Expression of MCM7 Protein during the Spermatogenesis of Artificially Domesticated Tree Shrew
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摘要:
目的 探讨MCM7蛋白在人工驯养树鼩精子发生过程中的表达特点及其表达是否存在季节性差异，为以树鼩作为动物模型进行生殖研究提供基础性实验数据。 方法 对全年12组不同月份的成年人工驯养树鼩睾丸组织进行HE染色及MCM7蛋白的免疫组化检测。 结果 1～12月份人工驯养树鼩睾丸组织中，MCM7蛋白在曲精小管中主要表达于精原细胞和部分初级精母细胞，其阳性细胞率在2月份和3月份较全年其他月份均有显著性差异（P < 0.05）。 结论 人工驯养树鼩精子发生过程中，MCM7蛋白可能在精原细胞和初级精母细胞的DNA复制过程中发挥作用，其蛋白表达的活跃程度存在季节性差异。 Abstract:Objective To study the expression characteristics of MCM7 protein during spermatogenesis of artificially domesticated tree shrews and whether there are seasonal differences in its expression, so as to provide basic experimental data for reproductive research using tree shrews as animal models. Methods 12 groups of adult male artificially domesticated tree shrews testis tissues of different months were used as the materials and immunohistochemical detection of MCM7 protein was performed on the paraffin tissue sections. Results MCM7 protein was expressed in spermatogonia and some primary spermatocyte of the testes in artificially domesticated tree shrews. Compared with the other months in the whole year, the positive cell rate of MCM7 protein was significantly different in February and March （P < 0.05）. Conclusions MCM7 protein may play a role in the DNA replication of spermatogonia and primary spermatocytes during the spermatogenesis of artificially domesticated tree shrews, and there was seasonal difference in the activity of MCM7 protein expression. -
Key words:
- Artificially domesticated tree shrew /
- Spermatogenesis /
- MCM7 protein
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树鼩是灵长类树鼩科树鼩属动物，主要生活在热带、亚热带地区。全基因组测序分析和国内外多项研究结果表明，树鼩在组织解剖学、生理学、神经系统、代谢系统和免疫系统等方面与人类近似，且具有体型小、繁殖周期短、易于实验操作等特点，有望作为雄性生殖生物学或生殖医学研究领域良好的替代者[1-2]。性成熟雄性野生树鼩的繁殖具有明显的季节性，每年仅4～7月份为生殖季节[3]。近年来有报道指出，人工驯养树鼩可以打破繁殖的季节限制[4]。那么，这是否意味着人工驯养树鼩的精子发生过程已经没有季节性差异？目前并无相关的基因水平报道予以证实。这些研究数据的缺乏，给以树鼩作为模式生物来进行雄性生殖医学方面的研究在重复性、稳定性及可比性等方面造成了极大的不确定性和隐患。例如采用不同季节的人工驯养树鼩建立的雄性生殖系统疾病模型是否本身就存在着差异？这些差异又是否会影响后续研究结果的可靠性？这一现状极大制约了对以树鼩作为模式生物来进行生殖系统疾病的相关研究。
生精细胞分裂增殖是精子发生过程的核心事件之一，微小染色体维持蛋白7 （mini-chromosome maintenance protein 7，MCM7）是近年来发现的细胞增殖相关因子，但对其的研究多集中于肿瘤的增殖调控[5]。关于MCM7蛋白在精子发生过程中的研究，有学者在成年大鼠睾丸中进行了表达探讨，研究结果表明MCM7蛋白与大鼠精子发生密切相关[6]。但MCM7蛋白在灵长类生物精子发生过程中的研究，目前尚未见相关研究报道。本研究对全年不同月份的树鼩睾丸进行了MCM7蛋白的免疫组化检测，以探讨人工驯养树鼩精子发生过程中MCM7蛋白的表达特点及其表达是否存在季节性差异，从而为以树鼩作为动物模型进行生殖相关方面的研究提供基础性实验数据。
1. 材料与方法
1.1 实验动物与试剂
实验选用健康的SPF级成年（18月龄）雄性人工驯养中缅树鼩，体重128～151 g，购于昆明医科大学实验动物中心。本实验经昆明医科大学伦理委员会批准（KM16/17），树鼩饲养于25 ℃、湿度45%的自然光照环境，每月随机抽取5只树鼩作为1组，共计抽取12组（60只）树鼩。MCM7鼠抗人单克隆抗体及免疫组化相关检测试剂购于Santa公司。
1.2 实验方法
1.2.1 石蜡组织切片制备
异氟烷麻醉树鼩，2 min内迅速取出睾丸放入现配的中性甲醛固定液中，固定过夜后乙醇系列梯度脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋。厚5 μm的组织切片贴于多聚赖氨酸防脱载玻片上，65 ℃烤片1 h后，4 ℃贮存备用。
1.2.2 HE染色
操作按常规HE染色技术进行。
1.2.3 MCM7蛋白免疫组化实验
每组取5张切片（5只树鼩中，每只随机抽取1张切片），二甲苯脱蜡、系列梯度乙醇复水后，采用柠檬酸缓冲液煮沸抗原修复法修复抗原。在切片上滴加内源性过氧化物酶阻断剂室温孵育10 min，PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。滴加适当比例稀释后的一抗工作液，4 ℃孵育过夜（对照组用PBS代替一抗工作液）。PBS缓冲液冲洗3次，每次3 min。滴加二抗，37 ℃湿盒孵育10 min。PBS 缓冲液冲洗3次，每次3 min，DAB镜控显色，光学显微镜下观察至细胞核阳性颜色与细胞外背景颜色对比反差明显时蒸馏水冲洗终止反应。苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水蓝化，梯度乙醇逐级脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。Nikon-90i显微镜观察并拍照。
1.2.4 总生精细胞及MCM7阳性细胞计数
12组免疫组化切片中，每组计数3张切片，每张切片随机选择10个MCM7蛋白出现阳性表达的曲精小管，显微镜下计数总生精细胞数目及MCM7蛋白表达阳性的生精细胞数目。
1.3 统计学处理
数据采用Prism7.0软件进行统计学处理并制图，计量资料用（
$\bar x\pm s$ ）表示，组间比较采用单因素方差分析，进一步采用SNK-q检验进行两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。2. 结果
2.1 树鼩睾丸HE染色结果
HE染色可观察到人工驯养树鼩睾丸组织曲精小管横截面上排列着5～7 层处于不同发育时期的各级生精细胞，从基底膜至管腔依次为精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、圆形精子细胞及变形的精子。1月份人工驯养树鼩睾丸组织曲精小管中变形中的精子细胞和精子变形脱落的残质较少（图1A）。2～4月份睾丸组织曲精小管中，可以看到处于变形中的精子细胞和脱落的残质较1月份逐月增多（图1B～1D）。5～8月份睾丸组织曲精小管管腔中可观察到大量处于变形中的精子细胞和几乎充满管腔的变形精子脱落的残质（图1E～1H）。9 月份睾丸组织大部分曲精小管中次级精母细胞、圆形精子和变形中的精子细胞数量较8月份明显减少，精子变形脱落的残质也明显减少，零星散布在曲精小管管腔中（图1I）。10～12月份睾丸组织曲精小管中次级精母细胞、圆形精子细胞及变形中的精子细胞较9月份有所增加，呈现出与1月份相似的状态（图1J～1L）。
图 1 不同月份人工驯养树鼩睾丸组织HE染色结果（×200）A：1月；B：2月；C：3月；D：4月；E：5月；F：6月；G：7月；H：8月；I：9月；J：10月；K：11月；L：12月。Figure 1. HE staining results in the testes of artificially domesticated tree shrew in different months（×200）2.2 MCM7蛋白免疫组化实验结果
MCM7蛋白免疫组化阳性部位位于细胞核，出现阳性反应的细胞核呈现棕色或褐色，未出现阳性反应的细胞核苏木素复染后呈现蓝色。
1～12月份人工驯养树鼩睾丸组织中，MCM7蛋白在部分曲精小管出现免疫阳性信号，具有免疫阳性信号的细胞主要为靠近基底膜的第1～2层部分细胞，结合HE染色结果判断，MCM7蛋白阳性表达的细胞为精原细胞和部分初级精母细胞（图2A～2L）。
图 2 不同月份人工驯养树鼩睾丸组织MCM7蛋白表达结果（×200）A：1月；B：2月；C：3月；D：4月；E：5月；F：6月；G：7月；H：8月；I：9月；J：10月；K：11月；L：12月。Figure 2. The results of MCM7 protein expression in the testes of artificially domesticated tree shrew in different months（×200）2.3 MCM7免疫组化阳性生精细胞百分率统计结果
不同月份的人工驯养树鼩睾丸组织MCM7蛋白免疫组化检测后的阳性生精细胞百分率统计结果显示：1月阳性细胞率（6.70±0.32）为1 a中最低点，2月时开始大幅上升（13.72±0.74），3月时达到顶峰（15.72±0.25），此后历经4月（12.16±0.22）、5月（10.31±0.49）的下降后，在6月（11.22±0.41）、7月（9.93±0.27）、8月（10.61±0.44）、9月（9.25±0.53）、10月（10.57±0.57）这5个月间呈小幅波动，之后在11月份（8.22±0.76）和12月份（7.05±0.64）继续下降。SNK-q 检验表明：2月、3月MCM7蛋白阳性生精细胞百分率较全年其他月份均有显著差异（P < 0.05），2月与3月之间亦具有显著差异（P < 0.05） （图3）。
图 3 人工驯养树鼩睾丸组织MCM7蛋白阳性细胞百分率的月份变化与2月比较，#P < 0.05；与3月比较，*P < 0.05。Figure 3. Change with percentage of MCM7 protein positive cells in artificially domesticated tree shrew3. 讨论
MCM7是微小染色体维持蛋白（mini-chromosome maintenance protein ，MCM）家族[7]的重要成员之一，该蛋白高度保守，广泛存在于真核生物中，可与MCM家族中其他成员形成多聚复合体，参与pre-RC的形成，在DNA复制的起始和延伸过程中起到调节作用[8-9]。
HE染色结果表明：5～8月份人工驯养树鼩睾丸组织曲精小管中变形中的精子细胞及精子变形脱落的残质明显多于全年其他月份，这提示人工驯养树鼩精子发生的活跃程度可能存在季节性差异。
免疫组化结果表明：1～12月份人工驯养树鼩睾丸组织中，MCM7蛋白主要表达于曲精小管的精原细胞和部分初级精母细胞中，与同样在DNA复制中发挥作用的PCNA蛋白在小鼠睾丸中的表达部位相同[10]。Emmanuelle Com等[6] 采用免疫印迹和免疫组织化学技术在大鼠睾丸精原细胞和初级精母细胞中观察到MCM7蛋白强烈的信号，推测MCM7在大鼠精子发生过程中起着重要的作用。本研究在人工驯养树鼩睾丸组织中也发现了同样的实验结果，这可能与精原细胞的有丝分裂和初级精母细胞的减数分裂都需要进行DNA复制密切相关。这一结果提示在人工驯养树鼩睾丸精子发生过程中，MCM7蛋白可能参与了精原细胞和初级精母细胞的DNA复制过程。
MCM7蛋白作为细胞增殖的一个敏感信号标志物，决定DNA复制能力的大小。MCM7蛋白的水平随细胞增殖、生长能力的增强而升高，正常细胞中MCM7蛋白的表达在G1/S转换时达峰值，在G0期细胞、分化及衰老的细胞中表达水平下降。因此，MCM7蛋白的表达可以有效反映细胞增殖的程度[11-12]。人工驯养树鼩睾丸组织中MCM7蛋白阳性生精细胞率统计结果显示：MCM7蛋白阳性细胞率在1月份最低，2月份明显升高（P < 0.05），3月份达到峰值（P < 0.05），4、5月份有所下降，随后在6～10月份呈小幅波动，11～12月份继续降低。这一统计结果表明：MCM7蛋白在生精细胞中表达的活跃程度存在季节性差异。同时，这一结果也从基因表达的角度提示：人工驯养树鼩睾丸中精原细胞和初级精母细胞的增殖在3月份时相对旺盛。
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图 1 不同月份人工驯养树鼩睾丸组织HE染色结果（×200）
A：1月；B：2月；C：3月；D：4月；E：5月；F：6月；G：7月；H：8月；I：9月；J：10月；K：11月；L：12月。
Figure 1. HE staining results in the testes of artificially domesticated tree shrew in different months（×200）
图 2 不同月份人工驯养树鼩睾丸组织MCM7蛋白表达结果（×200）
A：1月；B：2月；C：3月；D：4月；E：5月；F：6月；G：7月；H：8月；I：9月；J：10月；K：11月；L：12月。
Figure 2. The results of MCM7 protein expression in the testes of artificially domesticated tree shrew in different months（×200）
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