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DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响

刘艳红 赵祥月 谢青昕 普梦笛 鲁卫东

刘艳红, 赵祥月, 谢青昕, 普梦笛, 鲁卫东. DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(3): 1-4. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210302
引用本文: 刘艳红, 赵祥月, 谢青昕, 普梦笛, 鲁卫东. DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响[J]. 昆明医科大学学报, 2021, 42(3): 1-4. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210302
Yan-hong LIU, Xiang-yue ZHAO, Qing-xin XIE, Meng-di PU, Wei-dong LU. Influence of DC-Chol Cationic Liposome Adjuvant on the Immune Effect of Tetravalent Influenza Vaccine[J]. Journal of Kunming Medical University, 2021, 42(3): 1-4. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210302
Citation: Yan-hong LIU, Xiang-yue ZHAO, Qing-xin XIE, Meng-di PU, Wei-dong LU. Influence of DC-Chol Cationic Liposome Adjuvant on the Immune Effect of Tetravalent Influenza Vaccine[J]. Journal of Kunming Medical University, 2021, 42(3): 1-4. doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210302

DC-Chol阳离子脂质体佐剂对流感疫苗免疫效果的影响

doi: 10.12259/j.issn.2095-610X.S20210302
基金项目: 云南省生物医药重大科研专项基金资助项目(2018ZF006)
详细信息
    作者简介:

    刘艳红(1995~),女,云南大理人,在读硕士研究生,主要从事颗粒型疫苗佐剂研究工作

    通讯作者:

    鲁卫东,E-mail:13064244163@163.com

  • 中图分类号: R392

Influence of DC-Chol Cationic Liposome Adjuvant on the Immune Effect of Tetravalent Influenza Vaccine

  • 摘要:   目的  观察阳离子脂质体DC-Chol修饰的四价流感疫苗的免疫原性。  方法  采用薄膜分散结合冻融-冻干法制备DC-Chol脂质体,检测其包封率。将小鼠分为七组,为DC-Chol脂质体疫苗组(250 µg/只、500 µg/只、750 µg/只、900 µg/只)、PBS组、中性脂质体组、疫苗原液组(n = 3),通过MTT法确定DC-Chol脂质体的最佳剂量。将小鼠分为四组,DC-Chol脂质体组、疫苗原液组、中性脂质体组以及PBS对照组,腹腔免疫小鼠,于第7天、14天、28天处死,MTT法和T淋巴细胞表面标记实验检测小鼠淋巴细胞增殖情况观察免疫原性。  结果  MTT实验表明,DC-Chol修饰脂质体的最佳用量为500 µg/鼠(P < 0.05);T淋巴细胞表面标记实验显示,DC-Chol 阳离子脂质体能明显增强脾淋巴细胞数(P < 0.05)。  结论  与中性脂质体相比,DC-Chol 阳离子脂质体作为四价流感疫苗的佐剂具有良好的免疫增强作用。
  • 接种疫苗被认为是世界范围内预防感染最经济的措施。一种有效的佐剂对于提高疫苗接种效率是非常必要的。脂质体是磷脂双分子层包裹水相而构成的类球状微囊,按电荷性质可分为中性脂质体、阴离子脂质体和阳离子脂质体[1]。其中阳离子脂质体比阴离子和中性脂质体更有效,可延长在注射部位抗原的停留时间,增加抗原提呈,并诱导更强的免疫反应[2-4]

    DC-Chol(3β-[N-(N′ ,N′ -二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基])是胆固醇衍生物,含有一个叔胺基团。DC-Chol毒性相对较小[5],通常与脂质二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)结合使用[6-7]。胆固醇是经典脂质体配方的主要成分,被阳离子衍生物(DC-Chol)取代,形成PLUSCOM[8],可有效吸附抗原[9-10]。ISCOMs作为佐剂,以多种方式增强免疫反应,通过抗原提呈细胞对微粒优先摄取,PLUSCOM在诱导抗原特异性CD8 T细胞反应方面与经典ISCOMs一样有效[11]

    本研究以四价流感病毒裂解疫苗原液作为模型药物,探讨DC-Chol修饰脂质体作为载体对该疫苗的免疫增强效果。研究中选择市售疫苗原液和PBS作为对照组,比较DC-Chol脂质体作为疫苗佐剂的免疫增强效果。同时还对DC-Chol脂质体中DC-Chol用量与免疫原性的量效关系进行了初步研究,为阳离子脂质体佐剂的开发奠定基础。

    1.1.1   流感疫苗

    均由江苏沃森生物技术有限公司提供。H1N1批号SA2018002,H3N2批号SB2018002,B(V)批号SC2018001,B(Y)批号SC22018006。

    1.1.2   实验动物

    SPF级昆明种小鼠,雌性,6~8周龄,体重18~22 g,由昆明医科大学实验动物中心提供[合格证号为SCXK9(滇)2005-0008]。

    1.1.3   主要试剂

    大豆卵磷脂(北京美亚斯磷脂技术公司);胆固醇(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司);DC-Cholesterol(Avanti Polar Lipids,USA);MTT(北京博奥拓达科技有限公司);Anti-mouse CD4 PE、Anti-mouse CD8a FITC(eBioscience,USA)。

    1.2.1   DC-Chol脂质体的制备

    采用薄膜分散法和冻融-冻干法[12]。将胆固醇(80 mg)和大豆磷脂(300 mg)溶于无水乙醇,减压旋转成膜;在水化的脂质体混悬液中加入DC-Chol水浴静置,加入一定量流感疫苗原液,制备脂质体冻干粉。

    1.2.2   DC-Chol脂质体包封率检测

    高速离心取上清液,通过Lowry蛋白法[12]计算包封率。

    1.2.3   DC-Chol脂质体量效关系研究

    小鼠随机分为七组,每组3只,不同剂量DC-Chol脂质体组(250、500、750、900 μg/只)、PBS组、疫苗原液组、中性脂质体组,抗原剂量为6 μg/只。腹腔免疫后第7天处死,通过MTT法[13]测定刺激指数(SI)确定最佳DC-Chol剂量。

    1.2.4   DC-Chol脂质体细胞免疫原性研究

    在方法1.2.3确定最佳用量的基础上制备脂质体进行免疫实验。小鼠随机分为PBS组、疫苗原液组、中性脂质体组、DC-Chol 脂质体组,每组9只,腹腔免疫,于第7天、14天、28天处死,MTT方法检测各组SI值,流式细胞术检测T淋巴细胞表面标记。

    采用SPSS17.0软件进行统计分析,多组间比较通过单因素方差分析,以P < 0.05 为差异有统计学意义。

    蛋白含量测定的标准曲线为Y = 0.0032X - 0.0009,相关系数R2 = 0.9984,在10~100 μg/mL 范围内有良好线性关系。DC-Chol流感疫苗脂质体包封率结果,见表1

    表  1  不同含量的DC-Chol阳离子脂质体的包封率
    Table  1.  Encapsulation efficiency of DC-Chol cationic liposomes with different contents
    DC-Chol含量(µg/鼠)包封率(%)
    25059.17
    50070.44
    75068.78
    90068.78
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    检测结果显示,与PBS组、疫苗原液组相比较,剂量分别为250、500、750、900 μg的DC-Chol组差异有统计学意义(P < 0.05),表明DC-Chol脂质体有较好的免疫原性,见图1;500、750、900 μg组三个剂量组间比较差异无统计学意义(P > 0.05),选择500 µg/鼠为DC-Chol修饰脂质体疫苗的最佳用量。

    图  1  不同剂量DC-Chol 7 d时的SI
    与PBS比较,*P < 0.05;与原液比较,#P < 0.05。
    Figure  1.  SI of different doses of DC-Chol on 7 d
    2.3.1   脾淋巴细胞增殖实验

    DC-Chol脂质体组与中性脂质体组、疫苗原液组、PBS组比较差异有统计学意义(P < 0.05),且SI值高于各组,说明DC-Chol阳离子脂质体能有效刺激脾淋巴细胞增殖,产生较早较强的免疫原性,增强细胞免疫,见图2。DC-Chol脂质体组7 d时刺激小鼠脾淋巴细胞增殖的强度最大,诱导细胞免疫的水平最高,但其14~28 d SI值稍有上升,说明抗原刺激机体时产生的抗体不会一直存在于机体中,部分会通过以代谢或排泄的方式排出体外,但仍然有细胞免疫原性的存在即记忆细胞。

    图  2  一个免疫周期的SI
    与PBS比较,*P < 0.05;与原液比较,#P < 0.05。
    Figure  2.  SI of an immune cycle
    2.3.2   T淋巴细胞表面标记实验

    图3可知,DC-Chol脂质体组与中性脂质体组、疫苗原液组、PBS组比较差异有统计学意义(P < 0.05),说明DC-Chol阳离子脂质体可增强细胞免疫;免疫相同周期时,DC-Chol组28 d与14 d的CD4+/CD8+值进行比较差异有统计学意义(P < 0.05),随着时间的延长,DC-Chol修饰的脂质体疫苗对脾淋巴细胞的刺激强度增加,有延长免疫时间的作用。

    图  3  14 d、28 d时 CD4+/CD8+比值
    与PBS比较,*P < 0.05;与原液比较,#P < 0.05。
    Figure  3.  CD4+/CD8+ on 4 d 28 d

    阳离子脂质体已成为新一代的疫苗佐剂和给药系统。Yifan Ma[14]通过制备不同表面电荷密度的阳离子脂质体,作用于C57小鼠,采用 ELISA方法和流式细胞术发现阳离子脂质体能诱导更强的免疫反应,证实了阳离子脂质体的免疫调节作用主要是由于其表面电荷密度,而不是阳离子脂质体的浓度。Brunel等[15]将DC-Chol用于乙型肝炎疫苗,结果表明DC-Chol具有免疫调节作用,能诱导BALB/c小鼠的Th1和Th2型免疫反应。Rui等[16]开发了一种由肺炎球菌表面蛋白a和阳离子DC-Chol脂质体组成的肺炎球菌鼻腔疫苗,用小鼠肺炎链球菌感染模型验证了该疫苗的有效性。DC-Chol脂质体能同时诱导体液免疫和细胞免疫,诱导产生IgGl和IgG2a;DC-Chol脂质体还能诱导粘膜免疫[17-18]。阳离子脂质体能够运载不同种类的药物或作为疫苗载体,且到目前人们仍然不断开发其应用潜力。阳离子脂质体的毒性在一定程度上限制了它的应用,未来需要更加深入研究其结构和作用机制,设计出更加低毒高效的阳离子。

    本实验中制备的DC-Chol脂质体疫苗包封率均在50% 以上。选择PBS、市售流感疫苗原液以及中性脂质体作为对照组,在一个免疫周期内DC-Chol脂质体的SI值始终高于其他组,提示 DC-Chol流感疫苗脂质体冻干粉在体内可产生细胞免疫,延长免疫时间,具有明显的佐剂效果。该实验为今后研究DC-Chol脂质体佐剂提供了初步参考,未来还需对其作用机制和安全性方面深入研究。

  • 图  1  不同剂量DC-Chol 7 d时的SI

    与PBS比较,*P < 0.05;与原液比较,#P < 0.05。

    Figure  1.  SI of different doses of DC-Chol on 7 d

    图  2  一个免疫周期的SI

    与PBS比较,*P < 0.05;与原液比较,#P < 0.05。

    Figure  2.  SI of an immune cycle

    图  3  14 d、28 d时 CD4+/CD8+比值

    与PBS比较,*P < 0.05;与原液比较,#P < 0.05。

    Figure  3.  CD4+/CD8+ on 4 d 28 d

    表  1  不同含量的DC-Chol阳离子脂质体的包封率

    Table  1.   Encapsulation efficiency of DC-Chol cationic liposomes with different contents

    DC-Chol含量(µg/鼠)包封率(%)
    25059.17
    50070.44
    75068.78
    90068.78
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  • 收稿日期:  2020-12-10
  • 刊出日期:  2021-04-09

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