均眼压为（19.37±4.38）mmHg，3周开始眼压下降；荧光金逆行标记RGCs，建立微珠诱导小鼠高眼压模型后4周，行OCT检测RNFL厚度。实验组RNFL厚度为（27.67±6.15）μm，较对照组明显变薄，两组比较差异有统计学意义（P = 0.0082）。检测OCT后收集眼球计数RGCs，实验组RGCs为（203.83±26.35）个，与对照组比较明显减少，差异有统计学意义（P = 0.009 4）。 结论 小鼠前房注射磁性微珠可以诱导持续稳定的眼压升高并引起明显RGC数量减少，可通过OCT无创、快速、重复的检测神经纤维层厚度发现RGC损伤。 Abstract:Objective To explore the feasibility and characteristics of magnetic microbead anterior chamber injection inducing ocular hypertension model, and to study the role of OCT in model evaluation. Methods C57BL/6 mice were divided into the normal group, control group and experimental group. The normal group was not treated. The intraocular pressure fluctuations were detected before the surgery and on the first day after the surgery; After 3 weeks of modeling, fluorescent gold retrograde labeling was performed, and after 4 weeks of modeling, OCT was used to detect the thickness of para-optical nerve fibers in two groups of mice, and the number of RGCs in each group was counted by parallel retinal plating. Results After the injection of magnetic fluorescent microbeads into the anterior chamber of the mice, the microbeads were able to be evenly distributed at the angle of the anterior chamber to block the angle. In the experimental group, the intraocular pressure of the mice began to increase 1 day after the injection, and the average intraocular pressure was 19.37 ± 4.38 mmHg. The intraocular pressure decreased slightly after three weeks. In the 4th week, OCT was used to detect the thickness of RNFL. The thickness of RNFL in the experimental group was 27.67 ± 6.15 μm, which was significantly thinner than that in the control group. The difference between the two groups was statistically significant（p = 0.0082）. After detecting OCT, RGCs were counted in wholemount retina and the RGCs in the experimental group were 203.83 ± 26.35, which was significantly reduced compared with the control group, and the difference was statistically significant（p = 0.0094）. Conclusion The injection of magnetic microbeads in the anterior chamber of mice can induce a sustained and stable increase in intraocular pressure and cause a significant decrease in the number of RGCs. RGC damage can be found by non-invasive, rapid, and repeated detection of the thickness of the nerve fiber layer by OCT. -
Key words:
- Magnetic microbeads /
- High intraocular pressure /
- OCT /
- Glaucoma /
- Animal model
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青光眼是全球第二位致盲性眼病，它是由病理性高眼压引起，以视网膜神经节细胞（RGCs）调亡、视功能逐渐丧失为主要特征的一种进行性视神经病变[1]。青光眼的发病机制目前尚不明确，为了研究青光眼的发病机制，需要合适的动物模型[2]。前房内注射物质堵塞房角是诱导青光眼高眼压模型的一种方法，它模拟了房水流出障碍的过程，较为贴近青光眼的病理生理过程[3]。有研究者使用微珠前房注射诱导大鼠高眼压[4-5]，但前房注射磁性微珠诱导小鼠高压压模型的研究还较少。且目前报道的文献中，注射微珠后眼压升高及维持时间相差较大[6-7]。注射后对模型的评估缺乏有效、简便的方法[8]。本研究观察了磁性微珠注射诱导小鼠高眼压的特点，使用OCT作为评估模型的方法，并与传统的神经标记计数RGC的方法比较，现将结果报道如下。
1. 材料与方法
1.1 实验动物与分组
SPF级C57BL/6小鼠18只，20～25 g，6～8周，购自南方医科大学医学实验动物中心。小鼠随机分为正常对照组、对照组和实验组各6只。实验组前房内注射磁性微珠建立高眼压模型，对照组前房内注射相同量生理盐水，正常组不做任何处理。
1.2 主要试剂及仪器
磁性微珠Compel UMC3F（美国Bangs labs公司）；多聚甲醛（美国Sigma公司）；荧光金颗粒（美国Invitrogen公司）；显微手术器械（美国WPI公司）；Icare Tonolab眼压计（芬兰Icare公司）；激光共焦显微镜LSM710（德国Zeiss公司）；海德堡Spectralis HRA OCT（德国海德堡公司）。
1.3 磁性微珠前房注射诱导小鼠高眼压模型建立
实验组小鼠常规全身麻醉，33G Hamilton微量注射器抽取磁性微珠5 μL，行前房内注射。磁性微珠自带荧光，直径为3～6 μm，注射后使用环形磁铁诱导微珠均匀分布于前房角[8]。对照组小鼠相同方法前房内注射5 μL生理盐水。术后每天使用左眼氟沙星眼液点眼，每天4次，持续2周。
1.4 Tonolab检测小鼠眼压
所有小鼠均使用Icare Tonolab眼压计测量术前基线眼压，并于微珠注射后1 d起隔天测量眼压波动情况至术后4周。
1.5 荧光金逆行标记RGCs
微珠注射高眼压模型建立3周后，实验组及对照组小鼠常规腹腔注射43 g/L水合氯醛（0.1 mL/10 g）全身麻醉，备皮后固定于脑立体定位仪。沿头皮中线切开皮肤长6 mm。定位注射部位（前囟后2.8 mm，旁开0.6 mm，），磨钻钻开颅骨深度为1.6 mm，注入荧光金颗粒总量1 μL。注射完毕，缝合小鼠头皮。术毕苏醒后7 d后取材计数RGCs数量。
1.6 OCT检测视盘周围视网膜神经纤维层厚度
模型建立后4周各组小鼠全麻散瞳后行OCT检查。选择视盘旁环形连续扫描式，选取图像质量大于25图片，量取视盘旁视网膜神经纤维层厚度（retina never fiber layer，RNFL）。
1.7 视网膜铺片计数RGCs
模型建立后4周过量麻醉处死各组小鼠收取眼球。4% PFA固定眼球30 min后剥取视网膜。将呈杯状视网膜转移至载玻片，呈花瓣状剪为4瓣，盖玻片封片观察及拍照。拍照时每瓣视网膜拍摄2张周边部视网膜，1张中央部视网膜。选取相同位置，每个视网膜拍摄共12张。照片使用ImageJ计数荧光金（fluorescent gold，FG）阳性细胞数量。
1.8 统计学处理
各实验数据均以均数±标准差（
$\bar x \pm s $ ）表示。结果使用Graph Pad软件分析，采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 小鼠高眼压模型建立
小鼠前房注射微珠后，通过环形磁铁诱导微珠分布于房角。可见房角处微珠分布均匀，随时间变化脱落不明显（图1A）。取小鼠眼球行冰冻切片观察，可见自带荧光微珠堵塞房角较严实。所选微珠直径为3～6 μm，直径越小堵塞房角效果越好（图1B）。
图 1 小鼠前房微珠注射后堵塞房角A小鼠前房注射微珠后通过磁环诱导微珠（红色箭头）均匀分布于房角；B示10倍放大，磁性微珠（黄色箭头）自带荧光，455通道拍摄显示蓝色微珠在房角及小梁网堵塞较严实。Figure 1. Blocking the angle after injection of microbeads anterior chamber in mice.2.2 微珠前房注射诱导小鼠眼压升高变化
术前对照组小鼠平均眼压9.67 mmHg，实验组小鼠平均眼压10 mmHg，两组无统计学差异（P = 0.3621）。实验组小鼠在术后第1天开始眼压升高，第3周开始眼压略微下降。对在4周观察周期内，对照组小鼠眼压轻度波动，与术前比较差异无统计学意义（P = 0.1628）；实验组小鼠眼压平均为（19.37±4.38） mmHg，与对照组比较眼压升高明显，差异有统计学意义（P < 0.0001）。结果表明，小鼠前房内注射微珠可以诱导较快且较稳定的眼压升高，眼压升高至第3周开始略微下降（图2）。
图 2 微珠注射诱导小鼠眼压升高与对照组比较，***P < 0.0001。Figure 2. Microbead injection induces increased intraocular pressure in mice.2.3 微珠诱导高眼压后小鼠RNFL变薄
前房内注射微珠诱导高眼压成功后4周，小鼠行OCT检查RNFL厚度。研究发现，正常组RNFL厚度为（44.83±7）μm，对照组RNFL厚度为（43±9.63）μm，实验组（27.67±6.15）μm。正常组与对照组比较差异无统计学意义（P = 0.1628），对照组与实验组比较差异有统计学意义（P = 0.0082）（图3）。研究结果表明，微珠注射诱导小鼠高眼压模型会引起RGC减少，可表现为RNFL变薄，这一变化可通过OCT检测。
图 3 微珠注射高眼压诱导RNFL厚度减少A： 各组使用OCT测量视盘周围神经纤维层厚度；B：实验组与对照组比较，实验组神经纤维层厚度明显变薄，差异有统计学意义。与对照组比较，** P < 0.01。Figure 3. Intraocular pressure injection of microbeads induces RNFL thickness reduction.2.4 微珠诱导高眼压后小鼠RGCs减少
术前荧光金颗粒逆行标记RGC后，前房内注射微珠诱导高眼压成功后4周收取各组小鼠眼球，行视网膜铺片计数每个视野内RGCs。研究发现，正常组RGC数量为（266.33±36.37）个，对照组为（254±27.89）个，实验组为（203.83±26.35）个。正常组与对照组比较差异无统计学意义，对照组与实验组比较差异有统计学意义（P = 0.0094）见图4。微珠注射诱导小鼠高眼压模型会引起RGC减少。
图 4 微珠注射高眼压诱导RGCs数量减少。术后3周行各组小鼠荧光金逆行标记RGC，1周后取视网膜行铺片检查计数RGC数量。结果显示，对照组为254±27.89个，实验组为203.83±26.35个。正常组与对照组比较差异无统计学意义，对照组与实验组比较差异有统计学意义（p = 0.0094）。（比例尺50 μm，×20）A：术后3周行各组小鼠荧光金逆行标记RGC；B：1周后取视网膜行铺片检查计数RGC数量。与对照组比较，**P < 0.01。Figure 4. Microbead injection of high intraocular pressure induces a decrease in the number of RGCs3. 讨论
目前青光眼研究中常用的模型动物包括猴、兔、鼠。猴眼较接近人眼，但价格昂贵，操作困难，不易于批量的实验开展。兔眼较大，术后炎症反应重也限制了它在临床中的运用。相比较而言，小鼠及大鼠眼球在小梁网、房水流出通道及视神经方面和人眼较像，且易于开展基因操作，因此在研究中运用较为广泛[9]。而从青光眼动物模型构建的机制上分类，可以分为高眼压性、非高眼压性及转基因动物模型。以上几类模型各有其优缺点，共同的问题是模型只可以模拟不同类型青光眼的部分病理过程，不能完全代表青光眼的发病过程。因此，在模型选择上，围绕眼压升高、进行性的视神经损伤的模型较为贴近青光眼的病理。高眼压性动物模型常用的方法包括：巩膜表面静脉注射高渗盐水、激光光凝小梁网、眼外静脉烧灼、眼外静脉结扎以及前房注射玻璃酸钠等。除激光光凝小梁网和前房内注射玻璃酸钠外，其它方法不适宜在小鼠上建立模型，而激光光凝小梁网和前房内注射玻璃酸钠后眼压不稳定，维持时间短是研究中存在的共同问题[10]。寻找稳定的、能代表最多青光眼病理过程的动物模型一直是青光眼基础研究中的重要课题[11]。
前房内注射微珠，通过微珠堵塞前房角及小梁网，可以引起房水流出障碍，其引起的眼压升高造成视神经损伤。该模型可以较好模拟青光眼的病理过程[6]。文献中所使用的微珠各有不同，有使用聚乙烯塑料微珠的，也有使用磁性微珠通过磁铁诱导堵塞房角的。比较而言，磁性微珠通过磁铁诱导可以较好的分布在房角，引起的眼压升高应该更持久、更高[12-13]。大鼠磁性微珠堵塞房角的研究报道较多[14]，但使用大鼠需要的磁性微珠较多，且很多转基因研究在小鼠开展，小鼠磁性微珠诱导高眼压有较大的运用价值，目前研究不多，各家报道数据不一致[15-16]。以往研究中微珠诱导小鼠高眼压使用的微珠直径从15～5 μm都有报道[17]，本研究中，使用的微珠平均直径2.9 μm，笔者推测微珠直径越小越易对小鼠房角及小梁网形成有效堵塞。本研究发现，磁性微珠诱导升高的平均眼压为（19.37±4.38）mmHg，与文献报道3周时平均眼压（20±0.7）mmHg相比略低[15]。对照组小鼠平均眼压为10 mmHg，实验组小鼠比对照组眼压升高了1倍。本研究中观察了1个月，微珠注射眼压升高能维持在平均水平。通过荧光金逆行标记染色RGC，本研究发现与对照组比较，实验组RGC数量明显较少，差异有统计学意义。研究表明，前房内注射微珠可以诱导持续的高眼压，通过1个月的眼压升高可以产生明显的视神经损伤。
通过荧光金逆行标记检测RGC数量是观察RGC损伤的金标准[14]，但该方法的问题是必须处死小鼠才能检测，不具备重复性，不利于其它实验的开展。OCT通过扫描视盘周围神经纤维层厚度，是临床上检查青光眼的常用方法[18]。该方法检测的优势是可以无创、重复检查。有研究使用OCT评估了视神经钳夹及NMDA诱导的视神经损伤，证明了其在实验动物视神经损伤评估中的作用[19-20]。本研究通过OCT检测小鼠视盘盘沿神经纤维层厚度，发现与对照组比较，实验组平均神经纤维厚度明显减少，差异有统计学意义。该研究结果与通过荧光金逆行标记RGC对模型的检测结果一致，表明通过OCT检测可以判断RGC损伤。该方法无创、可重复，可作为小鼠青光眼模型中判断RGC损伤的好方法，不仅可以在青光眼模型建立检测中发挥作用，也可在青光眼治疗及神经保护研究中发挥作用。本检测方法中存在的问题是，对角膜透明性及晶体透明性有较高要求，需要在构建模型时不影响角膜及晶体。
综上所述，通过小鼠前房注射磁性微珠可以诱导持续稳定的眼压升高，并诱导明显RGC数量减少，并且可以通过OCT无创、快速、重复的检测神经纤维层厚度发现RGC损伤。但该模型也存在一些问题：如眼压升高幅度不大，注射过程中会引起前房出血，注射后晶体混浊影响OCT检测。结合研究目的，通过熟练的操作可以减少并发症的发生，该模型及检测方法可在青光眼研究中发挥重要作用。
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图 1 小鼠前房微珠注射后堵塞房角
A小鼠前房注射微珠后通过磁环诱导微珠（红色箭头）均匀分布于房角；B示10倍放大，磁性微珠（黄色箭头）自带荧光，455通道拍摄显示蓝色微珠在房角及小梁网堵塞较严实。
Figure 1. Blocking the angle after injection of microbeads anterior chamber in mice.
图 2 微珠注射诱导小鼠眼压升高
与对照组比较，***P < 0.0001。
Figure 2. Microbead injection induces increased intraocular pressure in mice.
图 3 微珠注射高眼压诱导RNFL厚度减少
A： 各组使用OCT测量视盘周围神经纤维层厚度；B：实验组与对照组比较，实验组神经纤维层厚度明显变薄，差异有统计学意义。与对照组比较，** P < 0.01。
Figure 3. Intraocular pressure injection of microbeads induces RNFL thickness reduction.
图 4 微珠注射高眼压诱导RGCs数量减少。术后3周行各组小鼠荧光金逆行标记RGC，1周后取视网膜行铺片检查计数RGC数量。结果显示，对照组为254±27.89个，实验组为203.83±26.35个。正常组与对照组比较差异无统计学意义，对照组与实验组比较差异有统计学意义（p = 0.0094）。（比例尺50 μm，×20）
A：术后3周行各组小鼠荧光金逆行标记RGC；B：1周后取视网膜行铺片检查计数RGC数量。与对照组比较，**P < 0.01。
Figure 4. Microbead injection of high intraocular pressure induces a decrease in the number of RGCs
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