Dexmedetomidine Inhibits Neuronal Apoptosis after Traumatic Brain Injury in Rats
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摘要:
目的 探讨右美托咪定（DEX）对创伤性脑损伤（TBI）的神经保护作用是否与抑制神经细胞凋亡有关，是否涉及SIRT1信号通路。 方法 将SD大鼠随机分为Sham组、TBI + NS组、TBI + DEX组和TBI + DEX + EX527组。采用干/湿重法评估脑创伤后脑组织含水量；神经功能缺损评分检查神经功能受损情况；Western blot法检测大鼠皮质Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。 结果 实验结果显示DEX干预后可减少脑创伤后促凋亡的调控蛋白Bax表达，差异有统计学意义（P < 0.05），增加抑制凋亡的调控蛋白Bcl-2表达，差异有统计学意义（P < 0.05），减轻脑水肿，差异有统计学意义（P < 0.05）和改善神经功能，差异有统计学意义（P < 0.05），上述观测指标的变化可被SIRT1抑制剂EX527逆转。 结论 提示DEX通过抑制神经细胞凋亡而减轻脑创伤后的继发性损害，该神经保护作用与SIRT1信号通路之间存在一定相关性。 Abstract:Objective To discuss whether the neuroprotective effect of dexmedetomidine （DEX） against traumatic brain injury （TBI） is related to the inhibition of neuronal apoptosis and whether it is involved in SIRT1 signaling pathway. Methods SD rats were randomly divided into 4 groups: Sham group, TBI + NS group, TBI + DEX group and TBI + DEX + EX527 group. The water content of brain tissue after traumatic brain injury was evaluated by dry/wet weight method; the neurological function was evaluated by neurological severity score; the expression of Bcl-2 and Bax proteins in rat cortex were detected by Western blot. Results DEX decreased the expression of apoptosis-promoting regulatory protein Bax （P < 0.05）, increased the expression of apoptosis-inhibiting regulatory protein Bcl-2 （P < 0.05）, alleviated brain edema （P < 0.05） and improvedthe neurological function after traumatic brain injury （P < 0.05）. The changes of the above indexes were reversed by SIRT1 inhibitor EX527. Conclusions DEX can reduce the secondary damage after traumatic brain injury by inhibiting the apoptosis of nerve cells. There may be a certain correlation between the neuroprotective effect and SIRT1 signaling pathway. -
Key words:
- Dexmedetomidine /
- Traumatic brain injury /
- Neuronal apoptosis
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创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）发病率正在逐年增加，严重影响人类健康，是全球范围内致死和致残的主要原因之一[1]，已成为发达国家和发展中国家最常见的公共卫生问题之一，是各年龄段高发病率和高死亡率的严重疾病[2]。尤其是青年男性，经常由外力造成头部受伤，包括跌倒、运动伤害、机动车事故和枪击事件等[3]。众所周知，颅脑损伤的病理生理学是一个高度复杂的过程，涉及原发性和继发性损伤机制，原发性损伤是由于撞击直接导致脑组织挫伤、撕裂、缺血、弥漫性轴突损伤、弥漫性肿胀和颅内出血[3]，是不可逆转的。继发性损伤发生在颅脑损伤后的几个小时到几天，诱发信号分子和代谢紊乱等一系列病理性改变，包括脑水肿、神经炎症、氧化应激、神经递质释放、线粒体功能障碍、星形胶质细胞增殖等[4]。其中，脑水肿是颅脑损伤后继发性损伤和不良预后的重要因素之一，占重型颅脑损伤患者死亡率的50%[5]，综合的生理和病理反应最终会导致神经细胞变性、坏死或凋亡的发生[6]。细胞凋亡是一种程序性细胞死亡形式，与脑外伤后继发性病理反应有关[7]。Bcl-2和Bax基因是调控细胞凋亡过程中一对非常重要的调控基因，Bcl-2主要阻止凋亡发生，而Bax是促凋亡作用，凋亡的发生往往是由于Bax在细胞内过度表达引起的[8]。探究TBI的病理机制和寻找潜在的治疗策略是全球关注的焦点。
右美托咪啶（dexmedetomidine，Dex）是一种中枢肾上腺素受体α2受体激动剂，具有镇静、镇痛、手术中抑制交感神经活动和改善心血管稳定性等药理特性[9, 10]。有研究表明，DEX在缺血/再灌注[11]和兴奋性毒性的动物模型中表现出一定的神经保护作用。沉默信息调节因子1（silent information regulator 1，SIRT1）是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的脱乙酰化酶，参与多种细胞功能，并在组织损伤和修复中发挥作用[12]。SIRT家族是各种细胞功能和应激反应的关键调节因子[13]。SIRT1也参与了心肌缺血性损伤和心脏代谢性疾病中的细胞凋亡、应激反应和能量平衡等过程[14]。因此，在本研究中，考虑DEX、SIRT1信号通路和细胞凋亡之间是否存在一定相关性，探讨DEX在TBI大鼠模型中能否发挥神经保护作用，该神经保护作用是否与通过SIRT1信号通路抑制神经元凋亡有关。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
选用体重（300±20） g的健康成年雄性（sprague-dawley，SD）大鼠（昆明医科大学实验动物中心提供），在标准照明（12 h光照/黑暗）和标准环境（温度20 ℃～25 ℃，湿度55%～65%）中提前饲养1周，自由进食和饮水，术前8 h禁食不禁水。实验符合动物学伦理，在实验期间尽可能减少动物数量和痛苦。
1.1.2 试剂
DEX（江苏恩华药业有限公司），抑制剂EX527（Selleck Chemicals公司），兔抗Bax多克隆一抗（Abcam公司），兔抗Bcl-2多克隆一抗（Abcam公司），辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔IgG二抗（Abcam公司），ECL化学发光液（Millipore公司）。
1.1.3 主要实验仪器
自由落体脑损伤打击装置（深圳市瑞沃德生命科技有限公司），精密电子天平（上海上天精密仪器有限公司），漩涡混匀器（Theromo electron corporation公司），WB电泳及转膜仪器（BIO-RAD公司），AI600超灵敏化学发光成像仪（GE公司），移液枪（Theromo electron corporation公司），PVDF膜（Millipore公司），−80 ℃冰箱（Thermo Scientific公司），恒温摇床（上海一恒科学仪器有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 分组及给药
将SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、生理盐水组（TBI+NS组）、右美托咪定组（TBI + DEX组）和SIRT1抑制剂组（TBI+DEX + EX527组）。DEX设置为25 μg/kg（DEX25）、50 μg/kg（DEX50）、100 μg/kg（DEX100）、150 μg/kg（DEX150）、200 μg/kg（DEX200）五个梯度浓度，用生理盐水进行稀释，TBI + DEX组于造模前10 min腹腔注射DEX；EX527先溶解于少量二甲基亚砜中，后加入生理盐水稀释，TBI + DEX + EX527组以5 mg/kg剂量在造模前每2 d腹腔注射1次，共注射4次，之后以DEX 100 μg/kg剂量在造模前10 min腹腔注射。TBI + NS组和Sham组的大鼠给予等体积生理盐水。
1.2.2 模型制备
参照改良的Feeney[15]自由落体方式制备TBI大鼠模型，各组大鼠腹腔注射3.6%水合氯醛（0.08 mL/kg）进行麻醉，大鼠头顶部剃毛，俯卧位固定于脑立体定位仪上，消毒后矢状切开头皮，暴露右侧颅骨，用牙科钻钻出一个直径6 mm的窗孔（矢状缝右侧2.5 mm，冠状缝下方2 mm），将40 g砝码从16 cm的高度垂直自由落下打击骨窗暴露的硬脑膜，随后止血、缝合、腹腔注射生理盐水补液等处理。假手术组仅做开骨窗处理，不进行打击损伤，其余实验过程相同。术后动物均接受监护，直到恢复自主呼吸。
1.2.3 脑组织含水量的测定
采用干湿重法测定脑组织含水量，通过观察脑水肿情况确定DEX药物干预的最佳剂量。将大鼠于造模后24 h时脱颈处死，快速分离新鲜脑组织，用滤纸将其表面的血渍吸除，称重记录湿重，放入105 ℃的烤箱中48 h，然后称重记录干重。按公式计算：脑含水量 = （湿重/干重）/湿重×100%。
1.2.4 改良神经功能缺损评分
采用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity score，mNSS）[16]评估神经功能缺损的严重程度，根据大鼠的运动、感觉、反射和协调能力判定。评分范围为0～18分（0 = 无缺损，18 = 最大缺损），得分越高，说明受损程度越大。实验中采用双盲法。
1.2.5 Western Blot
从−80 ℃冰箱中取出各组损伤侧大脑皮质脑组织，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制剂混合液（比例为100∶1）匀浆。裂解产物在12 000 r/min，4 ℃下离心30 min，提取上清液，用BCA蛋白测定试剂盒测定总蛋白浓度，之后以样本1/5的量加入5×上样缓冲液混匀，95 ℃煮沸5 min使蛋白变性。每个加样孔加入50 μL的总蛋白上样量，使用10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质样品，使其转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）。用10%脱脂牛奶室温下封闭2 h，分别滴加一抗兔抗大鼠Bax多克隆抗体（1∶1 000）和兔抗大鼠Bcl-2多克隆抗体（1∶1000），4 ℃孵育过夜。次日用TBST漂洗，室温下在山羊抗兔IgG二抗中孵育1 h。最后使用增强型化学发光检测系统进行显色和曝光，Image J软件对目标蛋白条带灰度值进行量化分析。
1.3 统计学处理
采用SPSS版软件和GraphPad Prism 8进行统计学分析，单因素方差分析以及Student’ s t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 脑创伤后脑组织含水量的变化
干/湿重法检测结果显示：与Sham组比较，TBI后24 h的脑组织含水量明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与TBI + NS组比较，TBI + DEX25、TBI + DEX50、TBI + DEX100、TBI + DEX150、TBI + DEX200组的含水量均有所降低，差异有统计学意义（P < 0.05），表明DEX能够减轻脑外伤后的脑水肿，其中TBI + DEX100组含水量降低最明显，差异有统计学意义（P < 0.05），见图1。因此，确定DEX（100 μg/kg）为最佳剂量进行后续干预实验。
图 1 DEX干预对TBI所致脑水肿的影响与Sham组比较，*P < 0.05；与TBI + NS组比较，#P < 0.05；与DEX50和DEX150组比较，△P < 0.05。Figure 1. Effect of DEX administration on TBI-induced brain edema2.2 脑创伤后神经功能缺损的情况
神经功能缺损评分结果显示：与Sham组相比，TBI后24 h的神经功能显著下降，其神经功能缺损评分显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与TBI + NS组相比，TBI + DEX100组能够降低神经功能缺损评分，差异有统计学意义（P < 0.05）；与TBI + DEX组相比，TBI + DEX + EX527组评分有所升高，差异有统计学意义（P < 0.05），见图2。TBI后使用DEX干预显著降低了TBI大鼠的神经功能缺损评分，使用抑制剂EX527干预能使其升高，表明在TBI后使用DEX治疗会促进神经功能的改善，而且有可能涉及SIRT1信号通路。
图 2 DEX干预对TBI所致神经功能缺损的影响与Sham组比较，*P < 0.05；与TBI + NS组比较，#P < 0.05；与TBI + DEX100组比较，△P < 0.05。Figure 2. Effect of DEX administration on TBI-induced neurological deficits2.3 脑创伤后大脑皮质中Bax和Bcl-2的蛋白表达变化
Western blot检测Bax蛋白的实验结果显示：Sham组大鼠脑内基础Bax蛋白表达较低，Bcl-2蛋白表达较高；与Sham组相比，TBI+NS组的Bax表达显著升高，差异有统计学意义（P < 0.05），Bcl-2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义（P < 0.05）；与TBI+NS组相比，TBI + DEX100组的Bax表达明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05），Bcl-2蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P < 0.05）；与TBI + DEX组相比，TBI + DEX + EX527组Bax蛋白表达量有所升高，差异有统计学意义（P < 0.05），Bcl-2蛋白表达有所降低，差异有统计学意义（P < 0.05），见图3。这些结果提示脑创伤的DEX治疗可能抑制促凋亡调控蛋白Bax的表达，增加抗凋亡调控蛋白Bcl-2的表达。
图 3 DEX干预对TBI后Bax和Bcl-2蛋白表达的影响A：大脑皮层Bax和Bcl-2蛋白条带；B：Bax蛋白条带灰度值分析；C：Bcl-2蛋白条带灰度值分析。与Sham组比较，*P < 0.05；与TBI + NS组比较，#P < 0.05；与TBI + DEX100组比较，△P < 0.05。Figure 3. Effect of DEX administration on Bax and Bcl-2 protein expression after TBI3. 讨论
TBI是一个重要的公共卫生问题，TBI后的继发性损伤可引发长期的神经退行性过程，导致TBI患者的不良结局甚至死亡。在本研究中，大鼠脑创伤后24 h脑含水量增加，出现了严重的创伤性脑水肿，大鼠神经功能明显障碍，经过DEX治疗后，脑组织水肿程度和神经功能都得到一定程度的改善，这些结果表明DEX可用于治疗TBI患者并改善预后，在脑损伤的神经保护方面具有广阔的应用前景。细胞凋亡是在生理和病理条件下发生细胞程序性死亡的形态学表现，其特征是DNA片段化、染色质压缩、核固缩和胞浆凝聚[17]。脑外伤触发了一系列复杂的神经细胞凋亡事件，导致神经元损伤和神经功能障碍[18]。Bcl-2家族蛋白作为细胞凋亡中比较重要的调节因子，其功能具有促进和抑制细胞凋亡两种，其中Bax蛋白促进神经元凋亡，能够激活促凋亡因子和灭活抗凋亡的Bcl-2蛋白来发挥作用。相反，Bcl-2蛋白抑制细胞凋亡，并与脑外伤后的神经保护有关，通常情况下Bax和Bcl-2蛋白的表达相对稳定，其比值一旦发生改变将会改变细胞凋亡的程度[19]。本研究的Western blot实验结果表明，DEX干预后促使Bcl-2蛋白表达增加，Bax蛋白表达降低，而SIRT1抑制剂EX527可以使Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达增高，说明SIRT1信号通路可能与右美托咪啶抑制细胞凋亡之间有一定相关性。本课题组在前期研究中还发现，DEX干预后，SIRT1表达明显增多，从而降低促凋亡因子cleaved-caspase3蛋白的表达，在一定程度上抑制了神经元凋亡，在应用SIRT1抑制剂EX527干预后，DEX抑制cleaved-caspase3蛋白表达的能力减弱[20]。这些实验结果都表明，SIRT1抑制剂EX527可以逆转DEX的神经保护作用。
综上所述，颅脑创伤后应用DEX干预，可能通过SITR1通路调节凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达水平，发挥抗凋亡机制减轻脑水肿和神经功能损害，从而改善脑损伤预后，这可能是DEX发挥神经保护作用的机制之一。然而，DEX对脑损伤的治疗意义，需要在临床实践中进一步验证。
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图 1 DEX干预对TBI所致脑水肿的影响
与Sham组比较，*P < 0.05；与TBI + NS组比较，#P < 0.05；与DEX50和DEX150组比较，△P < 0.05。
Figure 1. Effect of DEX administration on TBI-induced brain edema
图 2 DEX干预对TBI所致神经功能缺损的影响
与Sham组比较，*P < 0.05；与TBI + NS组比较，#P < 0.05；与TBI + DEX100组比较，△P < 0.05。
Figure 2. Effect of DEX administration on TBI-induced neurological deficits
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