Antibacterial Effect of Slightly Acidic Electrolyzed Water on Enterococcus faecalis Biofilm in Root Canal in Vitro
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摘要:
目的 研究微酸性电解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）作为根管冲洗液对根管内粪肠球菌（Enterococus faecalis，E. faecalis）生物膜的抗菌作用。 方法 离体牙根管内培养E.f生物膜，以1%次氯酸钠（sodium hypochlorite，NaClO）溶液为阳性对照，分别用浓度为50 mg/L、60 mg/L的SAEW冲洗1 min、3 min、5 min，扫描电镜（field emission scanning electron microscope，FE-SEM）观察E.f生物膜形态变化，共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）结合Live/Dead荧光染色观察E.f生物膜荧光染色情况并测定生物膜死菌比例。 结果 FE-SEM观察：50 mg/L及60 mg/L的SAEW、1% NaClO溶液随着冲洗时间的延长，生物膜中细菌减少，菌体皱缩破裂。CLSM观察：50 mg/L及60 mg/L的SAEW、1% NaClO溶液随着冲洗时间的延长，红色荧光增多，死菌比例逐步增高，三个时间点间比较差异有统计学意义（P < 0.05）；1% NaClO溶液冲洗1 min、3 min、5 min的死菌比例高于50 mg/L及60 mg/L的SAEW，差异有统计学意义（P < 0.05）。 结论 50 mg/L、60 mg/L的SAEW对根管内E. faecalis生物膜有一定的抗菌作用，但弱于1% NaClO溶液。 Abstract:Objective To study the antibacterial effect of slightly acidic electrolyzed water （SAEW） as root canal irrigation on Enterococus faecalis （E. faecalis） biofilm in root canal in vitro. Methods E. faecalis biofilms were cultured in the root canals of isolated teeth and washed with SAEW at concentrations of 50 mg/L and 60 mg/L for 1 min, 3 mins, and 5 mins, respectively, the 1% NaClO solutions was used as positive controls. The field emission scanning electron microscope （FE-SEM） was used to observe E. faecalis biofilm morphological changes, the confocal laser scanning microscope （CLSM） combined with Live/Dead fluorescence staining was used to observe the E. faecalis biofilms and analyze the proportion of dead bacteria in the biofilms. Results FE-SEM observation: 50 mg/L SAEW, 60 mg/L SAEW, 1% NaCl Osolutions with increasing washing time, E.faecalis in the biofilm decreased, the surface of the was rough, and the cells shrank. Confocal laser scanning microscope （CLSM） combined with Live/Dead fluorescence staining observation: 50 mg/L SAEW, 60 mg/L SAEW, 1% NaClO solutions with increasing washing time, the red fluorescence intensity gradually increased, and the proportion of dead bacteria gradually increased （P < 0.05）, the sterilization ratio of 1% NaClO to E. faecalis at the time point of 1 min, 3 min, and 5 min was significantly higher than 50 mg/L SAEW, 60 mg/L SAEW （P < 0.05）. Conclusion Slightly acidic electrolyzed water has a certain antibacterial effect on strains in E. faecalis biofilm, but the effect is lower than 1% NaCIO solutions. -
Key words:
- Slightly acidic electrolyzed water /
- Enterococus faecalis /
- Biofilm /
- Sodium hypochlorite /
- Antibacteria
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根管内生物膜是造成根尖周感染的主要原因，根管治疗是目前治疗根尖周感染最有效的方法，根管预备是根管治疗的核心，目的是彻底去除根管壁上的感染性生物膜。粪肠球菌（Enterococus faecalis，E. faecalis）是革兰阳性兼性厌氧球菌，与持续性根尖感染有关[1]。根管预备包括机械预备和化学冲洗，后者能清理机械器械无法到达的根管峡部、侧副根管等不规则区域的生物膜。微酸性电解水（slightly acidic electrolyzed water，SAEW）是电解稀盐酸和/或氯化钠溶液制成的，具有很强的抗菌活性[2-4]，因其刺激性小已应用于食品、餐具、牙科综合治疗椅供水系统的消毒，本实验探讨微酸性电解水作为根管冲洗液对根管内E. faecalis生物膜的抗菌作用，旨在评估其在根管治疗中的应用前景。
1. 材料与方法
1.1 实验材料和仪器
E. faecalis标准株（ATCC19433，中国工业微生物菌种保藏管理中心），牛心脑浸液培养基[（brain heart infusion，BHI），广东环凯微生物科技有限公司]，水神HD-240L型次氯酸水发生器、6%的稀盐酸电解液（上海富强旺卫生用品有限公司），有效氯浓度测定器HI96771（HANNA，意大利），1%次氯酸钠溶液、17%EDTA溶液（武汉朗力生物医药武汉有限公司）、一次性使用5 mL无菌注射器（山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）、Live/Dead BacLightTM Bacterial Viability kit荧光染色剂（Invitroge公司，美国）、FEI Nova Nano SEM 450场发射扫描电子显微镜[（field emission scanning electron microscope，FE-SEM）；赛默飞公司，美国]、E300CP硬组织切片机（EXAKT公司，德国），A1激光共聚焦电子显微镜[（confocal laser scanning microscope，CLSM）；Nikon公司，日本]。
1.2 方法
1.2.1 SAEW的制取
由次氯酸水发生器生成的SAEW，在pH值为5.0～6.5条件下，经有效氯浓度测定器测定有效氯浓度（available chlorine concentration，ACC）为10～60 mg/L，制成ACC为50 mg/L、60 mg/L的SAEW备用。
1.2.2 菌液制备
将-80 ℃冻存的E. faecalis标准株（ATCC19433）划线接种至BHI琼脂培养基平板，37 ℃培养24 h，取单菌落至BHI液体培养基中，放置恒温培养箱中37 ℃培养24 h，调整菌液OD值为0.592 （波长630 nm），对应菌液密度为109 CFU/mL。
1.2.3 根管样本制备
选择年龄为14～25岁供者，因正畸减数拔除的单根前磨牙28颗。纳入标准：根尖孔发育完全，无龋坏或充填体，无牙髓、根尖周及牙周疾病。截除牙冠，保留根长10 mm。ProTaper镍钛器械预备根管至F3，配合1% NaClO溶液锉间冲洗及终末超声荡洗，17% EDTA溶液1 min去除玷污层，生理盐水冲洗。将牙根沿长轴预备两条平行纵向浅沟，121 ℃、15 MPa、15 min高温高压灭菌，牙骨质面及根尖孔涂指甲油封闭，置生理盐水中4 ℃冰箱保存备用。
1.3 E.f生物膜培养及实验分组
悬菌液密度调为108 CFU/mL，根管内注满菌液，再将其分别放入24孔板，每孔加入500 μL菌液和1 000 μL新鲜培养基，37 ℃孵育培养21 d，隔天更换新鲜BHI培养基，随机抽取1例于FE-SEM、CLSM确定感染模型构建情况。将培养3周E.f生物膜的离体牙根随机分为三组，分别为A组：50 mg/L SAEW、B组：60 mg/L SAEW、C组：1% NaClO（阳性对照），每组设3个冲洗时间（1 min、3 min、5 min），每个时间点含3个离体根管样本。
1.4 样本的处理和FE-SEM、CLSM标本制备及观察
1.4.1 样本的处理
各组离体牙根管分别用50 mg/L SAEW、60 mg/L SAEW、1% NaClO溶液冲洗1 min、3 min、5 min，冲洗注射器针头外径0.5 mm，冲洗速率1 mL/min，插入深度8 mm，缓慢匀速抽提冲洗，不同冲洗液冲洗结束后PBS冲洗。
1.4.2 FE-SEM标本的制备及生物膜形态观察
经处理的离体牙根沿根面浅沟劈成两半，其中一半用2.5%戊二醛磷酸盐缓冲液固定，乙醇梯度脱水，CO2临界点干燥仪烘干，离子溅射仪喷金，于FE-SEM下观察根管内粪肠球菌生物膜情况。
1.4.3 CLSM样本的制备和荧光染色观察
另一个半劈牙根样本加Live/Dead BacLightTM Bacterial Viability Kit荧光染色剂，37 ℃暗室孵育30 min。硬组织切片机避光切割成100 μm的薄片，封片后置CLSM下由髓腔侧至牙本质侧观察小管内生物膜荧光染色情况。自带软件分析生物膜的死菌比例：每个切片随机取3个视野，计算每个视野内红色荧光（死菌）总量/（绿色荧光（活菌）总量 + 红色荧光总量）。
1.5 统计学处理
统计结果采用SPSS 24.0软件，所有数据以（
${{\bar x}} \pm {{s}}$ ）表示，三组各指标在不同时间点的差异性分析采用重复测量方差分析，若存在统计学差异，则采用LSD法进行事后两两比较，P < 0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 生物膜模型观察
3周E. faecalis生物膜FE-SEM下观察见大量E. faecalis聚集在根管牙本质表面呈链状排列。CLSM观察以绿色荧光为主，少量红色荧光，且侵入牙本质小管内300～500 nm，见图1。
图 1 培养3周的E. faecalis生物膜FE-SEM及CLSM下观察a：FE-SEM，× 10000倍；b：FE-SEM，× 50000倍；c：CLSM，× 228倍，绿色：活菌，红色：死菌，标尺为100 μm，P为髓腔侧，D为牙本质侧。Figure 1. Observation under FE-SEM and CLSM of E. faecalis biofilm for 3 weeks2.2 FE-SEM观察
各实验组及对照组冲洗后E. faecalis生物膜细菌均减少，且细菌皱缩、破裂并可见细菌溶解及碎片，破坏的程度随冲洗时间的延长加重，1% NaClO冲洗3 min、5 min后菌体完全溶解，见图2。
图 2 50 mg/L SAEW、60 mg/L SAEW、1% NaClO冲洗不同时间后E. faecalis生物膜FE-SEM观察A：50 mg/L SAEW组；B：60 mg/L SAEW组；C：1% NaClO组；1：冲洗1 min；2：冲洗3 min；3：冲洗5 min；a：× 10 000倍，b：× 50000倍。Figure 2. FE-SEM observation of E. faecalis biofilms washed with 50 mg/L SAEW，60 mg/L SAEW and 1% NaClO at different times2.3 CLSM观察
荧光染色情况：各组冲洗液冲洗不同时间后，绿色荧光逐渐减少，红色荧光逐渐增多，见图3。
图 3 50 mg/L SAEW、60 mg/L SAEW、1% NaClO冲洗不同时间后CLSM荧光染色情况（CLSM，×228倍，A：50 mg/L SAEW组、B：60 mg/L SAEW组、C：1% NaClO组；1：冲洗1 min、2：冲洗3 min、3：冲洗5 min；绿色：活菌，红色：死菌，标尺为100 μm，P为髓腔侧，D为牙本质侧）Figure 3. E.f biofilm fluorescence staining after washed with 50 mg/L SAEW，60 mg/L SAEW and 1% NaClO at different times死菌比例：实验组及对照组冲洗3个时间点间差异有统计学意义（P < 0.05）。冲洗1 min、3 min、5 min时，50 mg/L、60 mg/L SAEW与1% NaClO间、50 mg/L SAEW与60 mg/L SAEW间差异有统计学意义（P < 0.05）；同时1% NaClO在各时间点的死菌比例均高于50 mg/L及60 mg/L SAEW（P < 0.05），见表1。
表 1 不同冲洗液冲洗不同时间后的死菌比例[n = 9，（${{\bar x}} \pm {{s}}$ ）%]Table 1. Proportion of dead bacteria washed with different washing solutions at different times [n = 9，（${{\bar x}} \pm {{s}}$ ）%]冲洗时间 50 mg/L SAEW 60 mg/L SAEW 1% NaClO 1 min 39.33 ± 2.21*#○▲ 40.90 ± 1.84*#□ 47.41 ± 2.52*# 3 min 44.44 ± 1.64△○▲ 50.66 ± 1.61△□ 55.10 ± 3.31△ 5 min 52.39 ± 1.85○▲ 60.84 ± 2.23□ 63.57 ± 1.52 注：*表示各组1 min与3 min比较，P < 0.05；#表示各组1 min与5 min组比较，#P < 0.05；△表示各组3 min与5 min组比较，△P < 0.05；○表示50 mg/L SAEW与对照组比较，○P < 0.05；□表示60 mg/L SAEW与对照组比较，□P < 0.05；▲表示50 mg/L SAEW与60 mg/L SAEW比较，▲P < 0.05。 3. 讨论
E. faecalis具有在苛刻条件形成生物膜的能力[5]，被认为是感染根管中的最难根除的细菌之一，本研究用E. faecalis构建根管内生物膜，E. faecalis可附着于牙本质小管表面且侵入小管内300～500 nm，与Haapasalo报道[6]一致，表明体外成功建立根管内感染模型。研究表明临床常用根管冲洗液1% NaClO能够有效抑制粪肠球菌[7]，故本研究中把1% NaClO作为阳性对照。有学者研究实验表明50 mg/L的SAEW具有较好的抗菌作用[8]，HD-240L次氯酸水生成器能生成最高浓度60 mg/L的SAEW，所以选择了50 mg/L、60 mg/L的SAEW作为实验组。
SAEW的有效氯化合物为97%次氯酸（hypochlorous acid，HClO），其抗菌作用依赖于HClO，可抑制胞膜运输能力，破坏胞膜及DNA，抑制增殖所必须酶的活性[9]。NaClO的有效成分是未解离的HClO[10]，与SAEW一致，且SAEW中HClO的浓度高于NaClO[11]，但NaClO的独特高渗性使NaClO的细胞溶解力和抗菌作用更强[12]，也使NaClO刺激性更强，SAEW因较小的刺激性[13]和抗菌能力使其有替代NaClO的可能，已有研究将SAEW用于根管冲洗[14]。
本研究结果显示：FE-SEM观察结果表明各组冲洗液对生物膜破坏程度随冲洗时间延长而增加，50 mg/L、60 mg/L的SAEW冲洗5 min时生物膜均破裂变形，但在各时间点生物膜破坏程度都弱于1% NaClO，1% NaClO冲洗3 min、5 min时细菌完全溶解。CLSM结果显示：各实验组不同冲洗时间的死菌比例均小于1% NaClO （P < 0.05），且随冲洗时间延长，死菌比例逐步增高（P < 0.05），表示SAEW的抗菌作用随时间增强；在冲洗1 min、3 min、5 min时，1% NaClO杀菌作用强于50 mg/L及60 mg/L的SAEW （P < 0.05），说明在SAEW对E.f生物膜有一定抗菌作用，但弱于1% NaClO溶液，且抗菌作用随着冲洗时间延长而增强，与Hao研究一致[8]。因SAEW具有良好生物相容性和抗菌能力，可建议其在不能放置橡皮幛、根尖孔闭合不全、根尖孔粗大及在治疗易过敏体质患者的情况下，可尝试替代1% NaClO。本研究建立的为单一菌种感染模型，且仅观察了根管壁表面生物膜情况，无法模拟临床实际情况，未对牙本质小管深部生物膜观察，故SAEW对与多种菌种生物膜的抗菌效果仍有待研究，并延长观察时间。应该强调的是，与大多数体外研究一样，目前的发现仍有待临床证实。
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图 1 培养3周的E. faecalis生物膜FE-SEM及CLSM下观察
a：FE-SEM，× 10000倍；b：FE-SEM，× 50000倍；c：CLSM，× 228倍，绿色：活菌，红色：死菌，标尺为100 μm，P为髓腔侧，D为牙本质侧。
Figure 1. Observation under FE-SEM and CLSM of E. faecalis biofilm for 3 weeks
图 2 50 mg/L SAEW、60 mg/L SAEW、1% NaClO冲洗不同时间后E. faecalis生物膜FE-SEM观察
A：50 mg/L SAEW组；B：60 mg/L SAEW组；C：1% NaClO组；1：冲洗1 min；2：冲洗3 min；3：冲洗5 min；a：× 10 000倍，b：× 50000倍。
Figure 2. FE-SEM observation of E. faecalis biofilms washed with 50 mg/L SAEW，60 mg/L SAEW and 1% NaClO at different times
图 3 50 mg/L SAEW、60 mg/L SAEW、1% NaClO冲洗不同时间后CLSM荧光染色情况
（CLSM，×228倍，A：50 mg/L SAEW组、B：60 mg/L SAEW组、C：1% NaClO组；1：冲洗1 min、2：冲洗3 min、3：冲洗5 min；绿色：活菌，红色：死菌，标尺为100 μm，P为髓腔侧，D为牙本质侧）
Figure 3. E.f biofilm fluorescence staining after washed with 50 mg/L SAEW，60 mg/L SAEW and 1% NaClO at different times
表 1 不同冲洗液冲洗不同时间后的死菌比例[n = 9，（
${{\bar x}} \pm {{s}}$ ）%]Table 1. Proportion of dead bacteria washed with different washing solutions at different times [n = 9，（
${{\bar x}} \pm {{s}}$ ）%]冲洗时间 50 mg/L SAEW 60 mg/L SAEW 1% NaClO 1 min 39.33 ± 2.21*#○▲ 40.90 ± 1.84*#□ 47.41 ± 2.52*# 3 min 44.44 ± 1.64△○▲ 50.66 ± 1.61△□ 55.10 ± 3.31△ 5 min 52.39 ± 1.85○▲ 60.84 ± 2.23□ 63.57 ± 1.52 注：*表示各组1 min与3 min比较，P < 0.05；#表示各组1 min与5 min组比较，#P < 0.05；△表示各组3 min与5 min组比较，△P < 0.05；○表示50 mg/L SAEW与对照组比较，○P < 0.05；□表示60 mg/L SAEW与对照组比较，□P < 0.05；▲表示50 mg/L SAEW与60 mg/L SAEW比较，▲P < 0.05。 
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