A Clinical Scoring System Predicting the Osteosarcoma Chemotherapy Drug Resistance
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摘要:
目的 开发能预测骨肉瘤化疗耐药的评分系统，指导医生更好地选择合适的治疗方案。 方法 2014年1月至2017年12月在昆明医科大学第三附属医院119例经病理诊断为骨肉瘤并行新辅助化疗的患者纳入研究，收集其一般情况及血液指标、初诊表现、治疗模式、治疗疗效以及生存时间。 结果 （1）根据RECIST 1.1进行疗效评，119例患者78人评估为稳定（SD组），41评估为进（PD组）；且转移对化疗疗效无明显影响，P > 0.05；（2）两组间进行比较结果发现分期、初诊时间、原发灶大小、化疗周期、化疗药物种类、化疗前淋巴细胞/白细胞比值、化疗前中性粒细胞/淋巴细胞比值、化疗前白蛋白、化疗前谷草转氨酶、化疗前尿酸、化疗后尿素氮、化疗后尿酸、化疗前低密度脂蛋白，差异有统计学意义（P < 0.05），且根据ROC曲线最佳截断值得出：分期≥III期、化疗周期≤2周期、化疗药物种类≤3种、化疗前淋巴细胞/白细胞≤0.32、化疗前中性粒细胞/淋巴细胞≤1.98、化疗前白蛋白≥48 g/L、化疗后尿素氮≥4.22 mmol/L、化疗后尿酸≥305 umol/L、TGF-β总得分≥8.5分是骨肉瘤患者发生化疗耐药的危险因素;（3）患者具有一次危险因素记为1分，0～3分列为1组；4～6分列为2组；7～9分列为3组。将1组，2组，3组三个组疗效进行比较，差异有统计学意义，P < 0.05。 结论 分期、化疗周期、化疗药物数量、化疗前淋巴细胞/白细胞、化疗前中性粒细胞/淋巴细胞、化疗前白蛋白、化疗后尿素氮、化疗后尿酸、TGF-β总得分是骨肉瘤化疗耐药相关临床因素，本研究为尽早评估出化疗耐药的患者的同时评估可能发生化疗耐药的程度提供了充足的理论依据。 Abstract:Objective The purpose of this study was to develop a scoring system to predict chemotherapy resistance of osteosarcoma, which could guide doctors to better choose the appropriate treatment. Methods 119 cases of osteosarcoma with neoadjuvant chemotherapy were diagnosed by pathology at the Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University between January 2013 and December 2017 and the covariates including general situation, blood indexes, initial diagnosis, treatment mode, therapeutic effect and survival were analyzed. Results According to RECIST 1.1, 78 of 119 patients were evaluated as stable disease（SD group）and 41 as progressive disease（PD group）; There was signifcant difference in staging, initial visit time, initial tumor size, neoadjuvant chemotherapy cycle, types of chemotherapy drugs, lymphocyte/leukocyte prechemotherapy, neutrophils/lymphocytes prechemotherapy, albumin prechemotherapy, ALP prechemotherapy, Uric acid prechemotherapy, BUN after the chemotherapy, uric acid after the chemotherapy, LDL prechemotherapy, TGF-β score, TCNR between SD group and PD group（P < 0.05）. Metastasis had no significant effect on the efficacy of chemotherapy. According to the ROC curve, the best cut-off value showed staging≥III, neoadjuvant chemotherapy cycle≤3, Lymphocyte/leukocyte prechemotherapy≤0.32, neutrophils/lymphocytes ≤1.98, albumin prechemotherapy, ≥48 g/L, BUN after the chemotherapy≥4.22 mmol/L, uric acid after the chemotherapy≥305 umol/L. TGF-β score≥8.5 was the risk factor for chemotherapy resistance in patients with osteosarcoma.3. Patients with one risk factors add 1, and 0-3 were classified as group 1. 4-6 were listed as group 2; 7-9 were listed as group 3 and there was no statistically significant difference between the three groups. Conclusion This study explored the clinical factors related to chemotherapy resistance of osteosarcoma. -
Key words:
- Osteosarcoma /
- Chemotherapy /
- Drug resistance /
- Scoring system
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骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤，其起源于中胚层组织是青少年最致命的癌症之一[1-2]，目前骨肉瘤患者通常采用多药新辅助化疗结合手术切除原发肿瘤肿块及后续辅助化疗，化疗的引入使局限性疾病患者的平均5 a生存率从20世纪70年代初的20%提高到目前的60%以上[3]。新辅助化疗一般在手术前8到10周进行，化疗不仅可早期防止微转移病灶，降低远处转移风险，并且有利于手术切除时获得阴性边缘，肿瘤切除后，对原发肿瘤坏死的评估可预测预后，通常认为较好的组织学坏死与较好的生存率相关[4]，目前化疗方案中用于治疗骨肉瘤的药物通常会导致肿瘤细胞死亡，但有些肿瘤会进行自身变异从而躲避死亡，这种化疗耐药的特性使此类患者化疗效果差，进展快。
肿瘤细胞的多药耐药（multidrugresistance，MDR）是指肿瘤细胞接触一种化疗药物并对其产生耐药后，同时对其他化学结构和作用机制不同的化疗药物亦产生耐药。很多文献也讨论了与骨肉瘤耐药相关的其他因素，如肝肾功能的改变能明显影响药物到达肿瘤细胞，另外如分期、病理类型、病理性骨折、肿瘤大小、发病部位等，但相关报道较少见，且尚没有统一定论。对于发病率较高的肿瘤目前已有许多关于大量患者的随机对照试验的报道，然而关于骨肉瘤的报道较少，且涉及的患者数量较少[5]。因此本研究将进一步分析骨肉瘤患者的治疗疗效及耐药相关因素，寻找更准确的，能早期评估骨肉瘤患者化疗疗效的生物指标，从而制定个体化诊疗方案、指导临床、评估预后，以期能进一步提高骨肉瘤患者的生活质量，延长生存期。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
2014年1月至2017年12月在昆明医科大学第三附属医院119例经病理诊断为骨肉瘤并行新辅助化疗的患者纳入研究。
1.2 方法
收集119例患者一般情况及血液指标、初诊表现、治疗模式、治疗疗效以及生存时间，本研究已经昆明医科大学第三附属医院伦理委员会批准。
本研究根据纳入排除标准纳入患者119人，入院前均未行任何治疗，经病理确诊骨肉瘤后，使用骨肉瘤常规化疗药物（阿霉素每平方体表面积60 mg 第1天、顺铂每平方体表面积120 mg 第1天、甲氨蝶呤每平方体表面积8 g 第1天、异环磷酰胺每平方体表面积2 g 第1～6天），根据患者个体差异行1～4周期新辅助化疗后，根据实体瘤的疗效评价标准（RECIST 1.1）进行疗效评价。资料收集包括：一般资料（性别、年龄、BMI、病理类型、初诊时间、临床分期）、KPS评分、临床表现（首发症状、原发部位、首诊是否转移，原发灶大小）、实验室指标（血常规、血生化、凝血指标等）、治疗模式（新辅助化疗次数、药物种类）、病理指标（TGF-β，肿瘤坏死率）、治疗疗效（CR，PR，SD，PD）。
1.3 统计学处理
统计图由GraphPad Prism 8.0绘制。统计分析由SPSS 22.0完成，生存曲线的生成采用Kaplan-Meier法。两组患者的特征比较采用分类变量卡方检验和连续变量独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 骨肉瘤患者化疗疗效评估
研究结果提示，119例患者0人达到CR-完全缓解、0人达到PR-部分缓解、78人（65.6%）评价为SD：稳定、41人（34.5%）评价为PD：进展，故入组患者根据RECIST评价标准分为SD组及PD组，PD组对化疗敏感性极差，即为化疗相对耐药组（图1）。
图 1 骨肉瘤患者化疗疗效评估Figure 1. Evaluation of chemotherapy efficacy in patients with osteosarcoma2.2 转移对化疗疗效的影响
本研究共纳入119例患者，其中转移患者42人，未转移患者77人，为探究患者是否转移对疗效是否有影响，研究将是否转移与化疗疗效行卡方检验分析，结果提示是否转移对化疗疗效无明显影响，P > 0.05（表1）。
表 1 转移对化疗疗效的影响（n）Table 1. Effect of metastasis on chemotherapy efficacy （n）指标 SD PD P 转移 23 19 未转移 55 22 0.74 2.3 两组间一般资料评估
两组患者临床资料特点见表1。根据GTM外科分级系统，本研究中有II期患者87人（73.1%），III期患者24人（20.2%），P = 0.003，两组间差异有统计学意义。本研究中骨肉瘤患者中位初诊时间为56 d（范围为14～150 d），比较两组间初诊时间结果提示差异有统计学意义P = 0.016。本研究将患者初诊时原发灶大小纳入分析，结果提示两组间差异有统计学意义P = 0.001。结果还提示两组间化疗周期（P = 0.021）、化疗药物种类（P = 0.002），差异有统计学意义（表2）。
表 2 各一般指标在两组间的表达差异n（%）Table 2. The expression difference of general indexes between the two groups n（%）指标 SD（n = 78） PD（n = 41） χ2 P 性别 0.759 0.149 男 53（67.9） 31（75.6） 女 25（32.1） 10（24.4） 年龄（岁） 5.375 0.510 < 10 4（5.2） 1（2.4） 10～20 42（53.8） 31（75.6） > 20 32（41） 9（2.4） 分期 15.160 0.003* IIA 15（19.2） 17（41.5） IIB 39（50） 16（39） IIIA 4（5.1） 11（26.8） IIIB 2（2.6） 7（17.1） KPS评分 0.248 0.640 < 90 53（67.9） 26（63.4） ≥90 25（32.1） 15（36.6） 病理类型 1.234 0.779 成骨型 59（75.6） 33（80.5） 成软骨型 5（6.4） 3（7.3） 纤维母细胞型 3（3.8） 2（4.9） 其他 11（14.2） 3（7.3） 初诊时间（d） 5.183 0.016* < 30 69（88.5） 29（70.7） ≥30 9（11.5） 12（29.3） BMI 2.421 0.056 < 24 59（75.6） 29（70.7） ≥24 19（24.4） 12（29.3） 原发灶大小，cm 12.26 0.001* < 5 29（37.2） 16（39） 5～10 38（48.7） 9（22） > 10 11（14.1） 16（39） 位置 0.144 0.707 左 39（50） 22（53.7） 右 39（50） 19（46.3） 靶向治疗 0.104 0.453 是 8（10.3） 5（12.2） 否 70（89.7） 36（87.8） 手术方式 1.063 0.263 截肢 36（46.2） 23（56.1） 瘤段切除 42（53.8） 18（43.9） 新辅助化疗周期 5.914 0.021* 1 23（29.5） 21（51.2） 2 32（41） 11（26.8） 3 18（23.1） 6（14.6） 4 5（6.4） 3（7.3） 化疗药物数量 8.822 0.002* 1 0 2（4.9） 2 23（29.5） 18（43.9） 3 15（19.2） 7（17） 4 21（26.9） 5（12.2） 5 19（24.4） 9（22） 化疗后肝肾功能损伤 0.416 0.523 是 41（52.6） 19（46.3） 否 37（47.4） 22（53.7） 化疗后骨髓抑制 3.343 0.067 是 55（70.5） 22（53.7） 否 23（29.5） 19（46.3） *P < 0.05。 2.4 两组间临床资料评估
将两组患者初诊为骨肉瘤及新辅助化疗后的血液学指标、化疗后发生副反应等相关指标进行独立样本t检验（表2），结果显示SD组与PD组两组间化疗前白细胞/淋巴细胞比值（P = 0.015）、化疗前中性粒细胞/淋巴细胞比值（P = 0.035）、化疗前白蛋白（P = 0.007）、化疗前谷草转氨酶（P = 0.037）、化疗前尿酸（P = 0.038）、化疗后尿素氮（P = 0.012）、化疗后尿酸（P = 0.032）、化疗前低密度脂蛋白（P = 0.043）、肿瘤坏死率（P = 0.036）、TGF-β表达（P = 0.033）差异有统计学意义（表3）。
表 3 各临床指标在两组间的表达差异（$\bar x\pm s $ /n（%））Table 3. The expression of each clinical indicator was different between the two groups（$\bar x \pm s $ /n（%））指标 SD（n = 78） PD（n = 41） χ2 P 化疗前血常规 白细胞（×109） 7.25 ± 2.44 6.88 ± 7.22 1.432 0.396 淋巴细胞（×109） 2.24 ± 1.55 2.44 ± 3.67 1.543 0.435 单核细胞（×109） 0.41 ± 0.30 0.41 ± 0.16 0.764 0.927 中性粒细胞（×109） 4.45（1.23，8.54） 4.21（1.06，5.63） 0.754 0.240 血小板（×109） 302（123，423） 301（106，467） 0.912 0.973 血红蛋白（g/L） 144.57（59.32，187.34） 145.05（67.43，194.32） 1.533 0.437 淋巴细胞/白细胞比值（LWR） 0.36（0.12，1.15） 0.32（0.13，1.65） 2.214 0.015* 中性粒细胞/淋巴细胞比值（NLR） 2.36 ± 1.24 1.80 ± 1.77 2.765 0.035* 淋巴细胞/单核细胞比值（LMR 7.13（3.42，9.23） 6.53（3.52，8.86） 1.095 0.462 血小板/淋巴细胞比值（PLR） 143.77 ± 190.01 138.24 ± 165.48 1.043 0.195 化疗后血常规 白细胞（×109） 4.03 ± 3.26 3.8 ± 2.12 1.432 0.711 淋巴细胞（×109） 1.32（0.98，1.65） 1.37（0.79，1.43） 1.654 0.425 单核细胞（×109） 0.49（0.12，0.97） 0.86（0.64，1.05） 1.123 0.267 中性粒细胞（×109） 1.99（0.75，2.45） 2.04（1.43，4.21） 1.186 0.234 血小板（×109） 266.04（201.43，296.34） 235.02（198.43，302.43） 2.412 0.146 淋巴细胞/白细胞比值（LWR） 0.46（0.34，1.87） 0.54（0.13，1.43） 1.154 0.678 中性粒细胞/淋巴细胞比值（NLR） 1.68（0.87.1，43） 1.75（0.98，2.12） 1.643 0.732 淋巴细胞/单核细胞比值（LMR） 11.16 ± 19.18 9.07 ± 19.10 0.543 0.545 血小板/淋巴细胞比值（PLR） 245.90 ± 169.48 211.48 ± 125.38 1.432 0.258 化疗前生化指标 白蛋白 45.49 ± 6.83 48.15 ± 8.12 1.123 0.007* 白球比值 1.62（1.43，2.54） 1.74（1.54，2.54） 3.234 0.876 谷丙转氨酶（ALT） 19.99（10.32，56.53） 21.98（12.32，54.76） 0.656 0.237 谷草转氨酶（AST） 19.31（9.43，33.43） 27.49（12.32，43.53） 1.654 0.037* 碱性磷酸酶（ALP） 337.91 ± 287.19 321.27 ± 230.94 1.212 0.775 乳酸脱氢酶（LDH） 225.26（165.23，298.32） 221.90（154.53，276.43） 0.543 0.573 肌酐 64.68（56，43，75.45） 64.95（46.23，87.54） 1.654 0.922 尿素氮 4.84（2.42，6.34） 4.89（2.54，5.43） 1.665 0.976 尿酸 344.38（154.34，452.34） 383.56（143.32，413.65） 1.098 0.038* 血钾（K） 4.41 ± 4.26 4.43 ± 4.23 0.543 0.776 血钠（NA） 140.32 ± 139.32 140.71 ± 139.42 2.665 0.449 血氯（CL） 102.01（98.65，103.32） 102.10（97.43，106.34） 1.767 0.879 血钙（CA） 2.21（1.21，3.43） 2.34（1.12，5.32） 2.713 0.176 血清铁 14.29 ± 16.61 15.29 ± 24.13 0.234 0.584 血清镁 0.88（0.45，1.23） 0.85（0.43，0.91） 5.432 0.485 血清磷 4.46 ± 2.12 5.51 ± 1.67 1.155 0.381 血糖 4.84（3.23，5.43） 4.94（3.35，5.32） 0.543 0.234 化疗后生化指标 白蛋白 38.52（26.54，41.42） 40.10（37.23，46.34） 0.547 0.259 白球比值 1.60（1.12，2.43） 1.58（1.23，2.53） 1.112 0.749 谷丙转氨酶（ALT） 90.40（50.34，123.32） 78.46（46.43，112.43） 1.765 0.745 谷草转氨酶（AST） 63.86（45.34，98.43） 66.85（42.34，78.43） 1.543 0.879 碱性磷酸酶（ALP） 224.92（210.32，298.43） 235.29（203.43，276.32） 1.756 0.855 乳酸脱氢酶（LDH） 229.04（201.23，245.34） 224.27（193.43，254.43） 1.121 0.824 尿素氮 3.44（2.43，4.32） 4.10（2.25，5.12） 1.766 0.012* 尿酸 280.30（210.43，302.43） 320.51（228.32，385.23） 1.554 0.032* 血钠（NA） 135.84 ± 160.18 131.91 ± 29.96 1.667 0.425 血糖 6.88（4.32，8.53） 8.47（5.34，9.23） 1.231 0.630 化疗前血脂 甘油三酯 1.28（0.98，1.54） 1.16（1.02，1.45） 1.554 0.824 总胆固醇 3.75 ± 0.90 4.31 ± 1.45 1.546 0.100 高密度脂蛋白 1.07 ± 0.25 1.14 ± 0.45 0.349 0.581 低密度脂蛋白 2.27 ± 0.64 2.76 ± 1.16 1.526 0.043* 病理指标 TGF-β评分 6 ± 5.94 7.6 ± 3.42 1.634 0.033* 肿瘤坏死率 0.35（0.21，0.45） 0.53（0.34，0.65） 1.985 0.036* *P < 0.05。 2.5 各指标对骨肉瘤化疗耐药的诊断效能
本研究将两组患者初诊为骨肉瘤及新辅助化疗后的一般资料、血液学指标、化疗后发生副反应等相关指标进行独立样本t检验，结果显示两组间分期（P = 0.003）、初诊时间（P = 0.016）、原发灶大小（P = 0.001）、新辅助化疗周期（P = 0.021）、新辅助化疗药物种类（P = 0.002）、化疗后是否发生骨髓抑制（P = 0.033）、化疗前淋巴细胞/白细胞比值（P = 0.015）、化疗前中性粒细胞/淋巴细胞比值（P = 0.035）、化疗前白蛋白（P = 0.007）、化疗前谷草转氨酶（P = 0.037）、化疗前尿酸（P = 0.038）、化疗后尿素氮（P = 0.012）、化疗后尿酸（P = 0.032）、化疗前低密度脂蛋白（P = 0.043）、TGF-β表达总评分（P = 0.033）、肿瘤坏死率（P = 0.017）差异有统计学意义，均P < 0.05，利用上述定量指标的数值用于判断骨肉瘤患者是否发生化疗耐药，绘制ROC曲线，ROC又称受试者工作特征曲线，是用来检验某一诊断方法的敏感性和特异性的方法。AUC（曲线下面积）的值就是处于ROC curve下方的那部分面积的大小。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间，在AUC > 0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好；AUC在 0.5～0.7时有较低准确性；AUC在0.7～0.9时有一定准确性；AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC = 0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。约登指数是（敏感度＋特异度−1）最大的数值点，该点位置相应的AUC面积最大，且在此临界值下，诊断骨肉瘤化疗耐药的敏感度和特异度最大，可作为预测骨肉瘤化疗耐药发生的最佳截断值。
结果发现、化疗前尿酸、初诊时间、化疗前LDL、肿瘤坏死率均P > 0.05，对诊断骨肉瘤化疗耐药无诊断价值。骨肉瘤分期、化疗周期、化疗药物种类、化疗前白细胞/淋巴细胞、化疗前中性粒细胞/淋巴细胞、化疗前白蛋白、化疗后尿素氮、化疗后尿酸、TGF-β总得分对骨肉瘤化疗耐药具有较低准确性，肿瘤分期对骨肉瘤化疗耐药有一定准确性分期，且分期≥III期、化疗周期≤2周期、化疗药物种类≤3种、化疗前淋巴细胞/白细胞≤0.32、化疗前中性粒细胞/淋巴细胞≤1.98、化疗前白蛋白≥48 g/L、化疗后尿素氮≥4.22 mmol/L、化疗后尿酸≥305 μmol/L、TGF-β总得分≥8.5分是骨肉瘤患者发生化疗耐药的危险因素（图2）。
图 2 各指标对骨肉瘤化疗耐药的诊断效能Figure 2. The diagnostic efficacy of various indexes for chemotherapy resistance of osteosarcoma2.6 评分系统
根据ROC曲线分析，具有上述危险因素者计为1分，9项危险因素得分为0～9分（表2），将119例患者进行上述评分后分为3组：0～3分列为1组；4～6分列为2组；7～9分列为3组。将1组，2组，3组三组疗效评价进行统计学分析，结果提示差异有统计学意义（P < 0.05）（图3、表4）。
图 3 三组疗效评价比较Figure 3. Comparison of efficacy evaluation of Group 1，Group 2 and Group 3与2组比较，*P < 0.05；与3组比较，**P < 0.01；与1组比较，****P < 0.0001。表 4 评分系统Table 4. Scoring system分类 得分 分期 ≥III期 1 < III期 0 化疗周期 ≤2周期 1 > 2周期 0 化疗药物种类 ≤3种 1 > 3种 0 化疗前淋巴细胞/白细胞 ≤0.32 1 > 0.32 0 化疗前中性粒细胞/淋巴细胞 ≤1.98 1 > 1.98 0 化疗前白蛋白 ≥48 g/L 1 < 48 g/L 0 化疗后尿素氮 ≥4.22 mmol/L 1 < 4.22 mmol/L 0 化疗后尿酸 ≥305 μmol/L 1 < 305 μmol/L 0 TGF-β总得分 ≥8.分 1 < 8.5分 0 3. 讨论
骨肉瘤是青少年最常见的骨恶性肿瘤，因其快进展、易转移、常化疗耐药的特点，骨肉瘤预后往往较差，作为骨肉瘤主要的治疗手段，骨肉瘤患者一旦发生耐药，往往意味着治疗的失败[6]，本研究中探究了术前行新辅助化疗的患者以及术前未行新辅助化疗的患者的生存差异，结果表明术前行新辅助化疗的患者总生存期（OS）及无进展生存期（PFS）明显高于术前未行新辅助化疗的病人，均P < 0.05，差异有统计学意义。骨肉瘤常规的新辅助化疗方案是基于高细胞毒性药物如顺铂、甲氨蝶呤和阿霉素等的联合使用[7]，Guenther等[8]在一项44例骨肉瘤研究中发现无患者化疗疗效达到CR和PR，本研究对化疗后119例患者根据实体瘤的疗效评价标准（RECIST 1.1）进行疗效评价结果提示，119例患者0人达到CR-完全缓解、0人达到PR-部分缓解、78人（65.6%）评价为SD-稳定、41人（34.5%）评价为PD-进展，本研究进一步探究了SD组与PD组患者一般资料及临床资料的差异。
初诊时间是患者从出现症状至到医院就诊的时间，通常认为初诊时间可作为患者病情轻重缓急的评估标准，本研究纳入119例患者初诊时间，其中最短为14 d，最长为150 d，平均初诊时间为67 d，化疗耐药组初诊时间明显低于对照组，骨肉瘤化疗耐药组行生存分析分析发现，初诊时间为生存预后不良因素，上述均P < 0.05，差异有统计学意义。除了初诊时间不同，骨肉瘤患者初诊时症状也各不一，由于骨肉瘤早期临床表现不典型，故就诊时，大多数患者已病情进展或转移，而这也与本研究结果一致，本研究纳入骨肉瘤初诊患者119人，除去因资料缺失未能分组者8例，其余I期患者0人，II期患者87人（73.1%），III期患者24例（20.2%），将两组间分期差异进行统计学比较，结果提示化疗耐药组分期明显高于对照组，P < 0.05，差异有统计学意义。表明分期越晚的患者对化疗敏感性越差，将本研究化疗耐药的患者分期绘制ROC曲线，结果提示分期≥III期是骨肉瘤患者发生化疗耐药的危险因素。因此针对晚期就诊患者应制定个体化治疗方案，例如在常规化疗基础上增加化疗剂量或者改变化疗药物，以达到预期化疗效果。骨肉瘤生长迅速，就诊时病灶通常较大[9]，本研究纳入的119例骨肉瘤患者中，就诊时原发灶最大直径 < 5 cm者有45人（37.8%），> 10 cm者有27人（22.7%），将对照组及化疗耐药组进行原发灶直径差异分析，结果提示化疗耐药组原发灶直径明显大于对照组，且原发灶直径越大，患者OS及PFS越短，为骨肉瘤化疗耐药者的预后不良因素，上述均P < 0.05，差异有统计学意义。骨肉瘤患者化疗多采用多种药物的联合化疗方式，本研究纳入119例初诊行新辅助化疗的患者，结合患者对化疗药物的反应性以及生存时间，结果提示化疗周期≤2周期、化疗药物种类≤3种是骨肉瘤患者发生化疗耐药的危险因素，因此，结合患者个体差异制定个体化化疗方案，选择合适的化疗药物，施行适宜的化疗次数可在最小化疗反应范围内给予患者最大的化疗疗效。
随着对肿瘤发生机制的不断深入研究，免疫应答被证实在肿瘤进展中起关键作用[10]。有研究提示中性粒细胞、血小板计数高、淋巴细胞低被认为与实体瘤的不良预后[11]。作为比较容易获得的生物标记物，淋巴细胞和白细胞比值（LWR）、中性粒细胞与淋巴细胞的比率（NLR）、血小板与淋巴细胞的比率（PLR）和淋巴细胞与单核细胞的比率（LMR）被越来越多的用于预后恶性肿瘤的生存和评估诊疗效果[12-13]。Abex等人[14]在一项直结肠癌研究中发现低LMR是直结肠癌OS的独立危险因素。而这些指标在骨肉瘤中的研究相对较少，本研究收集了119例入组患者的上述指标，将化疗前后的LWR、NLR、LMR、PLR纳入骨肉瘤生存分期和化疗疗效评价中，结果提示化疗耐药组LWR、NLR明显低于对照组，P < 0.05，差异有统计学意义，同时将骨肉瘤患者LWR、NLR值绘制ROC曲线结果提示化疗前淋巴细胞/白细胞（LWR）≤0.32、中性粒细胞/淋巴细胞（NLR）≤1.98是骨肉瘤患者发生化疗耐药的危险因素。上述指标反映了患者机体炎症情况，因此监测上述指标的动态变化对于提高患者治疗效果以及延长预后可能有一定的帮助[15]。
肝脏是药物代谢的主要场所，肝脏病理对药物处置的影响可以理解为一个复杂的药物-基因-环境相互作用[16-17]，本研究比较对照组与化疗耐药组肝功能指标结果提示两组间化疗前白蛋白、化疗前谷草转氨酶差异有统计学意义，P < 0.05，耐药组化疗前白蛋白明显高于对照组，且ROC曲线提示化疗前白蛋白≥48g/L是骨肉瘤患者发生化疗耐药的危险因素。白蛋白是评估机体状况的重要营养指标，癌细胞中存在内置防御机制，一些特定的蛋白泵可以将化疗药“泵出”细胞，从而确保癌细胞的持续存活。其实这些蛋白泵在机体中普遍存在，白蛋白越高的患者，蛋白泵也越多[18]，拟行化疗的患者，维持供给机体营养支持的白蛋白的稳定固然重要，但是白蛋白过多，则会导致体内蛋白泵增多，反而降低化疗效果，引起化疗耐药。除此之外，谷草转氨酶广泛的存在于身体多个组织器官的细胞尤其是肝脏当中，当肝脏功能受损伤时，坏死的肝细胞裂解释放谷草转氨酶，血液检测中的谷草转氨酶随之升高，其升高程度通常与肝脏受损伤程度成正比，这与本研究结果一致，本研究发现，化疗耐药组化疗前谷草转氨酶较对照组明显升高，P < 0.05，差异有统计学意义[19]。
在肾功能损伤中，正常情况下被肾排出的代谢物可能被保留，继续重复给药更有可能累积产生更大的问题[20]。而化疗是造成恶性肿瘤患者肝肾功能损害的重要因素，本研究对对照组和化疗耐药组进行化疗前后肾功能的比较，结果提示，化疗耐药组化疗前尿酸、化疗后尿素氮、化疗后尿酸较对照组明显升高，均P < 0.05，差异有统计学意义。化疗前尿酸升高往往提示肾功能欠佳，而肾功能欠佳则引起上述肾脏药物代谢障碍，从而导致化疗药物在机体内未能发挥最好的疗效，造成化疗耐药，而化疗又是造成肾功能损伤的常见原因，化疗后出现肾脏损伤的患者，其机体状况和肾脏耐受力通常比化疗后未出现肾脏损伤的患者较差，而化疗造成后肾脏损伤后不得已对化疗药物减量或者停止化疗，肿瘤细胞未能得到良好的控制因此更快的增值，瘤体负荷以及机体负担加重，造成以肾脏等为主多器官功能减退甚至衰竭，形成恶性循环。因此肾功能的评估在骨肉瘤化疗疗效中的作用至关重要，并且本次结果得出：对于化疗后尿素氮≥4.22 mmol/L、化疗后尿酸≥305 μmol/L的患者，尽管未达到肾功能损伤标准，但是结果证实这是骨肉瘤患者发生化疗耐药的危险因素，在处理肾功能异常的骨肉瘤患者时，应将肾功能及药物监测作为常规监测标准，及时预防或改善肾功能与化疗之间的恶性循环，争取在对肾功能损伤最小的情况下，使化疗药物发挥最大的疗效。
综上所述，本研究探究了骨肉瘤化疗耐药相关临床因素，为尽早评估出化疗耐药的患者的同时评估可能发生化疗耐药的程度提供了充足的理论依据。
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图 1 骨肉瘤患者化疗疗效评估
Figure 1. Evaluation of chemotherapy efficacy in patients with osteosarcoma
图 2 各指标对骨肉瘤化疗耐药的诊断效能
Figure 2. The diagnostic efficacy of various indexes for chemotherapy resistance of osteosarcoma
图 3 三组疗效评价比较
Figure 3. Comparison of efficacy evaluation of Group 1，Group 2 and Group 3
与2组比较，*P < 0.05；与3组比较，**P < 0.01；与1组比较，****P < 0.0001。
表 1 转移对化疗疗效的影响（n）
Table 1. Effect of metastasis on chemotherapy efficacy （n）
指标 SD PD P 转移 23 19 未转移 55 22 0.74 
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表 2 各一般指标在两组间的表达差异n（%）
Table 2. The expression difference of general indexes between the two groups n（%）
指标 SD（n = 78） PD（n = 41） χ2 P 性别 0.759 0.149 男 53（67.9） 31（75.6） 女 25（32.1） 10（24.4） 年龄（岁） 5.375 0.510 < 10 4（5.2） 1（2.4） 10～20 42（53.8） 31（75.6） > 20 32（41） 9（2.4） 分期 15.160 0.003* IIA 15（19.2） 17（41.5） IIB 39（50） 16（39） IIIA 4（5.1） 11（26.8） IIIB 2（2.6） 7（17.1） KPS评分 0.248 0.640 < 90 53（67.9） 26（63.4） ≥90 25（32.1） 15（36.6） 病理类型 1.234 0.779 成骨型 59（75.6） 33（80.5） 成软骨型 5（6.4） 3（7.3） 纤维母细胞型 3（3.8） 2（4.9） 其他 11（14.2） 3（7.3） 初诊时间（d） 5.183 0.016* < 30 69（88.5） 29（70.7） ≥30 9（11.5） 12（29.3） BMI 2.421 0.056 < 24 59（75.6） 29（70.7） ≥24 19（24.4） 12（29.3） 原发灶大小，cm 12.26 0.001* < 5 29（37.2） 16（39） 5～10 38（48.7） 9（22） > 10 11（14.1） 16（39） 位置 0.144 0.707 左 39（50） 22（53.7） 右 39（50） 19（46.3） 靶向治疗 0.104 0.453 是 8（10.3） 5（12.2） 否 70（89.7） 36（87.8） 手术方式 1.063 0.263 截肢 36（46.2） 23（56.1） 瘤段切除 42（53.8） 18（43.9） 新辅助化疗周期 5.914 0.021* 1 23（29.5） 21（51.2） 2 32（41） 11（26.8） 3 18（23.1） 6（14.6） 4 5（6.4） 3（7.3） 化疗药物数量 8.822 0.002* 1 0 2（4.9） 2 23（29.5） 18（43.9） 3 15（19.2） 7（17） 4 21（26.9） 5（12.2） 5 19（24.4） 9（22） 化疗后肝肾功能损伤 0.416 0.523 是 41（52.6） 19（46.3） 否 37（47.4） 22（53.7） 化疗后骨髓抑制 3.343 0.067 是 55（70.5） 22（53.7） 否 23（29.5） 19（46.3） *P < 0.05。
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表 3 各临床指标在两组间的表达差异（
$\bar x\pm s $ /n（%））Table 3. The expression of each clinical indicator was different between the two groups（
$\bar x \pm s $ /n（%））指标 SD（n = 78） PD（n = 41） χ2 P 化疗前血常规 白细胞（×109） 7.25 ± 2.44 6.88 ± 7.22 1.432 0.396 淋巴细胞（×109） 2.24 ± 1.55 2.44 ± 3.67 1.543 0.435 单核细胞（×109） 0.41 ± 0.30 0.41 ± 0.16 0.764 0.927 中性粒细胞（×109） 4.45（1.23，8.54） 4.21（1.06，5.63） 0.754 0.240 血小板（×109） 302（123，423） 301（106，467） 0.912 0.973 血红蛋白（g/L） 144.57（59.32，187.34） 145.05（67.43，194.32） 1.533 0.437 淋巴细胞/白细胞比值（LWR） 0.36（0.12，1.15） 0.32（0.13，1.65） 2.214 0.015* 中性粒细胞/淋巴细胞比值（NLR） 2.36 ± 1.24 1.80 ± 1.77 2.765 0.035* 淋巴细胞/单核细胞比值（LMR 7.13（3.42，9.23） 6.53（3.52，8.86） 1.095 0.462 血小板/淋巴细胞比值（PLR） 143.77 ± 190.01 138.24 ± 165.48 1.043 0.195 化疗后血常规 白细胞（×109） 4.03 ± 3.26 3.8 ± 2.12 1.432 0.711 淋巴细胞（×109） 1.32（0.98，1.65） 1.37（0.79，1.43） 1.654 0.425 单核细胞（×109） 0.49（0.12，0.97） 0.86（0.64，1.05） 1.123 0.267 中性粒细胞（×109） 1.99（0.75，2.45） 2.04（1.43，4.21） 1.186 0.234 血小板（×109） 266.04（201.43，296.34） 235.02（198.43，302.43） 2.412 0.146 淋巴细胞/白细胞比值（LWR） 0.46（0.34，1.87） 0.54（0.13，1.43） 1.154 0.678 中性粒细胞/淋巴细胞比值（NLR） 1.68（0.87.1，43） 1.75（0.98，2.12） 1.643 0.732 淋巴细胞/单核细胞比值（LMR） 11.16 ± 19.18 9.07 ± 19.10 0.543 0.545 血小板/淋巴细胞比值（PLR） 245.90 ± 169.48 211.48 ± 125.38 1.432 0.258 化疗前生化指标 白蛋白 45.49 ± 6.83 48.15 ± 8.12 1.123 0.007* 白球比值 1.62（1.43，2.54） 1.74（1.54，2.54） 3.234 0.876 谷丙转氨酶（ALT） 19.99（10.32，56.53） 21.98（12.32，54.76） 0.656 0.237 谷草转氨酶（AST） 19.31（9.43，33.43） 27.49（12.32，43.53） 1.654 0.037* 碱性磷酸酶（ALP） 337.91 ± 287.19 321.27 ± 230.94 1.212 0.775 乳酸脱氢酶（LDH） 225.26（165.23，298.32） 221.90（154.53，276.43） 0.543 0.573 肌酐 64.68（56，43，75.45） 64.95（46.23，87.54） 1.654 0.922 尿素氮 4.84（2.42，6.34） 4.89（2.54，5.43） 1.665 0.976 尿酸 344.38（154.34，452.34） 383.56（143.32，413.65） 1.098 0.038* 血钾（K） 4.41 ± 4.26 4.43 ± 4.23 0.543 0.776 血钠（NA） 140.32 ± 139.32 140.71 ± 139.42 2.665 0.449 血氯（CL） 102.01（98.65，103.32） 102.10（97.43，106.34） 1.767 0.879 血钙（CA） 2.21（1.21，3.43） 2.34（1.12，5.32） 2.713 0.176 血清铁 14.29 ± 16.61 15.29 ± 24.13 0.234 0.584 血清镁 0.88（0.45，1.23） 0.85（0.43，0.91） 5.432 0.485 血清磷 4.46 ± 2.12 5.51 ± 1.67 1.155 0.381 血糖 4.84（3.23，5.43） 4.94（3.35，5.32） 0.543 0.234 化疗后生化指标 白蛋白 38.52（26.54，41.42） 40.10（37.23，46.34） 0.547 0.259 白球比值 1.60（1.12，2.43） 1.58（1.23，2.53） 1.112 0.749 谷丙转氨酶（ALT） 90.40（50.34，123.32） 78.46（46.43，112.43） 1.765 0.745 谷草转氨酶（AST） 63.86（45.34，98.43） 66.85（42.34，78.43） 1.543 0.879 碱性磷酸酶（ALP） 224.92（210.32，298.43） 235.29（203.43，276.32） 1.756 0.855 乳酸脱氢酶（LDH） 229.04（201.23，245.34） 224.27（193.43，254.43） 1.121 0.824 尿素氮 3.44（2.43，4.32） 4.10（2.25，5.12） 1.766 0.012* 尿酸 280.30（210.43，302.43） 320.51（228.32，385.23） 1.554 0.032* 血钠（NA） 135.84 ± 160.18 131.91 ± 29.96 1.667 0.425 血糖 6.88（4.32，8.53） 8.47（5.34，9.23） 1.231 0.630 化疗前血脂 甘油三酯 1.28（0.98，1.54） 1.16（1.02，1.45） 1.554 0.824 总胆固醇 3.75 ± 0.90 4.31 ± 1.45 1.546 0.100 高密度脂蛋白 1.07 ± 0.25 1.14 ± 0.45 0.349 0.581 低密度脂蛋白 2.27 ± 0.64 2.76 ± 1.16 1.526 0.043* 病理指标 TGF-β评分 6 ± 5.94 7.6 ± 3.42 1.634 0.033* 肿瘤坏死率 0.35（0.21，0.45） 0.53（0.34，0.65） 1.985 0.036* *P < 0.05。
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表 4 评分系统
Table 4. Scoring system
分类 得分 分期 ≥III期 1 < III期 0 化疗周期 ≤2周期 1 > 2周期 0 化疗药物种类 ≤3种 1 > 3种 0 化疗前淋巴细胞/白细胞 ≤0.32 1 > 0.32 0 化疗前中性粒细胞/淋巴细胞 ≤1.98 1 > 1.98 0 化疗前白蛋白 ≥48 g/L 1 < 48 g/L 0 化疗后尿素氮 ≥4.22 mmol/L 1 < 4.22 mmol/L 0 化疗后尿酸 ≥305 μmol/L 1 < 305 μmol/L 0 TGF-β总得分 ≥8.分 1 < 8.5分 0
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