甲基苯丙胺（ methamphetamine，MA） ，属于苯丙胺类兴奋剂，可进入血脑屏障导致大脑的结构和功能的改变^[1]，其滥用诱发大脑多个脑区发生不同程度的神经损伤，从而诱导中枢神经系统神经毒性的产生^[2]。研究发现^[3]MA依赖引起的神经毒性损伤海马脑区损伤有重要联系。MA诱导海马神经毒性的产生与单胺类神经递质释放增加^[4-5]、ROS和NOS的产生、大脑免疫细胞的激活、凋亡与自噬^[6]和神经炎症^[7]等有关。Toll样受体（Toll like receptors，TLR），能够调控免疫及炎症反应^[8]，主要在小胶质细胞中表达^[9]。TLR4细胞内信号通路分为髓样分化因子88 （myeloid differentiation factor 88，MyD88）依赖性和β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β，TRIF）依赖性通路。在MyD88依赖途径中当外界因素触发后，细胞表面的刺激信号通过TLR4-MyD88-TRAF6-IκB-PIκB-NF-κB分子传递到细胞核，从而调节相关炎症因子的转录^[10]。颅脑外伤可以诱导神经元凋亡和神经炎症，从而导致严重的神经元损害和行为障碍^[11]，其中TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活是造成中枢神经系统损伤的关键原因。在体外实验中脂多糖损伤的 BV2 小胶质细胞和神经炎症损伤的原代皮层神经元中采用TLR4 抑制剂 TAK-242所产生的抗神经炎症作用主要是与 TLR4 介导的 MyD88/NF-κB 信号通路的调节有关^[12]。Li B等^[13]的体外实验表明阻断 TLR4 介导的信号转导，TLR4/MyD88/NF-κB 和 MAPK 通路的激活便会受到影响，从而抑制 BV-2 小胶质细胞中脂多糖刺激所产生神经炎症。TLR4/MyD88/NF-κB作为一条经典的炎性通路，在MA诱导的海马神经炎症中具有较大的研究价值。本研究旨在探究研究TLR4/MyD88/NF-κB信号通路对甲基苯丙胺CPP大鼠海马的影响，同时采用特异性抑制剂TAK-242抑制TLR4，在改善MA依赖海马神经炎症中的作用，为药物干预甲基苯丙胺依赖提供新的科学证据。

1.   材料与方法

1.1   材料

实验动物：健康雄性SD大鼠40只，选择体重在180～200 g，购于昆明医科大学实验动物学中心[动物使用许可证编号：SCXK（滇）K2015-002]。

药品试剂：实验所用甲基苯丙胺，由云南省公安厅禁毒技术公安部重点实验室合法提供，纯度在98%以上。Bestar^TMqPCR RT Kit、荧光定量试剂盒（DBI Bioscience）；引物合成（擎科生物科技有限公司）；TLR4 受体抑制剂（TAK-242，A3850，Apexbio公司MyD88抗体（ab2064，Abcam公司）；TRAF6抗体（66494，Proteintech公司）；IκB-α 抗体（9242，CST公司）；p-IκB-α抗体（2859，CST公司）；NF-κB p65抗体（8142s，CST公司）；p-NF-κB p65抗体（sc-136548，Santa Cruz Biotechnology公司）；TLR4抗体（sc-293072，Santa Cruz Biotechnology公司）；β-actin抗体（ab6276，购自美国Abcam公司）。

主要仪器：大鼠 CPP 实验箱（XR-XT401，上海欣软信息有限公司）；酶标仪（Touch 2，美国BioTek公司）；普通PCR仪、荧光定量 PCR 仪（T100TM Thermal Cycler、C1000 Touch TM Thermal Cycler，美国Bio-Rad 公司）；垂直电泳仪、半干转膜仪（552BR、221BR，美国Bio-Rad 公司）。

1.2   实验方法

1.2.1   实验动物分组及给药

健康雄性SD大鼠40只，随机分配为4组，包括生理盐水组：腹腔注射（生理盐水（10 mg/kg，qd，14 d）；MA 实验组：给药 MA（10 mg/kg，ip，qd，14 d），大鼠形成MA依赖，CPP模型建模成功；TAK-242 组：给药 TAK-242（3 mg/kg，ip，qd，14 d）；MA + TAK-242 组：给药 TAK-242（3 mg/kg，ip，qd，14 d）后 1 h给予 MA（10 mg/kg，ip，qd，14 d）。

1.2.2   条件性位置偏爱模型（CPP）

连续3 d将随机分组的大鼠放入实验检测的黑白箱中以适应检测环境，第4天检测每只大鼠的天然偏好时间；连续14 d对大鼠以10 mg/kg的MA进行腹腔注射给药，使得大鼠产生依赖，再进行CPP检测。

1.2.3   Western

Blot实验 用 10%的水合氯醛 ，按0.3 m L/100 g麻醉后迅速水合氯醛麻醉大鼠 ， 用0.9%的氯化钠注射液对大鼠心脏灌注，将脑血管中的血液冲洗干净断头，取出全脑，分离大鼠海马组织解剖大鼠，取大鼠海马组织，匀浆，测定蛋白浓度。配制10%和12%的分离胶；上样、电泳，转膜、孵育一抗（β-actinantibody Anti-TLR4、Anti-Myd88、Anti-TRAF6、Anti-IκB-α、Anti-pIκB-α、Anti-NF-κBp65、Anti-P- NF-κBp65均按照1∶1000配制），放入4 ℃过夜，1xTBST 漂洗3次，温室孵育二抗（2 h），再次漂洗，采用ECL显影。 Image Pro Plus 图像分析软件分析目的条带与对应内参（β-actin）条带二者平均光密度比值，最后进行统计学分析。

1.2.4   荧光定量PCR实验

取海马组织80 mg，放入 EP 管中，匀浆，用酶标仪测定RNA浓度；按照说明书逆转录合成cDNA；荧光实时定量PCR仪，经94 ℃ 5 min预变性、94 ℃变性、58 ℃退火、72 ℃延伸，此循环进行40次，采用2^－ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，荧光定量PCR引物序列见表1。

表  1  荧光定量PCR引物序列

Table  1.  Fluorescence quantitative PCR primer sequence

基因名称	引物序列信息	温度
TLR4	上游引物：5'-TGCCTGAGACCAGGAAGCTTG 3' 下游引物：5'-CTTAAGATCTTCAGGGGGTTG3'	54 ℃
Myd88	上游引物：5'-TGAGAAAAGGTGTCGTCGCA3' 下游引物：5'-GGGTCCAGAACCAGGACTTG'	54 ℃
TRAF6	上游引物：5'-GCCCATGCCGTATGAAGAGA 3' 下游引物：5'-CGTGACAGCCAAACACACTG3'	54 ℃
NF-κB p65	上游引物：5'-GAGACCTGGAGCAAGCCATT3' 下游引物：5'-AGTTCCGGTTTACTCGGCAG3'	54 ℃
IKB-α	上游引物：5'-GAATCCTGACCTGGTCTCGC' 下游引物：5'-CACAGTCATCGTAGGGCAACT3'	55 ℃
β-actin	上游引物：5'-AGACAGCCGCATCTTGT-3' 下游引物：5'-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3'	55 ℃

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1.3   统计学处理

采用 SPSS 19.0进行数据分析，数值代表均数±标准差（$\bar x \pm s $）表示，用于统计分析的Prism软件5.0作图（GraphPad software），组内给药前后比较采用配对 t 检验；组间多组比较采用多因素方差分析（Multi-factor analysis of variance），多重比较方法采用 Tukey-HSD，P < 0.05 为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   甲基苯丙胺依赖CPP大鼠海马中TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、p-IκB-α、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表达

TLR4蛋白变化：图1A结果显示与生理盐水组相比，MA组TLR4蛋白表达升高（P < 0.01）；与MA组相比，MA+TAK-242组TLR4的蛋白表达下降（P < 0.01）。

图  1  大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路蛋白表达水平变化。

A：海马中TLR4的表达水平；B：海马中MyD884的表达水平；C：海马中TRAF6的表达水平；D：海马中p-IκB-α的表达水平；E：海马中IκB-α的表达水平；F：海马中p-NF-κBp65的表达水平；G：海马中NF-κBp65的表达水平。与对照组进行比较，^*P < 0.05，^**P < 0.01；与MA组比较，^#P < 0.05，^##P < 0.01 。

Figure  1.  The protein expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats

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MyD88蛋白变化：图1B结果显示与生理盐水组相比，MA组MyD88蛋白表达升高（P < 0.01）；与MA组相比，MA+TAK-242组MyD88蛋白表达下降（P < 0.01）。

TRAF6蛋白变化：图1C结果显示与生理盐水组相比，MA组TRAF6的蛋白表达升高（P < 0.01）；与MA组相比，MA+TAK-242组TRAF6的蛋白表达下降（P < 0.01）。

p-IκB-α蛋白变化：图1D结果显示与生理盐水组相比，MA组p-IκB-α蛋白表达升高p-IκB-α蛋白表达升高（P < 0.05），与MA组相比，MA+TAK-242组p-IκB-α蛋白表达下降（P < 0.01）。

IκB-α蛋白变化：图1E结果显示与生理盐水组相比，MA组IκB-α蛋白表达降低（P < 0.01）；与MA组相比，MA+TAK-242组IκB-α蛋白表达升高（P < 0.01）。

p-NF-κBp65蛋白变化：图1F结果显示与生理盐水组相比，MA组p-NF-κBp65蛋白表达升高（P < 0.05）；与MA组相比，MA+TAK-242组的p-NF-κBp65蛋白表达下降（P < 0.05）。

NF-κBp65蛋白变化：图1G结果显示与生理盐水组相比，MA组NF-κBp65蛋白表达升高（P < 0.01）；与MA组相比，MA+TAK-242组的NF-κBp65蛋白表达下降（P < 0.05）。

上述结果提示MA可通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路诱导MA依赖CPP大鼠海马发生神经炎症。

2.2   甲基苯丙胺依赖CPP大鼠海马中TLR4、MyD88、TRAF6、IκB-α、NF-κBp65mRNA表达

TLR4 mRNA表达变化见表2和图2A，结果显示与生理盐水组相比，MA组TLR4mRNA表达上升（P < 0.01）；与MA组相比，MA+TAK-242组TLR4mRNA表达下降（P < 0.01）。

表  2  大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路的mRNA表达（n = 6，$\bar x \pm s $）

Table  2.  The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus of rats （n = 6，$\bar x \pm s $）

因子	组别
	生理盐水组	Meth组	TAK-242组	Meth+TAK-242 组
TLR4	0.82 ± 0.10	1.16 ± 0.20 **	0.80 ± 0.22	0.83 ± 0.11 ##
MyD88	0.90 ± 0.08	1.17 ± 0.13 **	0.83 ± 0.15	0.86 ± 0.08 ##
TRAF6	0.98 ± 0.27	1.62 ± 0.47 **	0.84 ± 0.29	0.92 ± 0.25 ##
IκB-α	1.04 ± 0.17	0.69 ± 0.11 **	0.98 ± 0.14	1.00 ± 0.13 ##
NF-κBp65	0.88 ± 0.12	1.14 ± 0.10 ***	0.89 ± 0.06	0.92 ± 0.16 ###
与对照组进行比较，**P < 0.01，***P < 0.001；与MA组进行比较，##P < 0.05 ，###P < 0.001。

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图  2  大鼠海马中TLR4/MyD88/NF-κB 信号转导通路的mRNA表达 水平统计结果

A：海马中TLR4的mRNA表达水平；B：海马中MyD884的mRNA表达水平；C：海马中TRAF6的mRNA表达水平；D：海马中IκB-α的mRNA表达水平；E：海马中NF-κBp65的mRNA表达水平。与对照组进行比较，^**P < 0.01，^***P < 0.001；与MA组进行比较，^##P < 0.05 ， ^###P < 0.001。

Figure  2.  The mRNA expression of TLR4/MyD88/NF-κB signal transduction pathway in the hippocampus

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MyD88 mRNA表达变化：表2和图2B结果显示与生理盐水组相比，MA组MyD88mRNA表达上升（P < 0.01）；与M组相比，MA+TAK-242组MyD88mRNA表达下降（P < 0.01）。

TRAF6 mRNA表达变化：表2和图2C结果显示与生理盐水组相比，MA组TRAF6mRNA表达上升（P < 0.01），与MA组相比，MA+TAK-242组TRAF6mRNA表达下降（P < 0.01）。

IκB-α mRNA表达变化：表2和图2D结果显示与生理盐水组相比，MA组IκB-α mRNA表达下降（P < 0.01），与MA组相比，MA+TAK-242组IκB-α mRNA表达上升（P < 0.01）。

NF-κBp65 mRNA表达变化：表2和图2E结果显示与生理盐水组相比，MA组NF-κBp65 mRNA表达上升（P < 0.001），与MA组相比，MA+TAK-242组NF-κBp65 mRNA表达下降（P < 0.001）。

3.   讨论

已有研究表明，MA依赖诱导海马神经炎症，造成了神经系统的损害。炎性因子过渡累积就会对机体产生严重的危害，其中与损害最为严重的海马脑区为例。本研究发现MA依赖的CPP大鼠激活了海马脑区TLR4/MYD88/NF-κB信号通路，诱导了海马神经炎症的发生。

TLR4作为天然免疫识别受体，通过Myd88通路发挥作用^[14，15]。本研究表明：与对照组相比，MA组TLR4、MyD88、TRAF6蛋白和mRNA表达均增加。Xie等^[16]的研究发现，在MA中毒大鼠模型中，MA可使大鼠纹状体中 TLR4，MyD88，TRAF6 蛋白表达增加；Du等的研究在 MA中毒小鼠模型中， MA也可使中脑和纹状体中TLR4 蛋白表达增加^{[8, 17]}，上述结果均与与本研究结果一致，但是本研究对于海马脑区的检测不仅包含上述因子蛋白水平的变化，还在mRNA水平进一步验证了MA依赖可通过激活TLR4/MyD88信号通路，诱导海马神经炎症发生。Qing-Peng Hu等^[18]的研究表明，组蛋白乙酰化调节抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）可抑制TLR4/MYD88信号通路中TLR4的表达，从而抑制小胶质细胞激活和神经元凋亡，这就表明阻断TLR4对神经炎症诱导的脑损伤具有潜在的神经保护作用。本研究采用TLR4受体抑制剂TAK-242预处理，特异性地抑制了海马脑区TLR4的表达，减少了MyD88、TRAF6的蛋白及mRNA的表达。

研究发现多种分子机制可以介导炎症过程，其中最显著的机制是通过核因子NF-κB信号通路^[19]，磷酸化的NF-κB抑制因子（inhibitor of NF-κB，IκB），使IKB降解，进而激活NF-κB，其中p65是NF-κB的主要活性亚单位^[20]。本研究采用Western blot检测MA依赖CPP大鼠海马中p-IκB-α、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表达均增加，IκB-α的蛋白表达下降。Liu X等发现^[21]，苦碟子注射液（KDZ）可通过下调TLR4 依赖性 NF-κB信号通路，降低TRAF6、NF-κBp65和p-IκBα/IκBα的蛋白表达，保护大脑免受缺血性损伤。Long H等也发现^[22]，在大鼠Tourette综合征（TS）模型中，TS大鼠纹状体中IκB-α蛋白表达降低，p-IκB-α蛋白表达升高，结果均与本研究一致。不同的是本研究采用特异性TLR4拮抗剂TAK-242预处理后，p-IκB-α、NF-κBp65、p-NF-κBp65蛋白表达降低，IκB-α蛋白表达增加。此外，本研究发现IκB-αmRNA表达降低、NF-κBp65 mRNA表达增加，结果与蛋白水平一致。采用TLR4受体抑制剂（TAK-242）预处理，特异性地抑制了海马脑区TLR4的表达，减少了的NF-κB通路关键蛋白及mRNA的表达，从而减轻MA依赖大鼠海马脑区的神经炎症。

综上所述，TLR4/MyD88/NF-κB信号通路参与了MA依赖大鼠CPP效应的形成，该信号通路的激活可以诱导MA依赖大鼠海马神经炎症的发生。采用特异性的TLR4抑制剂可以改变TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关的因子的表达，减轻MA依赖的海马神经炎症。