The Effect of Peptide-prolinyl Isomerase（Pin1）on Lipid Metabolism in Cervical Cancer Cells
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摘要:
目的 探讨肽基脯氨酰同分异构酶（Pin1）蛋白对宫颈癌细胞脂质代谢的作用。 方法 应用免疫组织化学方法检测Pinl和ACC1蛋白在女性慢性宫颈癌及宫颈癌组织的表达；Western blotting技术和RT-PCR技术检测Pin1基因在宫颈癌SiHa、C33a及H8细胞中的蛋白本底表达情况，采用RNA干扰技术下调子宫颈癌C33a细胞中Pin1的表达；Western blotting技术检测宫颈癌细胞中Pin1蛋白表达水平变化对ACC1蛋白表达的影响；脂溶性荧光染色（BODIPY493/503）观察转染Pin1低表达慢病毒前后宫颈癌细胞中性脂肪含量的变化。 结果 与慢性宫颈炎相比，宫颈癌组织中Pin1和ACC1蛋白表达明显上调（P < 0.05），两者在宫颈癌组织中的表达呈正相关（ χ2 = 6.02，P < 0.05）。与C33a细胞相比，SiHa细胞中Pin1蛋白的表达水平较低，故选用C33a细胞转染Pin1低表达慢病毒。C33a细胞转染Pin1低表达慢病毒后，Pin1及ACC1蛋白表达水平明显降低（ P < 0.05），与正常对照组和阴性对照组比，转染Pin1低表达慢病毒的细胞内中性脂肪酸含量降低。 结论 Pin1蛋白的表达参与宫颈癌细胞内的脂质代谢，具体调控机制尚待研究。 -
关键词:
- 宫颈癌 /
- 肽基脯氨酰同分异构酶 /
- 脂肪酸合成酶
Abstract:Objective To investigate the effect of peptide-based prolinyl isomerase（Pin1）protein on lipid metabolism in cervical cancer cells. Methods The expression of Pinl and ACC1 protein in chronic cervical cancer and cervical cancer tissues was detected by immunohistochemistry. Western blotting and RT-PCR were used to detect the background expression of Pin1 gene in SiHa, C33a and H8 cells of cervical cancer, and RNA interference was used to detect the expression of Pin1 in C33a cells of cervical cancer. The influence of Pin1 protein expression on ACC1 protein expression in cervical cancer cells was detected by Western blotting. Lipid-soluble fluorescence staining（bodipy493/503）was used to observe the changes in the content of neutral fat in cervical cancer cells before and after transfection with low expression of lentivirus Pin1. Results Compared with chronic cervicitis, the expression of Pin1 and ACC1 in cervical cancer tissues was significantly up-regulated（P < 0.05）, and the expression of Pin1 and ACC1 in cervical cancer tissues was positively correlated（r = 4.45, P < 0.05）. Compared with C33a cells, the expression level of Pin1 protein in SiHa cells was relatively low, so C33a cells were selected for transfection with lentivirus with low Pin1 expression. After the transfection with lentivirus with low Pin1 expression in C33a cells, the protein expression levels of Pin1 and ACC1 were significantly decreased（ P < 0.05）. Compared with normal control group and negative control group, the content of intracellular neutral fatty acids transfected with lentivirus with low Pin1 expression was decreased. Conclusion The expression of Pin1 protein is involved in lipid metabolism in cervical cancer cells, and the specific regulatory mechanism remains to be studied. -
Key words:
- Cervical cancer /
- Peptide-prolinyl isomerase /
- Fatty acid synthetase
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沙门菌属和志贺菌属是儿童细菌性腹泻的常见病原菌。沙门菌可引起腹泻、脓毒症、伤寒、颅内感染及肠外病灶性感染，志贺菌可引起急性或慢性细菌性痢疾[1]。近年来由于沙门菌和志贺菌耐药菌株增加，抗生素的不合理应用导致病情加重[2-3]。本文通过探讨2017年1月至2020年12月昆明市儿童医院检出的志贺菌和沙门茵茵型分布及对常用抗生素的耐药情况，为临床医师经验治疗提供参考。
1. 资料与方法
1.1 标本来源
对2017年1月至2020年12月昆明市儿童医院门诊就诊及住院腹泻患儿（0～14岁），共29674份新鲜粪便做细菌培养。经向昆明市儿童医院伦理委员会审请，本论文涉及数据和资料为回顾性资料，同意免除知情同意。
1.2 仪器和试剂
志贺菌、沙门菌诊断血清购于宁波天润生物制品有限公司，全自动细菌鉴定仪（VITEK2 compact）及生化鉴定、药敏卡购于法国生物梅里埃公司。
1.3 方法
按照《全国临床检验操作规程》（第4版）[4]及《临床微生物检验标准化操作》（第3版）[5]。挑取新鲜粪便的黏液或脓血部分划线接种于 SS 和麦康凯琼脂平板上，35 ℃恒温培养 18～24 h，挑取平板上单个可疑菌落依次完成血清凝集试验（玻片法）和生化药敏鉴定（VITEK2 compact GN，GN14卡）。药敏结果判读参考美国NCCL SM-100第30版，血清凝集分型试验根据宁波天润生物制品公司产品说明书确定菌株的血清型。
1.4 质量控制
GN 和GN14卡每周用标准菌株 ATCC25922大肠埃希菌和ATCC700323霍氏肠杆菌，进行室内质控，标准菌株为梅里埃公司赠送。
1.5 统计学处理
采用WHONET 5.6软件完成菌种和药敏统计分析。采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，计数资料用率（%）表示，采用χ2 检验，P < 0.05 为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 沙门菌和志贺菌 检出情况及流行病学特点
在腹泻患儿粪便标本中分离出75株志贺菌和151株沙门菌（同一患者同一种细菌重复者剔除），年龄从 0 月龄至 14岁。感染的病原菌以 3～5 岁组居多，其次是 6～14 岁组，但沙门菌以0～2 岁组居多（表 1）。
表 1 2017年～2020年各年龄组儿童细菌性腹泻病原菌的种类及数量分布Table 1. Distribution of pathogenic bacteria in children with bacterial diarrhea in different age groups in Kunming from 2017 to 2020年龄组（岁） 沙门菌属 志贺菌属 福氏 宋内 株数（n） 构成比（%） 株数（n） 构成比（%） 株数（n） 构成比（%） 0～2 110 72.8 7 21.2 8 19.1 3～5 28 18.5 14 42.4 20 47.6 6-14 13 8.6 12 36.4 14 33.3 合计 151 100 33 100.0 42 100.0 病原菌主要分布在4～10月，聚集分布在5～9月为腹泻感染高峰（图1）。
图 1 2017年～2020年儿童细菌性腹泻病原菌各月份分布Figure 1. Distribution of pathogenic bacteria in children with bacterial diarrhea in Kunming from 2017 to 20202017年1月至2020年12月分离出志贺菌和沙门菌共226株，其中志贺菌属75株，占33.2%（福氏志贺菌33株、宋内志贺菌42）株），未检出痢疾志贺菌和鲍氏志贺菌，志贺菌属各年度感染数量有波动;沙门菌属 151株，占66.8%，其中以鼠伤寒沙门菌为主（106株），呈逐年上升趋势（表2）。
表 2 2017年～2020年儿童细菌性腹泻病原菌的种类及数量分布[n（%）]Table 2. Types and quantity distribution of pathogens causing bacterial diarrhea in children in Kunming from 2017 to 2020 [n（%）]年份 沙门菌属 志贺菌属 总计 鼠伤寒 伤寒 乙型副伤寒 新港 纽波特 总计 福氏 宋内 总计 2017 14（9.27） 1（0.66） 0（0.00） 0（0.00） 0（0.00） 15（9.93） 14（18.67） 1（1.33） 15（9.93） 30（100.00） 2018 25（16.56） 14（9.27） 2（1.32） 0（0.00） 0（0.00） 44（29.14） 18（24.00） 2（2.67） 20（13.25） 64（100.00） 2019 33（21.85） 10（6.62） 1（0.66） 0（0.00） 1（0.66） 45（29.80） 0（0.00） 38（50.67） 38（25.17） 83（100.00） 2020 44（29.14） 0（0.00） 0（0.00） 1（0.66） 2（1.32） 47（31.13） 1（1.33） 1（1.33） 2（01.32） 49（100.00） 合计 106（70.20） 25（16.56） 3（1.99） 1（0.66） 3（1.99） 151（100.00） 33（44.00） 42（56.00） 75（49.67） 226（100.00） 2.2 沙门菌和志贺菌的药敏情况
沙门菌属对阿莫西林/克拉维酸有很好的敏感性，而对头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、环丙沙星、复方新诺明敏感性较低。未发现亚胺培南耐药（表3）。
表 3 2017年～2020年儿童细菌性腹泻沙门氏菌属和志贺氏菌属对主要抗生素的药敏情况[n（%）]Table 3. Antimicrobial susceptibility of Salmonella andShigella isolated from children with bacterial diarrhea in Kunmingfrom 2017 to 2020 [n（%）]抗生素 沙门氏菌属 志贺菌属 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 氨苄西林 19（12.80） 0（0.00） 129（87.20） 0（0.00） 0（0.00） 75（100.00） 阿莫西林/克拉维酸 117（82.00） 28（16.00） 2（1.30） 57（75.40） 16（20.70） 3（03.90） 哌拉西林 19（12.80） 38（25.60） 91（61.40） 4（05.90） 45（60.30） 25（33.80） 头孢曲松 88（59.40） 0（0.00） 60（40.60） 6（07.50） 0（00.00） 69（92.50） 头孢他啶 96（65.00） 0（0.00） 51（35.00） 68（90.50） 1（01.80） 6（07.70） 头孢吡肟 91（61.40） 14（9.40） 34（29.20） 57（75.40） 3（3.70） 16（20.90） 氨曲南 90（59.00） 0（0.00） 57（41.00） 59（79.20） 3（3.70） 13（17.10） 复方新诺明 95（64.70） 0（0.00） 50（35.30） 8（11.30） 0（0.00） 67（88.70） 亚胺培南 151（100.00） 0（0.00） 0（0.00） 75（100.00） 0（0.00） 0（0.00） 环丙沙星 109（72.40） 6（4.00） 36（23.60） 53（70.90） 8（10.00） 14（19.10） 左氧氟沙星 111（74.00） 8（5.60） 32（20.40） 61（81.00） 11（15.00） 3（4.00） 福氏志贺菌较宋内志贺菌耐药，如阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、氨曲南、复方新诺明且有统计学意义（P < 0.05）。宋内志贺菌和福氏志贺菌均对左氧氟沙星有较高的敏感性，且均对氨苄西林敏感率为0。宋内志贺菌和福氏志贺菌均未发现亚胺培南耐药情况（ 表4）。
表 4 2017年～2020年儿童细菌性腹泻福氏志贺菌和宋内志贺菌对主要抗生素的药敏情况[n（%）]Table 4. Drug sensitivity of flexneria and sonneiella to main antibiotics in children with bacterial diarrhea in Kunming area from 2017 to 2020 [n（%）]抗生素 福氏志贺菌 宋内志贺 χ2 P 敏感 中介 耐药 敏感 中介 耐药 氨苄西林 0（0.00） 0（0.00） 33（100.00） 0（0.00） 0（0.00） 42（100.00） − 1.000 阿莫西林/克拉维酸 3（10.00） 23（70.00） 7（20.00） 39（92.80） 0（0.00） 3（7.20） 52.630 0.001* 哌拉西林 7（20.00） 7（20.00） 20（60.00） 1（2.30） 29（69.00） 12（28.70） 6.614 0.010* 头孢曲松 10（30.00） 0（0.00） 23（70.00） 1（2.30） 0（0.00） 41（97.70） 11.510 0.007* 头孢他啶 20（60.00） 3（10.00） 10（30.00） 41（97.60） 0（0.00） 1（2.40） 16.680 0.001* 头孢吡肟 13（40.00） 7（20.00） 13（40.00） 35（83.80） 3（7.10） 4（9.10） 15.490 0.001* 氨曲南 13（40.00） 0（0.00） 20（60.00） 37（88.00） 2（4.70） 3（7.30） 19.720 0.001* 复方新诺明 20（60.00） 0（0.00） 13（40.00） 0（0.00） 0（0.00） 42（100.00） 34.710 0.001* 亚胺培南 33（100.00） 0（0.00） 0（0.00） 42（100.00） 0（0.00） 0（0.00） − 1.000 环丙沙星 25（75.00） 0（0.00） 8（25.00） 29（69.00） 4（10.00） 9（21.00） 0.413 0.521 左氧氟沙星 26（80.00） 0（0.00） 7（20.00） 34（82.00） 6（15.00） 1（3.00） 0.204 0.651 *P < 0.05。 3. 讨论
感染性腹泻在全世界及我国传染病中位居前列[6]，是严重影响儿童健康的疾病。本文结果显示儿童沙门菌感染的易感人群为0～2岁，占72.8%（110/151），以鼠伤寒沙门菌为主。这可能因为2岁以下婴幼儿免疫系统发育尚不健全，并且肠道功能发育不成熟，肠道中胃酸及消化酶活力较低，该年龄段以蛋、奶制品等为主食，蛋、奶制易被鼠伤寒沙门菌污染，这也可能是导致感染的原因。另外有学者发现，由案板和刀具清洁不当、处理生食后的手部清洁不当引起的交叉感染，成为导致鼠伤寒沙门菌传播的主要因素[7]。本文连续的监测数据显示昆明地区2017、2018年以福氏志贺菌为主，2019年以宋内志贺菌为主，志贺菌感染存在不确定性，有散在或暴发流行的可能。笔者的研究发现沙门菌属感染总体比志贺菌属多，且呈逐年上升趋势。本文研究显示感染的病原菌主要分布在4～10 月，5～9月为腹泻发病高峰，这可能与昆明地区5～9月气温较高有关。
沙门菌属和志贺菌属对抗菌药物的耐药率有差异。沙门菌属耐药率普遍比志贺菌属高，与文献报道不一致[8]。151株沙门菌敏感率较高的药物依次为阿莫西林/克拉维酸（82%）、左氧氟沙星（74%）、头孢他啶（65%）、复方新诺明（64.7%）、头孢吡肟（61.4%）头孢曲松（59.4%）。对临床常用的头孢他啶、头孢吡肟的敏感率只有65%、61.4%。与文献报道一致[9-11]，本文研究结果显示对于沙门菌感染，三、四代头孢抗生素不宜作为首选药物，而阿莫西林/克拉维酸可作为临床首选药。
宋内菌药敏结果显示对头孢他啶、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南、头孢吡肟的敏感率分别为97.6%、92.8%、88%、83.8%。宋内菌感染可选头孢他啶、阿莫西林/克拉维酸、氨曲南作为临床首选药物。福氏菌药敏结果显示头孢他啶、头孢吡肟敏感率为60%和40%。上述结果提示头孢他啶和头孢吡肟不宜作为福氏菌感染的首选药物；虽然环丙沙星、左氧氟沙星敏感率相对较高，但是儿童骨骼生长可受到氟喹诺酮类药物影响而限制运用，但也有研究发现环丙沙星能治疗儿童急性腹泻也未出现软骨异常[12]。因此在没有其他有效药物或由多重耐药菌株引起严重的细菌性腹泻时，是否可以考虑应用。本研究发现福氏志贺菌较宋内志贺菌耐药，与文献报道一致[13]，推测福氏菌的高耐药率与其可能携带Ⅰ类整合子有关。笔者等人前期研究结果表明儿童产 ESBLs 志贺菌中Ⅰ类整合子携带率（91.7%），而且携带Ⅰ类整合子的志贺菌同产ESBLs 菌株之间存在密切相关性，即Ⅰ类整合子阳性志贺菌中多数产 ESBLs[14]。
由于沙门菌属和志贺菌属均具有获得和传播质粒、整合子等可移动的外源性基因的能力，从而容易引起获得性耐药的产生，导致临床目前主要使用的三、四代头孢菌素耐药率较高，给临床经验用药带来了一定挑战 [15]。因此对沙门菌属和志贺菌属菌型分布和耐药测定，将对指导临床合理用药和控制儿童腹泻的发生以及减少细菌耐药起到积极作用。
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图 1 Pin1和ACC1蛋白在两种宫颈病变组织中的表达情况（×200）
A、B：宫颈癌组织；C、D：正常宫颈组织。
Figure 1. The expression of Pin1 and ACC1 protein in two cervical lesions
图 2 Pin1蛋白在3株细胞中的表达情况
A：Pin1的Western blotting结果；B：Pin1蛋白相对表达量。与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
Figure 2. The expression of Pin1 protein in 3 cell lines
图 3 Pin1 mRNA在3株细胞中的表达情况
A：Pin1的PCR结果；B：Pin1mRNA相对表达量。与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
Figure 3. The expression of Pin1 mRNA in 3 cell lines
图 4 干扰Pin1后宫颈癌细胞中Pin1和ACC1蛋白表达情况
A：Pin、ACC的Western blotting结果；B：Pin、ACC蛋白相对表达量。与C33a细胞比较，*P < 0.05。
Figure 4. The expression of Pin1 and ACC1 protein expression in cervical cancer cells after down regulate Pin1
图 5 干扰Pin1基因后宫颈癌细胞内中性脂肪含量
A：shNON；B：shRACK1。
Figure 5. Neutral fat content in cervical cancer cells after down regulate Pin1
表 1 Pinl和ACC蛋白在宫颈相应组织中的表达情况[n（%）]
Table 1. The expression of Pinl and ACC proteins in corresponding cervical tissues[n（%）]
分类 n Pin1 ACC1 阳性 χ2 P 阳性 χ2 P 慢性宫颈组织 30 9（30） 94.471 0.0000 11（36.67） 45.274 0.000 CSCC组织 64 59（92.18）* 50（78.13）* 与慢性宫颈炎组织比较，*P < 0.05。 
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表 2 Pin1与ACC1表达水平的相关性分析
Table 2. Correlation analysis of expression levels of Pin1 and ACC1
Pin1 ACC1 χ2 P + − + 10 45 6.02 0.014 − 5 4
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表 3 宫颈癌细胞中Pin1 mRNA的相对表达量（
$\bar x \pm s $ ）Table 3. The relative expression of Pin1 mRNA in cervical cancer cells（
$\bar x \pm s $ ）基因名 H8 SiHa C33a F P Pin1 0.17 ± 0.069* 1.0 ± 0.67 1.43 ± 0.26 91.997 0.000 与正常宫颈上皮细胞比较，*P < 0.05。
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