The Regulation of Exosome Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells on the Polarization of Glioma-associated Macrophages
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摘要:
目的 探究人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响，并初步探讨其对胶质瘤发生发展的影响。 方法 利用试剂盒提取人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体，通过扫描电镜及Western blot 鉴定外泌体。将胶质瘤细胞分为SHG449：SHG449细胞不做特殊处理；SHG449+M0组：SHG449细胞与M0型巨噬细胞共培养；SHG449+M0+exosome组：SHG449细胞与M0型巨噬细胞共培养后，加入标记有PKH-67的外泌体使其进入M0型巨噬细胞。 结果 （1）人骨髓间充质干细胞分泌的外泌体成功提取，且进入M0型巨噬细胞；（2）外泌体进入胶质瘤细胞SHG449诱导极化的巨噬细胞后细胞形态转化，且M2型巨噬细胞活化标志物Arginase、CD206以及CCL22，TGF-β表达下降（Arginase：P < 0.01，CD206： P < 0.05， CCL22： P < 0.05，TGF-β： P < 0.01），M1型活化标志物iNOS，CD68以及IL-1β，TNF-α表达上升（iNOS： P < 0.01，CD68： P < 0.01，L-1β： P < 0.000 1，TNF-α： P < 0.001）；（3）被外泌体诱导极化的巨噬细胞导致胶质瘤细胞增殖能力下降（ P < 0.05），凋亡能力上升（ P < 0.000 1）。 结论 人骨髓间质细胞分泌的外泌体可抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2表型转化，并诱导其向M1表型转化，调节肿瘤免疫微环境，从而达到抑癌的作用。 Abstract:Objective To investigate the effect of exosomes divided from human bone marrow mesenchymal stem cells on the polarization of tumor-associated macrophages, and to preliminarily discuss their influence on glioma cell lines. Methods Exosomes divided from human bone marrow mesenchymal stem cells were extracted and identified by scanning electron microscopy and western blot. The glioma cell line SHG449 was divided into three groups: SHG449 group: SHG449 cells without special treatment; SHG449+M0 group: SHG449 cells co-cultured with M0 macrophages; SHG449+M0+exosome group: SHG449 cells co-cultured with M0 macrophages, and then exosomes labeled with PKH-67 were added to the M0 cells. The mRNA expression of M1 biomarkers（iNOS and CD68）and M2 markers（Arginase and CD206）were detected by qPCR, and the content of IL-1β, TNF-α, CCL22 and TGF-β in the supernatant of SHG449 cells were detected by ELISA. The proliferation and apoptosis of SHG449 cell line were detected by CCk8 and flow cytometry. Results （1）Exosomes secreted by human bone marrow mesenchymal stem cells were successfully extracted and entered into M0-type macrophages.（2）Macrophage morphology was transformed after exosome was intaken by SHG449-induced polarized macrophages, and the expression of M2 macrophages markers Arginase, CD206, CCL22 and TGF-β were decreased（Arginase: P < 0.01, CD206: P < 0.05, CCL22: P < 0.05, TGF-β: P < 0.01）, while the expression of M1 macrophages markers iNOS, CD68, IL-1β and TNF-α increased（iNOS: P < 0.01, CD68: P < 0.01, L-1β: P < 0.000 1, TNF-α: P < 0.001）.（3）Macrophage polarization induced by exosomes resulted in decreased proliferation（ P < 0.05） and increased apoptotic（ P < 0.000 1） of glioma cells. Conclusion Exosomes derived from human bone marrow stromal cells can inhibit the polarization of tumor-associated macrophages to the M2 phenotype and induce their polarization to the M1 phenotype, and regulate the tumor immune microenvironment, thereby suppressing the development of glioma. -
恶性脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，发病率占恶性脑肿瘤中的30%～50%，具有高复发率，预后差，侵袭性极强的特点[1-4]。肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）是肿瘤微环境中重要的免疫细胞，可通过与肿瘤细胞的相互作用，影响肿瘤细胞的增殖，侵袭，转移[5-6]。肿瘤相关巨噬细胞主要具有两种极化类型：抗肿瘤效应和促炎效应的M1型巨噬细胞和具有免疫抑制和促肿瘤效应和抗炎效应的M2型巨噬细胞[7-8]。外泌体选择性的包裹脂质，蛋白质及RNA等生物活性物质，参与细胞间的通讯[9-10]。有研究表明，间充质干细胞来源的外泌体对巨噬细胞的极化具有调控作用[11]，但外泌体对胶质瘤微环境中的巨噬细胞的极化的影响尚不明确。笔者旨在研究人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSC）分泌的外泌体对肿瘤相关巨噬细胞极化的影响，并初步探讨其对胶质瘤发生发展的影响。
1. 材料与方法
1.1 人骨髓间充质干细胞的培养及鉴定
hBMSC购于中国医学院科学院，该细胞株已获STR验证。hBMSCs 复苏后接种入含有10% FBS（购于美国Gibco）、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL（购于美国Sigma-Aldrich）的DMEM/F12的培养基（购于美国Gibco）后，将培养皿置于5% CO2，37 ℃恒温细胞培养箱中培养。每24 h换液，当细胞融合度达到80%时，用胰蛋白酶消化BMSCs进行传代培养。使用流式细胞仪检测p3-p5细胞表面标志物，光学显微镜下观察p5细胞形态。
1.2 外泌体的提取及鉴定
p3-p5人骨髓间充质干细胞培养至80%融合度后，饥饿处理收集细胞上清，按照Total Exosome RNA & Protein Isolation 试剂盒（购于美国赛默飞）操作说明提取外泌体。扫描电子显微镜下观察外泌体形态及大小，并用BCA蛋白检测试剂盒（购于美国赛默飞）对外泌体蛋白定量，Western blot 鉴定外泌体标志蛋白后，−80 ℃冻存备用。
1.3 巨噬细胞极化诱导
人THP-1细胞购于中科院上海细胞库，细胞复苏后，接种入含有10% FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的RPMI1640培养基中（购于美国Gibco），5% CO2，37 ℃恒温细胞培养箱中培养。取1×106 个细胞接种于6孔板中，加入320nM佛波酯（PMA）作用6h诱导转化为初级巨噬细胞（M0型巨噬细胞）[12]。
1.4 巨噬细胞与胶质瘤细胞共培养以及外泌体摄入
胶质瘤细胞株SHG449购于上海细胞生物研究所，细胞复苏后培养于含有10% FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的DMEM培养基中，置于5% CO2，37 ℃恒温细胞培养箱中培养。SHG449组：培养48 h后加入与外泌体等体积PBS并收集细胞悬液。SHG449+M0组： 将Transwell组织培养小室（孔径为24 mm）置于6孔板，上室接种THP-1诱导后转化的M0型巨噬细胞（1×106 个/孔），贴壁12 h后，下室接种SHG449细胞（1×106 个/孔）。上室和下室均为含有10% FBS、青霉素100 U/mL、链霉素100 U/mL的RPMI1640培养基，共培养48 h，融合度达到80%时后加入与外泌体等体积PBS并收集细胞悬液。SHG449+M0+exosome组： SHG449细胞与M0型巨噬细胞共培养48 h后，将标记有PKH-67的外泌体（终质量为10 mg/L）加入上室M0型巨噬细胞，12 h后使用荧光显微镜观察外泌体摄入情况。24 h后光学显微镜下观察各组细胞形态，qPCR检测M1型巨噬细胞活化标志物iNOS，CD68 以及M2型巨噬细胞活化标志物Arginase、CD206。取上清液根据ELISA试剂盒（均购于美国R&D）操作说明检测胶质瘤细胞SHG449上清液中IL-1β，TNF-α，CCL22，TGF-β 的含量。
1.5 肿瘤细胞增殖及凋亡检测
SHG449细胞接种与96孔板，每组设4个复孔，置于培养箱中培养，分别于贴壁后继续培养48 h。每孔加入10 μL的CCK8溶液。继续培养2.5 h后，在酶联免疫检测分析仪上测定A450值。药物对细胞存活率的影响按以下公式计算，实验以3次平行实验数据为最终结果。
细胞存活率 = （A处理 − A空白）/（A对照 − A空白）×100%。
凋亡检测试剂盒购于东仁化学，根据试剂盒说明书操作后使用流式细胞分选仪下检测细胞凋亡情况。
1.6 统计学处理
通过GraphPad Prism 5.0 软件（GraphPad Software，San Diego，CA）进行统计分析，正态分布的连续性变量均以平均数±标准差（mean ± SD）表示。组间比较采用t检测，多组间比较采用单因素方差分析。在图中以连线表示比较的组别，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 人骨髓间充质干细胞鉴定
传代后过夜，通过显微镜下可见人骨髓间充质干细胞贴壁良好，呈长梭形（图1A）；传代4天后，细胞密度较大时（融合度达100%），可见细胞呈漩涡状排列（图1B）。使用流式细胞仪检测细胞表面标志物，结果显示标志物CD29，CD90阳性表达，标志物CD34，CD45阴性表达（图1C），符合间充质干细胞标准。
图 1 人骨髓间充质干细胞鉴定A-B：光学显微镜下观察第5代人骨髓间充质干细胞形态（×100）；C：流式细胞仪检测第5代人源骨髓间充质干细胞阳性表达CD29，CD90，阴性表达CD34，CD45。Figure 1. Identification of human bone marrow mesenchymal stem cells2.2 外泌体鉴定
通过试剂盒从人骨髓间充质干细胞上清中提取外泌体，扫描电镜下观察到囊泡样形态（图2A）。采用Western blot 检测外泌体常见标志物Alix，CD63，CD81以及TSG101的蛋白表达，结果表明Alix，CD63，CD81以及TSG101均在人骨髓间充质干细胞中弱表达，而在外泌体中高表达（图2B），证明外泌体的提取成功。
图 2 外泌体鉴定A：扫描电镜观察外泌体呈囊泡样形态（×60 000）；B：Western blot 检测外泌体常见标志物Alix，CD63，CD81以及TSG101的蛋白表达。Figure 2. Identification of exosomes2.3 巨噬细胞对外泌体的摄入并促进巨噬细胞向M1型极化
通过荧光标志物PKH-67对外泌体进行标志后将外泌体与胶质瘤细胞株SHG449和M0型巨噬细胞共培养，12 h后通过荧光电镜观察到外泌体进入巨噬细胞（图3A）。摄入外泌体24 h后观察细胞形态，THP-1细胞为悬浮细胞，呈形态规则的小圆形，经PMA诱导后的THP-1细胞转化为初级巨噬细胞（M0型巨噬细胞），呈不规则多边形，且贴壁生长，M0细胞与胶质瘤细胞株SHG449共培养后，细胞形态呈多角的长梭形，且可见少量枝杈状突起，摄入外泌体24 h后，可见细胞呈多角的长梭形（图3B）。通过qPCR进一步检测M1型巨噬细胞活化标志物iNOS，CD68以及M2型巨噬细胞活化标志物Arginase、CD206，结果显示，与胶质瘤细胞株SHG449共培养后，巨噬细胞M1型活化标志物iNOS，CD68略有升高（iNOS：P < 0.01，CD68： P < 0.01），而加入外泌体后可见显著升高（iNOS： P < 0.01，CD68： P < 0.01）；同时，与胶质瘤细胞株SHG449共培养后，巨噬细胞M2型活化标志物Arginase、CD206显著升高（Arginase： P < 0.001，CD206： P < 0.01），而加入外泌体后可见显著降低（Arginase： P < 0.01，CD206： P < 0.05）（ 图3C-F）。
图 3 巨噬细胞对外泌体的摄入并促进巨噬细胞向M1型极化A：大量PKH-67标记的外泌体被巨噬细胞摄取（40×，PKH-67为绿色，DAPI为蓝色）；B：光学显微镜下观察各组细胞形态（×100）；C-F：qPCR检测M1型巨噬细胞活化标志物iNOS，CD68 以及M2型巨噬细胞活化标志物Arginase、CD206。两两组间比较，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。Figure 3. Exosomes were intaken by macrophage and macrophage was polarized to M1 type2.4 被外泌体诱导极化的巨噬细胞对胶质瘤细胞炎性因子的影响
通过ELISA检测胶质瘤细胞SHG449上清液中IL-1β，TNF-α，CCL22，TGF-β 的含量，结果显示，胶质瘤细胞株SHG449与共培养后，IL-1β，TNF-α浓度略有升高（Arginase：P < 0.01，CD206： P < 0.05），而加入外泌体后可见显著升高（IL-1β： P < 0.000 1，TNF-α： P < 0.001）；同时，与胶质瘤细胞株SHG449共培养后，CCL22，TGF-β显著升高（IL-1β： P < 0.000 1，TNF-α： P < 0.001），而加入外泌体后可见显著降低（CCL22： P < 0.05，TGF-β： P < 0.01）（ 图4A-D）。
图 4 ELISA检测胶质瘤细胞SHG449上清液中IL-1β，TNF-α，CCL22，TGF-β 的含量A：IL-1β 含量；B：TNF-α含量；C：CCL22含量；D：TGF-β含量。两两组间比较，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。Figure 4. The content of IL-1β，TNF-α，CCL22，and TGF-β in the supernatant of glioma cells SHG449 by ELISA2.5 被外泌体诱导极化的巨噬细胞对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响
通过流式细胞仪检测胶质瘤细胞SHG449的凋亡，结果显示，与胶质瘤细胞株SHG449共培养后，SHG449的细胞凋亡比率显著降低（P < 0.000 1），而加入外泌体后可见显著升高（ P < 0.000 1）；同时，通过CCk8检测胶质瘤细胞SHG449的增殖情况，结果显示，胶质瘤细胞株SHG449与共培养后，SHG449的细胞增殖比率升高（ P < 0.001），而加入外泌体后可见显著降低（ P < 0.05），见 图5A-C。
图 5 被外泌体诱导极化的巨噬细胞对胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响A-B：流式细胞仪检测细胞凋亡；C：CCk-8检测细胞增殖。 两两组间比较，* P < 0.05，*** P < 0.001，**** P < 0.000 1。Figure 5. Effect of macrophages polarization induced by exosome induced polarization on glioma cell proliferation and apoptosis3. 讨论
目前，恶性胶质瘤的惯例治疗方案是手术后放疗伴随化疗，但由于恶性胶质瘤侵袭性强，难以通过神经外科手术完全切除，残存肿瘤细胞也难以通过后续的放疗和化疗彻底消除。因此，恶性胶质瘤具有高复发率，预后差的特点，患者5 a生存率不足20%[13-15]。骨髓间质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有高度的多向分化的潜能以及特殊的低免疫性，因此常被当作一种常用的治疗工具[16]。外泌体是一类脂质类双分子结构的封闭性微小囊泡，直径约为30～150 nm，由细胞生成并释放，其中包裹多种生物活性分子如脂质，蛋白质及RNA等，参与细胞间的通讯[17]。通常认为，一些蛋白与所有外泌体有关，其中包括转运必须内体分选复合物（TSG101，Alix等）以及跨膜蛋白CD9，CD63，CD81和CD82[18]。本研究中，通过扫描电镜及Western blot检测提取后外泌体，电镜下可见囊泡状结构，且外泌体相关蛋白Alix，CD63，CD81以及TSG101相较人骨髓间质干细胞在外泌体中高表达，证明了外泌体的成功提取。
恶性胶质瘤的进展不仅与肿瘤细胞自身特性有关，也与胶质瘤微环境密不可分。胶质瘤微环境是指与胶质瘤发生，发展和转移有密切关系的内外环境，主要包含各种免疫细胞和肿瘤相关基质成纤维细胞，其中免疫细胞是肿瘤微环境中的主要成分之一[19]。在癌变过程中，微环境向炎症性环境改变, 因此有助于组织重塑和肿瘤进展。肿瘤与肿瘤微环境的相互作用与血管新生的调节、生长因子和细胞因子的供应、细胞外基质（ECM）的重塑以及免疫逃逸和抗药性有关。在胶质瘤微环境中，骨髓来源的外周血单核细胞在基质细胞和肿瘤细胞分泌的趋化因子的作用下，被招募至肿瘤局部并进一步分化为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophage，TAM）[20]。目前研究证明，TAMs参与调节肿瘤的增殖，侵袭转移，血管新生，免疫抵抗以及放化疗抵抗等恶性生物学行为[21-24]，因此可能成为。根据功能及表型的不同，TAM可分为M1型，即经典活化巨噬细胞（Classic active macrophage），主要分泌炎性促进因子并刺激炎症发生[25-26]；以及M2型，即交替活化巨噬细胞（Alternatively active macrophage），主要抑制免疫应答。M1与M2型巨噬细胞具有高度可塑性，且相互调节功能。肿瘤细胞产生的多种趋化因子可促进巨噬细胞向M2型极化[26-28]。在肿瘤微环境中，TAMs一般表现为倾向于表达M2免疫抑制表型的，未完全分化的巨噬细胞，高水平表达抗炎性细胞因子、清除受体、血管生成因子和蛋白酶，重塑肿瘤免疫抑制微环境，因此通常被认为是起到促进肿瘤的作用，而M1型巨噬细胞主要发挥抗原提呈和免疫监视功能，起到抑制肿瘤的作用[22，28-30]。近期研究发现，外泌体可以参与诱导肿瘤相关巨噬细胞的极化[18，31-33]。外泌体进入胶质瘤细胞SHG449诱导极化的巨噬细胞后，倾向于表达M2表型的TMA向M1型表型转化，具体表现为细胞形态的转化，M2型巨噬细胞活化标志物Arginase、CD206以及CCL22，TGF-β表达下降，M1型活化标志物iNOS，CD68以及IL-1β，TNF-α表达上升，由此证明人骨髓间质细胞分泌的外泌体可抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2表型转化，并诱导其向M1表型转化。同时，被外泌体诱导极化的巨噬细胞导致胶质瘤细胞增殖能力下降，凋亡能力上升，证明外泌体能通过参与肿瘤相关巨噬细胞的极化，调节肿瘤免疫微环境，从而达到抑癌的作用。
综上所述，人骨髓间质细胞分泌的外泌体可抑制肿瘤相关巨噬细胞向M2表型转化，并诱导其向M1表型转化，调节肿瘤免疫微环境，从而达到抑癌的作用。外泌体作为一种天然无毒的载药介质，可减少脱靶副作用，提供免疫治疗的新靶点。
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图 1 人骨髓间充质干细胞鉴定
A-B：光学显微镜下观察第5代人骨髓间充质干细胞形态（×100）；C：流式细胞仪检测第5代人源骨髓间充质干细胞阳性表达CD29，CD90，阴性表达CD34，CD45。
Figure 1. Identification of human bone marrow mesenchymal stem cells
图 2 外泌体鉴定
A：扫描电镜观察外泌体呈囊泡样形态（×60 000）；B：Western blot 检测外泌体常见标志物Alix，CD63，CD81以及TSG101的蛋白表达。
Figure 2. Identification of exosomes
图 3 巨噬细胞对外泌体的摄入并促进巨噬细胞向M1型极化
A：大量PKH-67标记的外泌体被巨噬细胞摄取（40×，PKH-67为绿色，DAPI为蓝色）；B：光学显微镜下观察各组细胞形态（×100）；C-F：qPCR检测M1型巨噬细胞活化标志物iNOS，CD68 以及M2型巨噬细胞活化标志物Arginase、CD206。两两组间比较，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001。
Figure 3. Exosomes were intaken by macrophage and macrophage was polarized to M1 type
图 4 ELISA检测胶质瘤细胞SHG449上清液中IL-1β，TNF-α，CCL22，TGF-β 的含量
A：IL-1β 含量；B：TNF-α含量；C：CCL22含量；D：TGF-β含量。两两组间比较，* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。
Figure 4. The content of IL-1β，TNF-α，CCL22，and TGF-β in the supernatant of glioma cells SHG449 by ELISA
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