The Effect of Peptide-prolinyl Isomerase（Pin1）on Lipid Metabolism in Cervical Cancer Cells
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摘要:
目的 探讨肽基脯氨酰同分异构酶（Pin1）蛋白对宫颈癌细胞脂质代谢的作用。 方法 应用免疫组织化学方法检测Pinl和ACC1蛋白在女性慢性宫颈癌及宫颈癌组织的表达；Western blotting技术和RT-PCR技术检测Pin1基因在宫颈癌SiHa、C33a及H8细胞中的蛋白本底表达情况，采用RNA干扰技术下调子宫颈癌C33a细胞中Pin1的表达；Western blotting技术检测宫颈癌细胞中Pin1蛋白表达水平变化对ACC1蛋白表达的影响；脂溶性荧光染色（BODIPY493/503）观察转染Pin1低表达慢病毒前后宫颈癌细胞中性脂肪含量的变化。 结果 与慢性宫颈炎相比，宫颈癌组织中Pin1和ACC1蛋白表达明显上调（P < 0.05），两者在宫颈癌组织中的表达呈正相关（ χ2 = 6.02，P < 0.05）。与C33a细胞相比，SiHa细胞中Pin1蛋白的表达水平较低，故选用C33a细胞转染Pin1低表达慢病毒。C33a细胞转染Pin1低表达慢病毒后，Pin1及ACC1蛋白表达水平明显降低（ P < 0.05），与正常对照组和阴性对照组比，转染Pin1低表达慢病毒的细胞内中性脂肪酸含量降低。 结论 Pin1蛋白的表达参与宫颈癌细胞内的脂质代谢，具体调控机制尚待研究。 -
关键词:
- 宫颈癌 /
- 肽基脯氨酰同分异构酶 /
- 脂肪酸合成酶
Abstract:Objective To investigate the effect of peptide-based prolinyl isomerase（Pin1）protein on lipid metabolism in cervical cancer cells. Methods The expression of Pinl and ACC1 protein in chronic cervical cancer and cervical cancer tissues was detected by immunohistochemistry. Western blotting and RT-PCR were used to detect the background expression of Pin1 gene in SiHa, C33a and H8 cells of cervical cancer, and RNA interference was used to detect the expression of Pin1 in C33a cells of cervical cancer. The influence of Pin1 protein expression on ACC1 protein expression in cervical cancer cells was detected by Western blotting. Lipid-soluble fluorescence staining（bodipy493/503）was used to observe the changes in the content of neutral fat in cervical cancer cells before and after transfection with low expression of lentivirus Pin1. Results Compared with chronic cervicitis, the expression of Pin1 and ACC1 in cervical cancer tissues was significantly up-regulated（P < 0.05）, and the expression of Pin1 and ACC1 in cervical cancer tissues was positively correlated（r = 4.45, P < 0.05）. Compared with C33a cells, the expression level of Pin1 protein in SiHa cells was relatively low, so C33a cells were selected for transfection with lentivirus with low Pin1 expression. After the transfection with lentivirus with low Pin1 expression in C33a cells, the protein expression levels of Pin1 and ACC1 were significantly decreased（ P < 0.05）. Compared with normal control group and negative control group, the content of intracellular neutral fatty acids transfected with lentivirus with low Pin1 expression was decreased. Conclusion The expression of Pin1 protein is involved in lipid metabolism in cervical cancer cells, and the specific regulatory mechanism remains to be studied. -
Key words:
- Cervical cancer /
- Peptide-prolinyl isomerase /
- Fatty acid synthetase
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依托咪酯作为危重患者的首选麻醉用药，与其相关的药代动力学及药效动力学的研究已经很多，但所有的研究对象均为非烧伤患者，现在国内外对于烧伤患者依托咪酯药代动力学的研究几乎仍是空白。所以设计本课题研究依托咪酯在不同烧伤程度患者药代动力学变化。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
本研究方案通过医院伦理委员会批准及家属同意，选择行择期手术患者45例，ASA（American Society of Anesthesiologists）Ⅱ～Ⅲ级，无严重感染，无休克或休克已得到纠正，不合并高血压、糖尿病、冠心病等慢性疾病，术前心电图、血常规等检查无明显异常者，所有患者均不使用术前药物。入选患者男女不限，身高不限，BMI（body mass index，）25～30 kg/m2。共分为3组，A组（轻度烧伤组）：Ⅱ°烧伤面积在10%以下；B组（中度烧伤患者）：Ⅱ°烧伤面积11%～30%或Ⅲ°烧伤面积不足10%的烧伤患者；C组（重度烧伤患者）：烧伤总面积31%～50%或Ⅲ°烧伤面积在11%～20%。
1.2 麻醉方法
45例患者进入手术室后行经皮血氧饱和度、血压、Ⅱ导联心电监测。麻醉诱导：45例患者均以舒芬太尼TCI给药（目标血浆浓度0.4 ng/mL），TCI舒芬太尼15 min（Tt15）时开始静脉泵注依托咪酯，依托咪酯用药量为0.4 mg/kg，设置2 min泵注结束，待意识消失后给予静脉注射罗库溴铵0.9 mg/kg，TCI20（Tt20）时间点行气管插管，然后连接麻醉机呼吸螺纹管行机械通气。术中维持：右美托咪定0.4 µg/（kg.h）持续泵注，动态调节吸入七氟烷浓度镇静，持续TCI舒芬太尼（血浆效应室浓度0.4 ng/mL）镇痛，不追加肌松药。术中生命体征维持在入手术室安静状态下的基础生命体征±20%范围内，必要时使用加温毯维持患者体温，使用血管活性药物维持血流动力学稳定。术毕前30 min停止静脉泵注舒芬太尼和右美托咪定。
1.3 标本采集及依托咪酯血浆药物浓度测定
分别在TCI开始后20、30、40、50、60、90 min及TCI停药时（停时）和TCI停药后1、3、5、8、10、20、30 min各时间点采集动脉血2 ml，使用高效液相色谱-荧光法测定标本血浆中依托咪酯的Cm。
1.4 统计学处理
本课题中检测出的依托咪酯的血浆药物浓度，采用药代动力学分析软件进行分析处理，拟合最佳房室模型，求出课题中烧伤患者的药代动力学参数。应用 SPSS23.0 统计软件进行数据处理。所有计量资料用均数±标准差（
$\bar x \pm s$ ）表示，使用单因素方差分析进行比较，方差分析有统计学意义（P < 0.05）则进一步使用LSD法进行两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 一般情况
在A组、B组和C组患者中，性别、年龄等协变量组间，差异无统计学意义（P > 0.05）。
A、B组术前血生化白蛋白、ALT组间差异无统计学意义（P > 0.05）。A、B组术前白蛋白含量高于C组（P < 0.05），A、B组术前ALT小于C组（P < 0.05）。C组失血量大于A、B组，A、B组间差异无统计学意义（P > 0.05），见表1。
表 1 一般情况（$\bar x \pm s$ ）Table 1. General information （$\bar x \pm s$ ）项目 A组（n = 15） B组（n = 15） C组（n = 15） 术前白蛋白（g/L） 39.8 ± 5.4* 36.7 ± 4.5* 29.8 ± 3.8 术前ALT（U/L） 33.8 ± 21.9* 34.0 ± 26.24* 117.8 ± 86.0 出血量（mL） 149 ± 89.1* 134 ± 56.4* 427 ± 189.2 与C组比较，*P < 0.05。 2.2 依托咪酯药代动力学参数
C组的K31、CL1、CL3小于A组和B组，差异有统计学意义（P < 0.05）；C组的V3、T1/2r 大于A组和B两组，差异有统计学意义（P < 0.05）。A组和B组的K31、CL1、CL3、V3、T1/2r组间，差异无统计学意义（P > 0.05）。A组、B组和C组除以上药代参数外，其余药代动力学参数指标组间，差异无统计学意义（P > 0.05），见表2。
表 2 依托咪酯药代动力学参数（$\bar x \pm s$ ）Table 2. Pharmacokinetical parameters of Etomidate （$\bar x \pm s$ ）项目 A组（n = 15） B组（n = 15） C组（n = 15） T1/2α（min） 2.48 ± 0.83 2.29 ± 0.67 2.33 ± 0.52 T1/2β（min） 24.54 ± 2.62 25.50 ± 4.72 25.01 ± 5.37 T1/2r（min） 257.97 ± 51.11a 275.47 ± 40.92a 357.47 ± 60.5 V1（L） 4.92 ± 1.29 5.14 ± 1.04 4.87 ± 1.12 V2（L） 16.22 ± 3.12 14.52 ± 2.13 15.26 ± 2.11 V3（L） 117.11 ± 22.12* 114.20 ± 19.15* 141.61 ± 28.21 CL1（L/min） 1.41 ± 0.39* 1.37 ± 0.27* 1.09 ± 0.29 CL2（L/min） 1.07 ± 0.21 0.91 ± 0.17 0.99 ± 0.18 CL3（L/min） 0.97 ± 0.14* 0.89 ± 0.18* 0.68 ± 0.19 K10（min−1） 0.287 ± 0.014 0.266 ± 0.013 0.223 ± 0.043 K12（min−1） 0.271 ± 0.029 0.177 ± 0.016 0.172 ± 0.022 K21（min−1） 0.066 ± 0.004 0.065 ± 0.003 0.065 ± 0.017 K13（min−1） 0.197 ± 0.032 0.173 ± 0.033 0.139 ± 0.025 K31（min−1） 0.008 28 ± 0.002 9* 0.0079 ± 0.001 7* 0.004 81 ± 0.000 9 与C组比较，*P < 0.05。 3. 讨论
烧伤在造成相应组织、器官直接损伤的同时，还使烧伤生物体发生特有的病理生理变化。如毛细血管扩张和血管壁的通透性增加，体液渗出，内环境紊乱，循环血量减少[1]。烧伤可造成血浆白蛋白明显下降，且血浆白蛋白降低的幅度与烧伤程度成正比[2]。本实验也证实了此结果。以前的研究得出[3]：依托咪酯在人群中的T 1/2α为2.7 min，T1/2β为29 min，T1/2r为2.9～5.3 h，单次静脉注射依托咪酯通常在30～60 s内起效，它的起效时间与初始分布半衰期有关。De Ruiter G等[4]研究发现依托咪酯在人体内的药代动力学最符合开放三室模型，依托咪酯的T 1/ 2α为（2.8±2.3）min，T1/2β为（22.3±10.4）min，T1/2r为（208.8±64.9）min。任三姐等[5]在患者输入依托咪酯的群体药代动力学研究中得出依托咪酯的药代学参数典型值为：V1 = 4.7 L，V2 = 11 L，V3 = 123 L，CL1 = 1.28-0.0119×[年龄（岁）-55]L/min，CL2 = 1.25 L/min和CL3 = 1.08 L/min。
通过药代动力学软件分析，本课题中依托咪酯的代谢符合从中央室一级速率消除的三室模型。这与任三姐、宋金超等人的研究结果相同[5-6]。依托咪酯在输注开始的30 min内降解最快，随后逐渐减慢[7]。本实验结果中轻、中、重度烧伤患者T1/2r的数值均大于De Ruiter G等的研究结果。并且本实验中三组患者的CL1、CL3均小于任三姐等的研究结果。
依托咪酯与大多数药物的代谢场所一致，它的首要代谢场所是肝脏，依托咪酯的代谢与体内的羧酸酯酶和细胞色素P450酶系最为相关[8-9]。Renton[10]研究表明，炎症可使氨茶碱代谢过程中相关的细胞色素 P450 代谢酶活性降低，从而使氨茶碱清除率下降。除此之外，还有多项研究表明炎症可影响临床用药的药效以及安全性。Morgan等[11]研究表明，哺乳动物体内多个组织器官的细胞色素 P450 酶活性可因为生物体遭受感染和发生炎症而被影响。同时，炎症状态下促炎因子 IL-1，IL-6，TNF以及IFN能使细胞色素P450氧化酶活性不同程度下降[10]。在一项研究小鼠肝脏、肠道羧酸酯酶表达及酶活性的影响因素的实验中发现细菌脂多糖（LPS）可明显抑制小鼠肝脏、肠道羧酸酯酶表达及酶活性[12]。而重度烧伤患者产生应激反应、释放大量的炎性介质的同时常合并细菌感染。上述因素可导致依托咪酯代谢发生变化。
血清ALT是肝脏健康的指标之一，血清ALT也能够影响CYP450酶系的活性[13]。本课题中C组患者术前血生化ALT值为（117.8±86.0），显高于人体ALT值正常上限，A组和B组术前血生化ALT值在正常值区间内。以上各项研究表明重度烧伤患者体内羧酸酯酶和CYP450酶系的活性受抑制最明显，从而使依托咪酯清除减慢[14]。重度烧伤患者常合并肾功能损害[15]，而进入生物体内的依托咪酯经过复杂的代谢后，其产物主要经过肾脏随尿液排出体外，进入体内的依托咪酯有2%以原型形式经过尿液直接排出体外。因为肾损伤的存在，使得进一步减缓了依托咪酯在重度烧伤患者体内清除速度。本实验中，通过药代动力学软件计算，证实重度烧伤患者药物代谢减慢，清除率较轻、中度患者低。
因为重度烧伤患者血浆白蛋白含量明显降低，所以重度烧伤患者体内游离依托咪酯含量更高，但因为依托咪酯脂肪乳剂本身就具有较强的脂溶性，所以依托咪酯游离体能相对较轻松透过细胞膜。与此同时，重度烧伤患者因高血流动力学状态，使得外周室的依托咪酯浓度升高更加迅速，所以，使得依托咪酯的重度烧伤患者中的V3较轻、中度烧伤患者稍大。
K31（K31 = CL3/V3）是药物从深外周室向中央室转运的一级速率常数。数值的大小代表转运时速度的大小，数值越小，转运速度越小，同样剂量的依托咪酯在组织中停留时间更长。因依托咪酯代谢所需要的酶均因烧伤引起的生理病理改变而被抑制，所以使得药物在体内的作用时间更长。本课题中，C患者组K31值小于A组和B组患者组，故而重度烧伤患者依托咪酯从组织进入肝脏被代谢所花费的时间更长，在体内留存时间更长，所以重度烧伤患者组使用依托咪酯的副作用的发生率相比其他两组可能更高。
综上所述，本课题中依托咪酯在重度烧伤患者体内的药代动力学与轻、中度烧伤患者体内的药代动力学差别较大，而轻、中度烧伤患者依托咪酯的药代动力学无明显差异。重度烧伤患者血浆白蛋白明显降低，导致血浆游离依托咪酯含量较其他两组较高，且依托咪酯代谢过程相关酶系抑制程度较重，所以重度烧伤患者的血浆依托咪酯浓度下降减慢，T1/2r延长，K31、CL1和CL3减小。本课题也得出重度烧伤患者体内依托咪酯V3增加。所以在重度烧伤患者使用依托咪酯进行麻醉诱导时应适当减少用药，以降低使用依托咪酯的不良反应的发生率。
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图 1 Pin1和ACC1蛋白在两种宫颈病变组织中的表达情况（×200）
A、B：宫颈癌组织；C、D：正常宫颈组织。
Figure 1. The expression of Pin1 and ACC1 protein in two cervical lesions
图 2 Pin1蛋白在3株细胞中的表达情况
A：Pin1的Western blotting结果；B：Pin1蛋白相对表达量。与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
Figure 2. The expression of Pin1 protein in 3 cell lines
图 3 Pin1 mRNA在3株细胞中的表达情况
A：Pin1的PCR结果；B：Pin1mRNA相对表达量。与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
Figure 3. The expression of Pin1 mRNA in 3 cell lines
图 4 干扰Pin1后宫颈癌细胞中Pin1和ACC1蛋白表达情况
A：Pin、ACC的Western blotting结果；B：Pin、ACC蛋白相对表达量。与C33a细胞比较，*P < 0.05。
Figure 4. The expression of Pin1 and ACC1 protein expression in cervical cancer cells after down regulate Pin1
图 5 干扰Pin1基因后宫颈癌细胞内中性脂肪含量
A：shNON；B：shRACK1。
Figure 5. Neutral fat content in cervical cancer cells after down regulate Pin1
表 1 Pinl和ACC蛋白在宫颈相应组织中的表达情况[n（%）]
Table 1. The expression of Pinl and ACC proteins in corresponding cervical tissues[n（%）]
分类 n Pin1 ACC1 阳性 χ2 P 阳性 χ2 P 慢性宫颈组织 30 9（30） 94.471 0.0000 11（36.67） 45.274 0.000 CSCC组织 64 59（92.18）* 50（78.13）* 与慢性宫颈炎组织比较，*P < 0.05。 
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表 2 Pin1与ACC1表达水平的相关性分析
Table 2. Correlation analysis of expression levels of Pin1 and ACC1
Pin1 ACC1 χ2 P + − + 10 45 6.02 0.014 − 5 4
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表 3 宫颈癌细胞中Pin1 mRNA的相对表达量（
$\bar x \pm s $ ）Table 3. The relative expression of Pin1 mRNA in cervical cancer cells（
$\bar x \pm s $ ）基因名 H8 SiHa C33a F P Pin1 0.17 ± 0.069* 1.0 ± 0.67 1.43 ± 0.26 91.997 0.000 与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
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