过量饮酒会促进酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD），如脂肪变性、脂肪性肝炎、纤维化到肝硬化，最终导致肝细胞癌，这是所有慢性肝病的主要死亡原因 ^[1-2]。在ALD的发展进程中，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）扮演者重要的角色。HSCs是慢性肝损伤创面愈合相关纤维化过程的主要参与者之一^[3-4]。在健康器官中，它们是非实质细胞群的一部分，占据肝细胞和窦状内皮细胞之间的间隙 ^[5]。在组织损伤、炎症和伴随的可溶性介质（例如TGF-β）激活后，HSCs转分化为肌成纤维细胞样细胞，表现出增殖、收缩和成纤维特性，成为纤维化肝脏中纤维性胶原的主要来源 ^[4，6]。HSCs还参与邻近细胞的复杂交互，以促进肝纤维化进展。因此，阐明HSCs的分子调控机制对ALD的治疗具有重要的意义。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种由18～24个核苷酸的组成的非编码RNA，通常情况下，miRNA在细胞质RNA诱导沉默复合体中与靶mRNA的3'-UTR相互作用以抑制mRNA翻译和诱导降解它 ^[7-8]。具体来说，一些miRNA，如miR-122和miR-21已被证明在ALD的肝纤维化的发展中发挥作用，调节包括组织炎症、细胞凋亡和HSCs的激活等过程 ^[9-10]。此外，由于miRNA释放到血液中的疾病依赖性以及它们在血清中的相对稳定性，miRNA是检测ALD严重程度和致癌性的潜在非侵袭性生物标志物 ^[11]。近期，Zhang等 ^[12]通过生物信息学分析发现，miR-29c-3p在ALD模型小鼠肝脏的表达水平显著低于正常小鼠，且预测其为ALD治疗的潜在靶标。然而，目前还没有文献报道，miR-29c-3p对ALD中HSCs活化，增殖和凋亡的调控机制。

综上所述，本研究拟探讨miR-29c-3p在静息和活化HSCs中的表达差异，并且检测其对HSCs活化，增殖和凋亡的影响，此外，笔者还拟通过生物信息学方法预测miR-29c-3p的下游靶标，并验证miR-29c-3p是否通过该靶标参与HSCs生物学行为的调控。

1.   材料与方法

1.1   小鼠HSCs的原代培养和鉴定

从C57BL/6 J小鼠（24.0～26.0 g，8～10周龄）中分离HSCs。简而言之，C57BL/6 J小鼠原位灌注四乙酸和胶原酶获得全肝细胞悬液，用Percoll密度梯度离心法获得HSCs。将细胞调整到3×10⁶细胞/mL，接种在25 cm²的培养瓶中，其中含有包含10%胎牛血清的5mL DMEM完全培养基和1%青霉素/链霉素。采用TGF-β活化HSCs后，采用免疫荧光检测HSCs活化标志物ɑ-SMA的表达。简而言之，HSCs与一抗抗ɑ-SMA（1∶250）在4℃下孵育过夜，随后用二抗染色。在400倍放大的荧光显微镜下测量细胞ɑ-SMA荧光阳性表达的变化并收集图像。

1.2   细胞分组及转染

首先，为观察miR-29c-3p对HSCs的影响，将细胞分为NC组（未转染）、NCmimic组（转染miRNAmimic阴性对照）和miR-29c-3pmimic组（转染miR-29c-3pmimic）。为进一步观察miR-494-3p和IGF-1对HSCs的影响，将细胞分为NC组（未转染）、sh-NC组（转染sh-NC阴性对照）、sh-IGF-1组（转染sh-IGF-1）和sh-IGF-1+miR-29c-3pinhibitor组（同时转染sh-IGF-1和miR-29c-3pinhibitor）。miR-29c-3pmimic/inhibitor和sh-IGF-1，及它们对应的阴性对照购买于广州锐博生物技术有限公司。将HSCs接种于6孔板（5×10⁴ 细胞/mL），按照说明书使用Lipofectamine 2000试剂及分组信息，进行50 nM miR-29c-3p mimic/inhibitor/NCmimic/sh-IGF-1/ sh-NC的转染。转染48 h后，采用RT-qPCR和WB检测转染效率。

1.3   实时荧光定量聚合酶链反应（real-time quantitative polymerasechain reaction，RT-qPCR）

使用TRIzol Regent按照说明书提取HSCs的总RNA样本，然后用TurboDNase试剂盒去除DNA。用NanoDrop对提取的总RNA进行定量。用带用gDNA Eraser的PrimeScriptTM RT试剂盒逆转录将2 μg总RNA逆转录为cDNA。采用SYBR Green PCR Master Mix在Bio-Rad Real-Time PCR仪上进行qPCR检测miR-29c-3p的表达。采用U6作为内部参考。每个数据重复3次，用2-ΔΔCt法计算miR-29c-3p的相对表达水平。本研究使用的引物如下：miR-29c-3p sense：5’-GCTGACCGATTTCTCCTGGT-3’；miR-29c-3p antisense：5’-TCCCCCTACATCATAACCGA-3’；U6 sense：5’-CTAGATAATGGTGCTGATAGATGGA-3’；U6 antisense：5’-GGCACACCAGAAATCGAAGC-3’。

1.4   免疫印迹实验（western blot，WB）

使用RIPA裂解缓冲液从HSCs中提取总蛋白，使用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，将60 μg总蛋白质样本进行分离后，转移到硝化纤维素膜上。用5%脱脂牛奶进行阻断，在4℃下用小鼠单克隆抗ɑ-SMA（1∶1000），DDR2（1∶2000），FN1（1∶1000），ITGB1（1∶2000）和GFAP（1∶1000）孵育过夜。用TBST清洗膜，然后与适当的辣根过氧化物酶结合的二抗孵育。采用增强型化学发光试剂进行膜的显影，并使用Image Lab™软件捕获信号并定量条带灰度值。

1.5   双荧光素酶报告基因实验

采用Starbase数据库预测IGF-1和miR-29c-3p的3’ UTR结合序列。用PCR分别扩增野生型和突变型IGF-1与miR-29c-3p的3’ UTR结合序列，将片段装入pMIR-REPORT luciferase microRNA expression reporter vector。参照Lipofectamine 2000试剂盒说明书，将0.1 µg野生型和突变型的IGF-1荧光素酶报告载体分别共转染到带有miR-29c-3pmimic的HEK-293细胞中。转染48 h时后，收集细胞裂解液，根据制造商的说明书，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒测量各组的荧光素酶活性。

1.6   CCK-8实验

采用CCK-8试剂盒检测HSCs的细胞活力。简而言之，将5×10⁴细胞/mL的各组HSCs加入96孔板中孵育24 h。各组HSCs转染24、48和72 h后，分别在各孔加入CCK8溶液。2 h后，使用酶标仪测量450 nm处的吸光度。

1.7   克隆形成实验

各组HSCs（5×10²细胞/mL）接种到含有37℃预热培养基的6孔板中，置于37℃培养箱中培养。每2 d更换一次培养基，放置14 d。随后，各组HSCs用1∶3乙酸/甲醇固定30 min，用Giemsa染色20 min，肉眼计数细胞克隆数。

1.8   流式细胞术

采用Annexin V-FITC/PI试剂盒检测HSCs凋亡情况。取1×Annexin V结合液500 µL制备终浓度为1×10⁶细胞/mL的HSC悬液，加入6孔板上。在细胞悬液中加入5 µL Annexin V-FITC和5 µL丙二碘，室温暗培养15 min。流式细胞术检测细胞凋亡情况。坏死细胞位于左上区（AnnexinV-，PI+），晚期凋亡细胞位于右上区（AnnexinV+，PI+），活细胞位于左下区（AnnexinV-，PI-），早期凋亡细胞位于右上区（AnnexinV+，PI-）。

1.9   统计学处理

所有数据重复3次独立实验，数据以均数±标准差表示，并通过SPSS 22.0软件进行统计分析。根据数据组成，2组间比较使用student’s t检验，多组间比较采用单因素方差分析（两两比较采用LSD法），P < 0.05为有统计学意义。

2.   结果

2.1   HSCs的分离及miR-29c-3p表达差异

如图1A所示，ɑ-SMA阳性表达表明成功从小鼠中分离出HSCs。TGF-β处理细胞后，HSCs活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1和ITGB1表达水平明显增加，而GFAP的表达水平则反之（P < 0.01，图1B）。值得注意地，miR-29c-3p在激活的HSCs中呈现低表达（P < 0.01，图1C）。以上结果表明，HSCs被成功分离并激活，且miR-29c-3p在不同状态的HSCs中异常表达。

图  1  成功分离HSCs，并且miR-29c-3p在不同状态的HSCs中差异表达

A：采用IF检测HSCs标志物ɑ-SMA是否表达；B：TGF-β处理HSCs前后，WB检测活化相关蛋白（ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP）的表达；C：在静息及激活状态HSCs中，miR-29c-3p的表达差异。^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  1.  Successful isolation of HSCs and differential expression of miR-29c-3p in HSCs of different status.

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2.2   miR-29c-3p对HSCs活化，增殖和凋亡的影响

由于miR-29c-3p在HSCs中的异常状态，进一步探讨了miR-29c-3p对HSCs活化，增殖和凋亡的影响。首先，通过miRNAmimic外源性的调控了活化的HSCs中miR-29c-3p的表达。转染效率结果表明，miR-29c-3p mimic可以增加活化的HSCs中miR-29c-3p的表达水平（P < 0.001，图2A）。WB结果表明，过表达miR-29c-3p能够减低活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1和ITGB1表达水平，并增加GFAP的表达（P < 0.01，图2B）。相较于NCmimic组，miR-29c-3pmimic组中活化HSCs的增殖活力（P < 0.01，图2C）和克隆形成数（P < 0.01，图2D）均有降低，并且凋亡比例增加（P < 0.01，图2E）。以上结果表明，miR-29c-3p能够抑制HSCs的活化和增殖，并促进其凋亡。

图  2  miR-29c-3p抑制HSCs的活化和增殖，并促进其凋亡

A：采用RT-qPCR检测miR-29c-3p mimic的转染效率；B：通过WB检测miR-29c-3p对活化相关蛋白（ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP）表达的影响；C：CCK-8试剂盒检测不同组别中TGF-β激活的HSCs增殖活力；D：克隆形成实验检测miR-29c-3p对活化HSCs的克隆形成数的影响；E：流式细胞术检测活化HSCs的凋亡比例。^**P < 0.01，^***P < 0.001。

Figure  2.  miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis.

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2.3   miR-29c-3p下游靶标预测及验证

调控下游mRNA的表达是miRNA在生物学进程中的主要功能之一。因此，笔者通过Starbase数据库预测了miR-29c-3p的下游可能靶标。如图3A所示，IGF-1可能是miR-29c-3p的下游靶标，并且通过双荧光素酶报告基因检测发现，miR-29c-3p mimic能够抑制细胞内野生型IGF-1的荧光素酶活性（P < 0.01），但是对突变型IGF-1的荧光素酶活性无影响（P > 0.01）。进一步，通过WB检测了miR-29c-3p对活化HSCs中IGF-1表达的影响。结果显示，过表达miR-29c-3p可抑制IGF-1的表达（P < 0.01，图3B），低表达miR-29c-3p能促进活化HSCs中IGF-1表达（P < 0.01，图3B）。以上结果表明，在HSCs中，IGF-1是miR-29c-3p的下游靶标。

图  3  IGF-1是miR-29c-3p下游靶标mRNA

A：Starbase数据库预测得到的miR-29c-3p与IGF-1的潜在3’ UTR结合序列（上），并且突变IGF-1的3’ UTR结合序列后，双荧光素酶报告基因实验验证miR-29c-3p与IGF-1的靶向关系（下）；B：活化的HSCs中分别转染miR-29c-3p inhibitor和miR-29c-3p mimic，采用WB检测IGF-1的表达变化。^**P < 0.01。

Figure  3.  IGF-1 is a downstream target mRNA of miR-29c-3p.

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2.4   miR-29c-3p通过IGF1对HSCs活化，增殖和凋亡的影响

进一步探讨了miR-29c-3p是否是通过IGF1对HSCs活化，增殖和凋亡产生影响的。结果表明，活化的HSCs中转染miR-29c-3pinhibitor或sh-IGF-1能够降低miR-29c-3p或IGF-1的表达水平（P < 0.05，图4A、图4B）。回复实验表明，相较于sh-NC组，sh-IGF-1组中活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1和ITGB1表达水平降低，并且GFAP的表达增加（P < 0.05，图4C）；相较于sh-IGF-1组，sh-IGF-1+miR-29c-3pinhibitor组中活化相关蛋白ɑ-SMA，DDR2，FN1和ITGB1表达水平增加，并且GFAP的表达减少（P < 0.05，图4C）。此外，敲低IGF-1的表达能够降低活化HSCs的增殖活力（P < 0.01，图4D）和克隆形成数（P < 0.01，图4E），并且增加其凋亡水平（P < 0.001，图4F），但是在此基础上同时敲低miR-29c-3p的表达则会逆转这一过程。以上结果表明，IGF-1能够促进HSCs的活化和增殖，并抑制其凋亡，这一功能被miR-29c-3p靶向抑制。

图  4  miR-29c-3p通过IGF-1抑制HSCs的活化和增殖，并促进其凋亡

A： miR-29c-3p inhibior的转染效率；B：通过WB检测得到的sh-IGF-1的转染效率；C：不同组别HSCs中活化相关蛋白（ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP）表达的表达变化；D：CCK-8实验检测活化的HSCs增殖活力；E：克隆形成实验得到的不同组别中活化HSCs的克隆形成数；F：流式细胞术检测活化HSCs的凋亡比例。与sh-NC组比较，^aP < 0.05，^aaP < 0.01，^aaaP < 0.001；与sh-IGF-1组比较，^bP < 0.05，^bbP < 0.01，^bbbP < 0.001；^*P < 0.05，^***P < 0.001。

Figure  4.  miR-29c-3p inhibits the activation and proliferation of HSCs and promotes their apoptosis through IGF-1.

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3.   讨论

非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）及其晚期形式-非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）已成为一种代谢性流行病^[2]。此前的生物信息学分析表明，miR-29c-3p在ALD患者血液中的表达水平显著低于正常人群^[12]，但是其功能还没有在ALD中得到验证。在本研究中，笔者成功分离了小鼠中的HSCs，并且发现激活的HSCs中miR-29c-3p异常低表达。此外，笔者还发现，过表达miR-29c-3p能够抑制HSCs的激活和增殖，并促进其凋亡。值得注意地，miR-29c-3p的这一功能是通过靶向调控IGF-1的表达实现的。这些结果证实了Yao等^[12]的预测，并为miR-29c-3p作为ALD的治疗靶标提供了理论基础。

HSCs活化是ALD进程中肝纤维化的关键事件，也是肝脏细胞外基质的主要来源之一，它们已被确定为主要负责肝脏纤维化发展的前体细胞类型 ^[13]。肝损伤后，HSC经历活化，导致典型的星形，脂肪储存表型的丧失和肌成纤维母细胞样表型的获得 ^[13-14]。因此，为了缓解ALD的发展进程，如何抑制HSCs的活化成为了主要目标之一。研究表明，ɑ-SMA，DDR2，FN1，ITGB1和GFAP已成为研究做多的HSCs活化标志物 ^[15-16]。在笔者的研究中发现miR-29c-3pmimic可以抑制ɑ-SMA，DDR2，FN1和ITGB1，并促进HSCs中GFAP的表达。这表明，过表达miR-29c-3p可以抑制HSCs的活化，这对缓解ALD的肝纤维化至关重要。此外，介导HSCs增殖和凋亡对明晰ALD的机制也是十分重要的。例如，Liang等^[17]表明，嘌呤信号通路调节HSCs激活和增殖，这在ALD中起着关键作用。研究表明，miRNA-150-5p抑制HSCs增殖，并在肝纤维化期间使HSCs凋亡敏感，这有利于缓解ALD的肝纤维化进程 ^[18]。本研究表明：miR-29c-3p的过表达对HSCs的增殖是有抑制作用的，并且促进HSCs的凋亡。此外，Chen等 ^[19]表明，miR-29c-3p通过激活ADH6增强子促进酒精脱氢酶（alcohol dehydrogenase，ADHs）基因簇表达，而ADHs在酒精代谢和酒精毒性中起着至关重要的作用，这或许是miR-29c-3p调控HSCs参与ALD的机制之一。

众所周知，miRNAs通过介导下游靶标mRNA的表达是参与调控多种生物学进程的主要途径之一^[20-21]。在本研究中，通过Starbase数据库预测发现IGF-1是miR-29c-3p的下游靶标之一，并通过双荧光素酶报告基因实验进行了验证。IGF-1是一种70-氨基酸合成代谢激素，具有多种内分泌，旁分泌和自分泌作用^[22]。胰岛素样生长因子-1（Insulin-like growth factor-1, IGF-1）和 IGF 结合蛋白（IGF-binding proteins, IGFBPs）在包括肝脏在内的多种组织中产生，主要是对生长激素（growth hormone, GH）信号的反应。肝脏合成的 IGF-1 和 IGFBPs 占全身循环 IGF-1 和 IGFBPs 的大部分^[23]。众所周知，IGF-1主要由肝脏产生（占循环IGF-1的75%），但几乎每个组织都能够分泌IGF-1用于自分泌/旁分泌的目的^[22-23]。此前的研究表明，IGF-1是非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）/非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）治疗的生物学靶标，IGF-I可以调控细胞衰老和激活，从而介导NASH中的肝纤维化^[24-26]。IGF-I治疗已被证明可以改善NASH和肝硬化的动物模型^[27-28]，表明IGF-I在这些条件下的潜在临床应用。在ALD中，有研究表明，S-烯丙基巯半胱氨酸通过直接调节IGF-I信号通路来改善ALD^[29]。Mølle等^[30]表明，IGF-I是ALD患者的生存独立预测因子。本研究中，HSCs中转染sh-IGF-1能够降低细胞活化和增殖，并上调其凋亡比例。但是，这一过程受miR-29c-3p的调控。

综上所述，笔者证明了miR-29c-3p能够通过靶向下调IGF-1的表达水平，进而抑制HSCs活化和增殖，并促进其凋亡。本研究为AH提供了新的治疗策略。但是，本研究仅仅只在HSCs验证了miR-29c-3p的功能，体内实验验证miR-29c-3p在ALD中的功能仍需进一步的挖掘。