Metabolomics Studies on Feces and Serum from Type 2 Diabetes Mellitus
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摘要:
目的 研究2型糖尿患者与健康者血清和粪便的代谢组学差异，分析差异代谢物与2型糖尿病之间的相关性。 方法 选择2018年1月至2019年3月在昆明医科大学第二附属医院内分泌科住院的2型糖尿病患者53例，以及同期常规体检健康对照人群30例，采用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术对两组研究对象的血清代谢物及30例糖尿病患者与对照组的粪便代谢物进行非靶向和靶向的代谢组学研究。应用Spearman相关性分析方法对血清和粪便中的差异代谢物与2型糖尿病相关指标的相关性进行分析。 结果 在2型糖尿病组与健康对照组血清样本中鉴定出15个差异代谢物，在粪便样本中鉴定出的差异代谢物则有6个。其中，糖尿患者血清中的谷氨酰胺、壬二酸、癸二酸及3-羟基癸二酸等二羧酸类羟基化衍生物明显低于健康对照组，差异有统计学意义（P < 0.01），而琥珀酰乙酰乙酸、缬氨酸、亮氨酸、葡萄糖、乳酸的含量则高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.01），并且琥珀酰乙酰乙酸、乳酸与糖化血红蛋白、餐后2 h血糖及空腹血糖浓度具有较强的正相关性，而壬二酸、癸二酸及二羧酸类羟基化衍生物与血糖浓度则具有较强的负相关；在粪便代谢物中，去氧胆酸和鹅去氧胆酸等胆汁酸与受检者的血糖浓度也有着一定的正相关性，并且单变量分析结果显示，与健康对照组相比糖尿病患者血清中的去氧胆酸和鹅去氧胆酸均显著性升高，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 2型糖尿患者的血清代谢组学与健康者具有明显的差异，这些差异代谢物与糖尿病的发生和发展具有较强的关联性。在粪便代谢组学中，糖尿患者的胆汁酸水平与血糖的浓度变化也密切相关。 -
关键词:
- 2型糖尿病 /
- 代谢组学 /
- 超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱技术
Abstract:Objective To study the metabolomic differences of serum and feces between patients with type 2 diabetes and healthy people, and analyze the correlation between different metabolites and type 2 diabetes. Methods From January 2018 to March 2019, 53 patients with newly diagnosed type 2 diabetes mellitus and 30 healthy controls were enrolled in the Department of Endocrinology, the Second Affiliated Hospital of Kunming Medical University. The serum metabolites of the two groups and the fecal metabolites of 30 diabetic patients and the control group were detected by ultra performance liquid chromatography quadrupole time of flight mass spectrometry （UPLC-QTOF/MS） To carry out non targeted and targeted metabolomics studies. Spearman correlation analysis method was used to analyze the correlation between the differential metabolites in serum and stool and related indicators of type 2 diabetes. Results Fifteen differential metabolites were identified in serum samples of type 2 diabetes group and healthy control group, and 6 differential metabolites were identified in stool samples. The levels of glutamine, azelaic acid, sebacic acid, 3-hydroxysebacic acid and other dicarboxylic acid hydroxylated derivatives in patients with diabetes were significantly lower than those in healthy controls （P < 0.01）, while the levels of succinylacetoacetate, valine, leucine, glucose and lactic acid in patients with diabetes were significantly higher than those in healthy controls （P < 0.01）. In the fecal metabolites, deoxycholic acid, chenodeoxycholic acid and other bile acids also had a certain positive correlation with the blood glucose concentration of the subjects, and univariate analysis results showed that compared with the healthy control group, the blood glucose concentration of the subjects was significantly higher in the two groups The serum levels of deoxycholic acid and chenodeoxycholic acid were significantly increased in patients with uropathy. Conclusions There are obvious differences in serum metabolomics between patients with type 2 diabetes mellitus and healthy people, and these metabolites are closely related to the occurrence and development of diabetes mellitus. In fecal metabonomics, the level of bile acid in diabetic patients is closely related to the change of blood glucose concentration. -
糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一组由体内胰岛素绝对或者相对不足所引起的具有一系列临床表现的综合症，其涉及遗传、环境和生活习惯等多种因素，常表现为机体血中葡萄糖水平的长期增高，是继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占了所有糖尿病的90%以上[1]。国际糖尿病联盟（international diabetes federation，IDF）发布的第9版全球糖尿病地图（IDF diabetes atlas）数据显示，2019年全球约有4.63亿20～79岁成年人患糖尿病（11个人中有1人为糖尿病患者）；预计到2030年糖尿病患者将会达到5.784亿，到2045年将会达到7.002亿。DM与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和β细胞功能缺陷有关，不同病人其IR和胰岛素分泌缺陷在发病中的重要性不同，同一病人在疾病进程中两者的相对重要性也可能发生变化，T2DM具体的病因和发病机制目前仍未完全清楚。代谢组学（metabonomics）可对样本中的多种代谢物同时进行分析，研究某一时刻细胞内所有小分子代谢物（主要包括基因调控生物体在代谢过程中形成的中间产物和最终产物）的种类、数量及变化规律，从而揭示代谢物与生理和病理变化的相关关系[2-3]。本研究从代谢层面探讨了T2DM患者在粪便与血清上的代谢组学差异并对这些差异代谢物与糖尿病相关指标做了相关性分析，力争为T2DM的诊治和研究提供新的思路。
1. 资料与方法
1.1 研究对象
所有患者均来自于2018年1月至2019年3月昆明医科大学第二附属医院内分泌科住院患者，对照组来源于同期来院体检的健康志愿者和整形科患者。T2DM组53例，男性39例，女性14例，平均年龄（54.47±14.40）岁；对照组30例，男性16例，女性14例，平均年龄（51.77±8.01）岁。两组在性别和年龄等基本资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。本研究方案经医院医学伦理委员会批准，参与人员均签署了知情同意书。
1.2 入组标准
有明确的糖尿病症状，年龄在40岁以上，按1999年WHO糖尿病诊断分类标准[4] 确定的T2DM，且未使用过糖尿病治疗药物的患者纳入T2DM组；年龄与T2DM组相匹配的健康志愿者归入对照组。
1.3 排除标准
合并恶性肿瘤者，合并有心脑血管、肝、肾和造血系统严重疾病者；哺乳期或妊娠期妇女；1 个月内发生过糖尿病急性并发症及合并严重感染者；1 个月内使用过抗生素治疗者；1 个月内使用过肠道微生态制剂者；正在参加一项干预性临床研究的受试者。
1.4 研究方法
1.4.1 样本采集及保存
各组研究对象要求禁食8 h以上，于次日晨空腹采集肘静脉血3～5 mL置于无抗凝剂的试管中，室温下放置30 min待其自然凝固，3 000 r/min离心10 min。吸取液相交界以上的血清样本200 μL，加入1.5 mL离心管中置于-80 ℃冰箱中备用；同时采集其中30名研究对象的粪便样本3～5 g，置于-80 ℃冰箱中备用。
1.4.2 仪器与试剂
液相系统（UPLC，Agilent公司）；质谱仪（6530 QTOF-MS，Agilent公司）；色谱柱：XDB-C18色谱柱（2.1×100 mm 1.8 µM，美国Agilent公司）；涡旋混匀器（VORTEX2，德国IKA公司）；高速冷冻离心机（5415R，德国Eppendorf公司）；电子分析天平（FA2004，上海舜宇恒平）；超声仪（SB-5200D，宁波新芝）；冻干机（SCIENTZ-12N，宁波新芝）；全自动生化分析仪（Power Processor，美国贝克曼库尔特）；全自动化学发光免疫分析仪（Cobas e 601，瑞士Roche）；超低温冰箱（DW-86L490，中国海尔）；甲酸（formic acid）、氯磺丙脲（chlorpropamide）、鹅去氧胆酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）、去氧胆酸（deoxycholic acid，DCA）、胆酸（cholic acid，CA）购自美国Sigma-Aldrich公司；谷氨酰胺（glutamine，Gln）、缬氨酸（valine，Val）、亮氨酸（leucine，Leu）、壬二酸（azelaic acid，AzA）、癸二酸（sebacic acid，SeA）、十一烷二酸（undecanedioic acid，UDA）和葡萄糖（glucose，Glu）购自上海麦克林生化科技有限公司；乙腈购自美国Merck公司。
1.4.3 样本前处理
血清样品：取20 µL的血浆样品加入380 mL含有5 µM氯磺丙脲（内标）的 67%的乙腈/水提取液进行混合，涡流震荡5 min后在4 ℃ 18000 r/min的条件下离心20 min，取上清进样分析；粪便样品：先将采集到的粪便样品用冷冻干燥的方式将水分除去，随后称取约30 mg的粪便样品，加入600 μL含有5 µM氯磺丙脲（内标）的 50%乙腈/水提取液，充分混匀后在室温下超声30 min。接着，12 000 r/min离心15 min。为了更好地去除粪便中的杂质，将等体积的提取液加入第1次离心所获得的200 μL上清液中，涡旋后18 000 r/min 离心25 min，取上清进样分析。
1.4.4 色谱和质谱条件及进样方式
运用超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱仪（Ultra performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，UPLC-QTOF/MS）对健康对照组与病例组的血清及粪便中的代谢物进行非靶向和靶向的代谢组学分析，条件如下：
液相色谱条件：流动相A为含0.01%甲酸的水，流动相B为含0.01%甲酸的乙腈，流速为0.3 mL/min。C18色谱柱（柱温为45 ℃）的色谱分离梯度如下：1～12 min时B相由2%上升至98%；保持2 min后，B相逐渐下降至2%；总洗脱时间为16 min。
质谱条件：离子采集范围的质荷比为100～800，采集模式为ESI+和ESI-。毛细管电压为3.5 kV；进样锥电压为20 V；雾化气压为35 psi；碰撞气和干燥气均为氮气，流速分别为50 L/h和9 L/min；干燥器温度为350 ℃。
进样方式：将该批次分析的样本每个吸取10 μL，混合后作为质控样品，检测样品采用乱序进样的方式进行检测分析且每间隔10个样品插入一个质控样品，用于监测仪器和样品的稳定性，保证后续结果分析的可靠性。
1.4.5 临床检测指标与方法
采用美国贝克曼库尔特全自动生化分析仪测定空腹血清TC、TG、HDL-C、LDL-C、Glu含量，罗氏全自动化学发光免疫分析仪检测空腹胰岛素、空腹C肽、糖化血红蛋白（hemoglobin a1c，HbA1c）的浓度。
1.5 数据处理
采集到的质谱数据经过Agilent公司的代谢组学分析软件Mass Profinder处理后将产生庞大的数据矩阵，该矩阵包含有样品名、保留时间、质荷比和离子峰面积等信息。为了提高数据的质量和可靠性，获得的数据矩阵以质控样品为参照，将变异系数（Variation coefficient）大于30%的变量进行过滤去除。随后，应用SIMCA-P+13.0 （Umetrics，USA）对数据集进行多元统计分析，包括主成分分析（principal component analysis，PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）。通过OPLS-DA模型（p（corr）（偏相关系数）绝对值 > 0.5，VIP（变量权重）值 > 1）筛选到差异化合物后运用HMDB和KEGG数据库对相应的质荷比进行匹对（ppm < 10），列出候选化合物。最终，通过差异化合物所对应的二级碎片和标准品对候选化合物的结构进行最终的匹配和确定。
1.6 统计学处理
实验过程中的数据均以平均值±标准差进行表示。统计学差异分析采用双尾t检验（two-tailed Student t-test），相关性系数则由Spearman 相关性分析方法计算而得。统计分析和数据可视化主要在OriginPro2018 （OriginLab，USA）平台上完成，P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 两组研究对象临床特征
对照组与T2DM组间的年龄、总胆固醇、空腹胰岛素、空腹C肽、尿素、肌酐浓度，差异无统计学意义（P > 0.05）。T2DM组的血清空腹血糖、甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇、糖化血红蛋白浓度高于对照组，高密度脂蛋白胆固醇浓度低于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。两组的临床特征见表1。
表 1 两组研究对象临床特征（$\bar x\pm s$ ）Table 1. The clinical characteristics of the control and the T2DM groups （$\bar x\pm s $ ）指标 对照组 2型糖尿病组 t P 年龄（岁） 51.77 ± 8.01 54.47 ± 11.40 −1.26 0.21 TC（mmol/L） 4.48 ± 0.71 4.78 ± 1.18 −1.459 0.15 TG（mmol/L） 1.31 ± 0.57 2.95 ± 1.98 −5.61 0.000** HDL-C（mmol/L） 1.52 ± 0.39 1.09 ± 0.24 5.501 0.000** LDL-C（mmol/L） 2.62 ± 0.51 3.05 ± 0.99 −2.63 0.01* FPG/mmol/L 5.12 ± 0.47 9.59 ± 3.64 −8.80 0.000** FINS（μIU/mL） 11.16 ± 3.29 13.39 ± 8.39 −1.71 0.09 FC-P（ng/mL） 2.75 ± 0.96 3.06 ± 1.18 −1.22 0.23 HbA1C（%） 5.19 ± 1.16 9.21 ± 2.18 −10.97 0.000** 尿素（mmol/L） 5.20 ± 1.72 5.29 ± 1.66 0.24 0.81 肌酐（mol/L） 67.50 ± 17.04 70.38 ± 17.30 −0.73 0.47 与对照组比较，*P > 0.05，**P > 0.01。 2.2 糖尿病患者血清的代谢组学分析结果
无论是在正离子模式还是负离子模式下，糖尿病患者的血清代谢组PCA得分图与健康人相比均具有非常明显的聚类现象，且QC样品的分散程度相对较小（图1a、图1b）。该结果不仅表明在检测过程中样品和仪器的稳定性良好，而且还反映出糖尿病患者的血清代谢轮廓有别于健康对照组。在监督性的多元统计分析中，二者得分图的聚类情况则更加明显（图1c、图1d），其预测参数和拟合参数分别为ESI + （R2Y = 0.775；Q2 = 0.722；P（CV - ANOVA） < 0.0001）和ESI - （R2Y = 0.784；Q2 = 0.728；P（CV - ANOVA） < 0.0001），是一个较为优秀的多元统计分析模型。通过p（corr）绝对值 > 0.5，VIP值 > 1的标准，本研究在S-plot中发现糖尿患者血清中的Gln、AzA、SeA、UDA及二羧酸类羟基化衍生物、Val、Leu、Glu、琥珀酰乙酰乙酸（succinylacetoacetate，SAA）和乳酸（lactic acid，LA）等与健康者相比具有明显的差异（图1e和图1f）。其中，糖尿患者中的Gln、二羧酸类化合物及其羟基化衍生物明显低于健康对照组；而Val、Len、Glu、SAA和LA的含量则相对较高。
图 1 血清的非靶向代谢组学分析a：ESI+模式下的血清代谢组PCA得分图；b：ESI-模式下的血清代谢组PCA得分图；c：ESI+模式下的血清代谢组OPLS-DA得分图；d：ESI-模式下的血清代谢组OPLS-DA得分图；e：ESI+模式下的血清代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）；f：ESI-模式下的血清代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）；3-HDDCA：3-Hydroxydodecanedioic acid；3-HTTCA：3-Hydroxytetradecanedioic acid。Figure 1. The non-targeted metabolomics analysis of serum2.3 糖尿病患者粪便的代谢组学分析结果
无论是在正离子模式还是负离子模式下，样品和仪器的稳定性均呈现出较好的状态，但糖尿患者的粪便代谢组PCA得分图与健康人相比却都无明显的聚类现象（图2a、图2b）。该结果表明，糖尿病患者与健康人的粪便代谢组差异程度不高。然而，在监督性的多元统计分析中，尽管模型的拟合和预测能力较差：ESI + （R2Y = 0.518；Q2 = 0.29；P（CV - ANOVA） < 0.001）；ESI - （R2Y = 0.358；Q2 = 0.09；P（CV - ANOVA） = 0.20），但本实验发现糖尿病组与健康对照组之间依然存有一定的差异性：从得分图中可以清晰地看到糖尿病组也能够较好地区别于健康对照组（图2c、图2d）。结合p（corr）绝对值 > 0.5和VIP值 > 1的标准，本实验在S-plot中发现粪便中的胆汁酸（bile acid，BAs），包括CA、DCA、CDCA，7，12-二羟基胆酸（7，12-Dihydroxycholanoic acid）、二十四碳六烯酸（tetracosahexaenoic acid，THA）和乙酰乙醇酰胺（cervonoyl ethanolamide）在糖尿患者组中显著上升（图2e、图2f）。其中，DCA是肠道微生物代谢BAs后所产生的典型次级胆汁酸。本实验提示，糖尿患者的粪便代谢物与对照组相比具有明显的差异，这种差异可能源于肠道菌群的不同。粪便和血清的差异化合物定性和统计信息见表2。
图 2 粪便的非靶向代谢组学分析a：ESI+模式下的粪便代谢组PCA得分图；b：ESI-模式下的粪便代谢组PCA得分图；c：ESI+模式下的粪便代谢组OPLS-DA得分图；d：ESI-模式下的粪便代谢组OPLS-DA得分图；e：ESI+模式下的粪便代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）；f：ESI-模式下的粪便代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）。Figure 2. Non-target metabolomic analysis of fecal表 2 临床血清和粪便中差异代谢物的定性与定量信息表Table 2. The qualitative and quantitative information of different metabolites in serum and fecal samples保留
时间分子量 化合物 离子模式 偏相关系
数绝对值变量权
重值倍数
（糖尿病组/
对照组）质荷比
误差离子碎片 样本类型 0.87 202.047 Succinylacetoacetate ESI+ 0.75 8.74 1.66 4 84.96；116.06；
139.05；172.11serum 0.88 146.070 Glutamine* ESI+ −0.56 1.06 0.86 6 84.04；102.05；
130.05serum 1.00 117.079 Valine* ESI+ 0.52 2.92 1.18 0 55.05；72.08 serum 1.05 131.095 Leucine* ESI+ 0.57 4.57 1.24 3 30.03；44.05；
69.07；86.10serum 5.92 188.104 Azelaic acid* ESI+ −0.72 4.49 0.30 5 125.10；171.10 serum 6.63 246.147 3-Hydroxydodecanedioic acid ESI+ −0.83 5.89 0.50 1 171.10；229.15 serum 7.74 274.177 3-Hydroxytetradecanedioic acid ESI+ −0.86 9.84 0.42 4 171.10；239.16 serum 8.95 302.208 5-Hydroxyhexadecanedioic acid ESI+ −0.81 2.25 0.38 4 171.10；285.21 serum 0.84 180.063 Glucose* ESI− 0.64 1.38 1.72 2 45.00；59.01；
89.03serum 1.05 90.032 Lactic acid ESI− 0.71 8.62 1.48 3 43.02；71.01 serum 5.51 218.115 3-Hydroxydecanedioic acid ESI− −0.77 2.51 0.40 2 69.03；119.03；
158.24serum 5.91 188.104 Azelaic acid* ESI− −0.68 8.53 0.31 3 125.10；143.86；
169.08serum 6.60 202.120 Sebacic acid* ESI− −0.67 2.10 0.29 1 139.12；183.10 serum 6.64 246.147 3-Hydroxydodecanedioic acid ESI− −0.79 5.51 0.51 2 57.04；125.10；
187.10serum 7.25 216.136 Undecanedioic acid* ESI− −0.69 2.01 0.27 1 153.13；197.11 serum 8.95 302.209 5-Hydroxyhexadecanedioic acid ESI− −0.79 1.86 0.38 1 71.05；153.12；
197.12serum 8.66 372.267 Cervonoyl ethanolamide ESI+ 0.51 2.61 2.16 1 107.09；159.12；
173.13；337.25feces 9.35 356.272 Tetracosahexaenoic acid ESI+ 0.52 2.17 1.67 1 107.09；187.15；
247.17feces 9.39 392.293 7，12-Dihydroxycholanoic acid ESI− 0.57 3.85 1.47 1 345.28；373.26 feces 10.06 392.293 Chenodeoxycholic acid* ESI− 0.63 7.53 3.54 1 354.07；373.26 feces 8.65 408.290 Cholic acid* ESI− 0.57 10.72 3.04 6 95.05；251.20；
289.22；343.27feces 10.26 392.293 Deoxycholic acid* ESI− 0.71 8.40 1.61 1 327.27；345.28；
355.27；373.26feces *表示与标准品进行比对过的化合物。 2.4 血清和粪便中差异化合物的靶向代谢组学分析
结合样本的多元统计分析结果，本研究对筛选到的差异化合物峰面积进行了靶向分析并对基于student-t test的P值进行计算。血清和粪便中的差异化合物相对定量结果分别如图3a和图3b所示。各化合物的含量与多元统计分析结果基本一致。同时，本研究还针对粪便中三个胆汁酸，差异有统计学差意义（P < 0.05）对血清样品中相应的胆汁酸进行了靶向研究。分析结果显示，与健康对照组相比糖尿病患者血清中的DCA和CDCA均显著性升高（P < 0.05），见图3c。
图 3 差异代谢物的单变量靶向分析a：血清差异代谢物的相对定量；b：粪便差异代谢物的相对定量；c：血清中的胆汁酸水平；与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。Figure 3. Univariate targeting analysis of different metabolites2.5 差异代谢物与临床指标的相关性分析
为了揭示血清和粪便中的差异代谢物与患者糖尿病临床指标之间的数量关系，本研究对差异代谢物与临床指标做了Spearman相关性分析（图4）。本研究发现SAA与HbA1c、餐后2 h和血糖浓度具有较强的正相关性，其中与血糖浓度的相关性系数高达0.95。除此之外，本研究发现血清中的LA与血糖浓度也具有较强的正相关性，其相关性系数为0.64，而3-羟基癸二酸（3-Hydroxydecanedioic acid）、3-羟基十二烷二酸（3-Hydroxydodecanedioic acid）、5-羟基十六烷二酸（5-Hydroxyhexadecanedioic acid）、3-羟基十四烷二酸（3-Hydroxytetradecanedioic acid）、AzA、SeA和UDA等与血糖浓度则具有较强的负相关。在粪便代谢物中，包括DCA和CDCA在内的多个胆汁酸与检测者的血糖浓度也有着一定的正相关性。
图 4 差异代谢物与临床指标的相关性分析Figure 4. Correlation analysis of different metabolites and clinical indicators3. 讨论
SAA是苯丙氨酸、酪氨酸代谢途径的中间产物，遗传性Ⅰ型酪氨酸血症患者因富马酸乙酰乙酸水解酶（fumarylacetoacetate hydrolase，FAH）的缺乏或活性减低，导致血液中的肾脏毒性化合物马来乙酰乙酸（maleylacetoacetate，MAA）和富马酸乙酰乙酸（fumarylacetoacetate，FAA）及SAA含量增加，从而出现肾小管蛋白尿[5-6]。糖尿病肾病随着糖尿病微血管病变的加重，尿蛋白的含量也不断增加，与本研究中血清检测到糖尿病组的SAA浓度较对照组高一致，并且和患者空腹血糖、HbA1c具有较高的相关性，说明SAA的浓度可能与糖尿病的发生发展有关。
糖尿病患者的代谢异常不仅表现在糖类，其脂肪酸类及氨基酸类在血清代谢组学上也和健康人群不同，Len、Val等支链氨基酸的含量较健康人群高[7-10]。并且研究发现酪氨酸（tyrosine，Tyr）、苯丙氨酸（phenylanine，Phe）等芳香族氨基酸及Len、Val等支链氨基酸水平的升高对糖尿病的发生有预测作用[1，9，11]，而它们的代谢产物乙酰乙酸、乙酰辅酶 A和琥珀酰辅酶A分别参加成酮和成糖反应，其代谢通路异常使体内积累大量酮体及脂肪酸代谢、糖代谢障碍，从而出现糖尿病酮症及冠心病等情况[3]。此外，研究发现空腹Gln的浓度与IR呈显著负相关[8，11]，而IR在糖尿病的发生发展过程中有着重要作用。本研究中T2DM组患者血清中的Len、Val浓度较高，Gln浓度较低，与前期的研究结果一致[7，12，13]，其机理可能与氨基酸的代谢、三羧酸循环障碍及IR有关。
AzA、SeA、十二烷二酸（dodecanedioic acid，DCA）等二羧酸广泛存在于自然界中（全谷类高等植物、全谷类、蜂王浆等）。对患有T2DM的动物和人类的研究表明，癸二酸的口服给药可能通过增强胰岛素敏感性、减少肝糖异生和葡萄糖输出来改善血糖[14-15]；AzA可激活胰岛素信号分子，使胰岛素敏感性增加，可用于治疗与T2DM相关的IR[16]，研究还发现AzA的丰度与颈动脉内膜-中膜的厚度呈高度负相关[17]，而壬二酸二乙酯（diethyl azelate，DEA）可改善IR及脂蛋白代谢，其疗效与IR的程度有关[18]。此外，AzA的摄入能够通过显著增加己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性及肝脏中的糖原含量、大大降低葡萄糖 -6- 磷酸酶和果糖 -1，6- 二磷酸酶的活性而调节血浆葡萄糖、胰岛素、HbA1c 和血红蛋白水平[14]。本研究中，糖尿患者血清中的二羧酸类化合物及其羟基化衍生物浓度明显低于健康对照组，加之先前的研究显示二羧酸类化合物对T2DM的糖代谢及IR有积极作用，因此补充癸二酸、壬二酸等二羧酸可作为未来T2DM治疗的另一种途径。
BAs是胆固醇分解代谢的终产物，其合成与代谢除了受自身调节外，还受到了腺苷酸活化的蛋白激酶和去乙酰化酶以及肝脏和肠道中法尼醇X 受体（farnesol X receptor，FXR）的调节[19-20]。而肠道微生物被认为是一种代谢器官，其可代谢肠腔内容物产生短链脂肪酸、胆汁酸、吲哚类及多胺类等物质[21]，其群落的变化也会改变胆汁酸水解酶的表达水平，使非结合型胆汁酸减少从而影响宿主胆汁酸池的组成及胆汁酸的信号传递[22-24]。此外，胆汁酸还能通过与肝脏及肠道的 FXR、G 蛋白偶联胆汁酸受体 1（G protein-coupled bile acid receptor 1，GPBAR-1） 结合，参与调节机体的葡萄糖、脂质代谢及固有免疫等[25-27]。故而肠道微生物参与并调节肝脏胆汁酸的合成与代谢，而胆汁酸池的组成变化又影响肠道微生物组成，两者对改善T2DM的IR、控制空腹血糖浓度有着重要的作用。本研究发现，糖尿病患者粪便代谢物中包括DCA和DCDA在内的多个胆汁酸与糖尿病患者的空腹血糖浓度也有着一定的正相关性，针对其中具有统计学差异的三个胆汁酸进行了血清靶向分析结果显示，与健康对照组相比糖尿病患者血清中的DCA和DCDA均显著性升高，提示糖尿患者的肠道菌群可能有别于健康对照组。
综上所述，本研究采用UPLC-QTOF/MS的代谢组学技术，探讨了T2DM患者血清及粪便中小分子代谢物的变化特点，发现T2DM患者的血清代谢组与健康者具有明显的差异，其中SAA及LA与糖尿病患者的空腹血糖浓度、HbA1c具有较强的关联性，其可能是T2DM患者的发生和发展的一个标志物。在粪便代谢组中，T2DM患者的BAs水平显著高于健康对照组且与空腹血糖浓度具有一定的相关性，该研究结果提示糖尿患者的肠道菌群可能有别于健康对照组。因T2DM的发生发展涉及糖代谢、脂类代谢、氨基酸代谢及核苷酸代谢等多条代谢途径异常，最终引起机体多种代谢物改变，同时各代谢通路间又相互关联相互影响，而本研究为探索性研究，样本量不大，存在一定的局限性，后续还需增加样本量和开展队列研究来证实这些结论及深入探讨这些发现与糖尿病发生发展之间的关联。
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图 1 血清的非靶向代谢组学分析
a：ESI+模式下的血清代谢组PCA得分图；b：ESI-模式下的血清代谢组PCA得分图；c：ESI+模式下的血清代谢组OPLS-DA得分图；d：ESI-模式下的血清代谢组OPLS-DA得分图；e：ESI+模式下的血清代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）；f：ESI-模式下的血清代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）；3-HDDCA：3-Hydroxydodecanedioic acid；3-HTTCA：3-Hydroxytetradecanedioic acid。
Figure 1. The non-targeted metabolomics analysis of serum
图 2 粪便的非靶向代谢组学分析
a：ESI+模式下的粪便代谢组PCA得分图；b：ESI-模式下的粪便代谢组PCA得分图；c：ESI+模式下的粪便代谢组OPLS-DA得分图；d：ESI-模式下的粪便代谢组OPLS-DA得分图；e：ESI+模式下的粪便代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）；f：ESI-模式下的粪便代谢组S-plot：红色圆圈表示变化较为明显的代谢物（分子量）。
Figure 2. Non-target metabolomic analysis of fecal
图 3 差异代谢物的单变量靶向分析
a：血清差异代谢物的相对定量；b：粪便差异代谢物的相对定量；c：血清中的胆汁酸水平；与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001。
Figure 3. Univariate targeting analysis of different metabolites
图 4 差异代谢物与临床指标的相关性分析
Figure 4. Correlation analysis of different metabolites and clinical indicators
表 1 两组研究对象临床特征（
$\bar x\pm s$ ）Table 1. The clinical characteristics of the control and the T2DM groups （
$\bar x\pm s $ ）指标 对照组 2型糖尿病组 t P 年龄（岁） 51.77 ± 8.01 54.47 ± 11.40 −1.26 0.21 TC（mmol/L） 4.48 ± 0.71 4.78 ± 1.18 −1.459 0.15 TG（mmol/L） 1.31 ± 0.57 2.95 ± 1.98 −5.61 0.000** HDL-C（mmol/L） 1.52 ± 0.39 1.09 ± 0.24 5.501 0.000** LDL-C（mmol/L） 2.62 ± 0.51 3.05 ± 0.99 −2.63 0.01* FPG/mmol/L 5.12 ± 0.47 9.59 ± 3.64 −8.80 0.000** FINS（μIU/mL） 11.16 ± 3.29 13.39 ± 8.39 −1.71 0.09 FC-P（ng/mL） 2.75 ± 0.96 3.06 ± 1.18 −1.22 0.23 HbA1C（%） 5.19 ± 1.16 9.21 ± 2.18 −10.97 0.000** 尿素（mmol/L） 5.20 ± 1.72 5.29 ± 1.66 0.24 0.81 肌酐（mol/L） 67.50 ± 17.04 70.38 ± 17.30 −0.73 0.47 与对照组比较，*P > 0.05，**P > 0.01。 
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表 2 临床血清和粪便中差异代谢物的定性与定量信息表
Table 2. The qualitative and quantitative information of different metabolites in serum and fecal samples
保留
时间分子量 化合物 离子模式 偏相关系
数绝对值变量权
重值倍数
（糖尿病组/
对照组）质荷比
误差离子碎片 样本类型 0.87 202.047 Succinylacetoacetate ESI+ 0.75 8.74 1.66 4 84.96；116.06；
139.05；172.11serum 0.88 146.070 Glutamine* ESI+ −0.56 1.06 0.86 6 84.04；102.05；
130.05serum 1.00 117.079 Valine* ESI+ 0.52 2.92 1.18 0 55.05；72.08 serum 1.05 131.095 Leucine* ESI+ 0.57 4.57 1.24 3 30.03；44.05；
69.07；86.10serum 5.92 188.104 Azelaic acid* ESI+ −0.72 4.49 0.30 5 125.10；171.10 serum 6.63 246.147 3-Hydroxydodecanedioic acid ESI+ −0.83 5.89 0.50 1 171.10；229.15 serum 7.74 274.177 3-Hydroxytetradecanedioic acid ESI+ −0.86 9.84 0.42 4 171.10；239.16 serum 8.95 302.208 5-Hydroxyhexadecanedioic acid ESI+ −0.81 2.25 0.38 4 171.10；285.21 serum 0.84 180.063 Glucose* ESI− 0.64 1.38 1.72 2 45.00；59.01；
89.03serum 1.05 90.032 Lactic acid ESI− 0.71 8.62 1.48 3 43.02；71.01 serum 5.51 218.115 3-Hydroxydecanedioic acid ESI− −0.77 2.51 0.40 2 69.03；119.03；
158.24serum 5.91 188.104 Azelaic acid* ESI− −0.68 8.53 0.31 3 125.10；143.86；
169.08serum 6.60 202.120 Sebacic acid* ESI− −0.67 2.10 0.29 1 139.12；183.10 serum 6.64 246.147 3-Hydroxydodecanedioic acid ESI− −0.79 5.51 0.51 2 57.04；125.10；
187.10serum 7.25 216.136 Undecanedioic acid* ESI− −0.69 2.01 0.27 1 153.13；197.11 serum 8.95 302.209 5-Hydroxyhexadecanedioic acid ESI− −0.79 1.86 0.38 1 71.05；153.12；
197.12serum 8.66 372.267 Cervonoyl ethanolamide ESI+ 0.51 2.61 2.16 1 107.09；159.12；
173.13；337.25feces 9.35 356.272 Tetracosahexaenoic acid ESI+ 0.52 2.17 1.67 1 107.09；187.15；
247.17feces 9.39 392.293 7，12-Dihydroxycholanoic acid ESI− 0.57 3.85 1.47 1 345.28；373.26 feces 10.06 392.293 Chenodeoxycholic acid* ESI− 0.63 7.53 3.54 1 354.07；373.26 feces 8.65 408.290 Cholic acid* ESI− 0.57 10.72 3.04 6 95.05；251.20；
289.22；343.27feces 10.26 392.293 Deoxycholic acid* ESI− 0.71 8.40 1.61 1 327.27；345.28；
355.27；373.26feces *表示与标准品进行比对过的化合物。
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