东莨菪碱（Scopolamine）是一种莨菪烷型生物碱，为曼陀罗、天仙子、颠茄等茄科有毒植物中的主要毒性成分，为临床常用的抗胆碱药物，具有解痉、麻醉镇痛、止咳、平喘等作用，过量使用出现口干、头晕、乏力、烦躁等症状，严重者出现昏迷，呼吸衰竭死亡^[1]。法医学实践中，因误食曼陀罗种子、饮用药酒过量等意外所致的中毒事件较为多见。近年来，利用曼陀罗类植物饮料进行麻醉抢劫或投毒的案件日益增多^[2-3]。目前，针对东莨菪碱毒理学方面的研究主要集中于外周抗胆碱能作用机制和对大小鼠的学习记忆功能的影响^[4]，而对中枢神经的毒理作用机制研究却很少。因此，本课题重点研究东莨菪碱的内源性物质的代谢，为临床诊治和法医学鉴定提供一定依据。

1.   材料与方法

1.1   药品与试剂

氢溴酸东莨菪碱（纯度 > 99%，批号：BBC20181009，上海卡努生物有限公司）；甲基三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺[N-methyl-N-（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，MSTFA]（色谱纯，批号：BCCC1274，上海西格玛—奥尔德里奇贸易有限公司）；甲酰胺氢氧化物（色谱纯，批号：E1507071，中国阿拉丁工业公司）；吡啶（色谱纯，批号：LM80T49，中国强生）；乙腈（色谱纯，批号：I1043930935，美国Merck公司）；己烷、异丙醇（色谱纯，批号：20161228，中国ANPEL公司）；肉豆蔻酸-d27（色谱纯，批号：I1-11978，美国CIL公司）。

1.2   仪器

7890A-5975C MSD气相色谱-质谱（美国Agilent）；DBS-MS色谱柱 30 m×250 μm×0.25 μm（美国安捷伦科技公司）；LEICA正置显微镜（德国LEICA公司）；XW-80A涡旋仪（上海沪西）；Milli-Q Gradient A10纯水仪（美国Merck公司）；EPPENDORF 5415R低温高速离心机（德国艾本德公司）；BF2000 氮气吹干仪（北京八方世纪科技有限公司）；Agilent Chrom Station Software（美国安捷伦科技公司）。

1.3   实验动物

SD大鼠（SPF级）40只，雌雄各半，体质量190～220 g，购自昆明医科大学动物实验部［动物合格证：SCXK（滇）K2015-0002］。

1.4   方法

1.4.1   中毒大鼠模型

实验组大鼠分高、中、低3个剂量组，依据氢溴酸东莨菪碱经口半数致死量LD₅₀（1270 mg/kg），本研究在1/6LD₅₀-1/10LD₅₀^[5]范围内探索给药量，获得3个剂量组给药量分别为1/8LD₅₀（158.75 mg/kg）、1/12LD₅₀（105.83 mg/kg）和1/16LD₅₀（79.38 mg/kg）。

（1） 给药液的制备：用纯水溶解氢溴酸东莨菪碱并配制成浓度15.875 mg/mL、10.583 mg/mL和7.938 mg/mL的溶液。

（2）动物实验： 适应性饲养5 d，饲养环境如下：饲育温度（23±2） ℃，湿度（50 ±10）%，光照/黑暗12 h交替，自由饮水进食。所有实验均获得昆明医科大学伦理委员会批准并严格按规定执行。SD大鼠40只，随机分成4个组，即高剂量组、中剂量组、低剂量组和对照组，每组10只，3个给药组分别按前述剂量灌胃给药，对照组大鼠灌胃等体积生理盐水；每天定时给药，连续灌胃给药30 d。

（3） 样本采集 第30天灌胃结束后随即采集尾静脉血（1 mL），4 ℃离心5 min，3 000 r/min；代谢笼收集大鼠尿液（1.5 mL），4 ℃离心 5 min，13 000 r/min；均取上清置于-80 ℃冰箱保存，供代谢组学检测。血液、尿液采集完毕后，乙醚麻醉，断颈处死大鼠，迅速提取脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、睾丸等脏器放入10%甲醛中固定，供病理学检验。

1.5   代谢组学检测

1.5.1   样品制备

待测样品制备 分别准确量取各组大鼠血液和尿液样本各20 μL，依次加入15 μL（3 mg/mL）肉豆蔻酸-d27溶液和1 000 μL乙腈/异丙醇/纯水（3/3/2，V∶V），涡旋1 min；13 000 r/min，4 ℃离心5 min后，取800 μL上清液用氮气吹干得到残渣后进行衍生化处理[加入20 μL（40 mg/mL）甲氧胺氢氧化物/吡啶于残渣中，30 ℃衍生90 min；再加入1%TMCS的MSTFA 90 μL，37 ℃衍生30 min后，4 ℃离心5 min，1 3000 r/min，取60 μL上清液上机检测]。

质控样品制备 从制备的待测样品中取等量体积混匀成一个大样本，再均分成11个质控样本进行仪器精密度和稳定性监控。

1.5.2   GC-MSD分析条件

（1）色谱条件 柱温：60 ℃（保持1 min）—10 ℃/min升至300 ℃（保持10 min）；进样口温度：250 ℃；MSD接口温度：250 ℃；分流比：20∶1；柱流量：1.1 mL/min；进样量：1 μL。（2）质谱条件 离子源温度：250 ℃；四级杆温度：150 ℃；溶剂延迟：5.9 min；质量范围：50～500 m/z。

1.6   病理学检验

1.6.1   石蜡切片制作

将甲醛固定后的大鼠脑、心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、睾丸等脏器组织块，经流水冲洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、漂片后制成石蜡切片，HE染色后进行形态学观察。

1.6.2   图像采集

采用LEICA正置显微镜进行图像采集。

1.7   统计学处理

1.7.1   数据预处理

采用安捷伦色谱工作站软件将原始数据转换成通用（NetCDF）格式。在R软件平台下，采用Erah程序包进行峰的识别和筛选，得到定性定量矩阵，应用Golm代谢数据库（golm metabolome database，GMD）进行数据谱图比对，得到定性可视化矩阵。

1.7.2   数据分析

分析对照组和给药组代谢物色谱图的变量矩阵数据，利用PCA模式绘制出反映组间离散程度的得分图 （Score plot）。通过OPLS分析，获得S-plot图，显示离子对离散趋势贡献程度，结合变量重要性投影（Variable importance in the projection，VIP）值，默认 VIP > 1的变量具有显著性差异。再采用T-test检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   质量控制

11个质控样本总离子流图可以重叠在一起，表明仪器精密度和稳定性良好，见图1。

图  1  质量控制图

A：血清质控叠图；B：尿液质控叠图。

Figure  1.  Quality control plot

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2.2   主成分分析

从PCA得分图中看到：与对照组相比，各给药剂量组血清和尿液代谢轮廓均能够分离，见图2。

图  2  PCA得分图

A-C：血清高、中、低剂量组；D-F：尿高、中、低剂量组(红色 + 表示实验组，蓝色△表示对照组）。

Figure  2.  PCA score plot

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2.3   偏最小二乘法分析

在PLS-DA得分图中，与对照组相比，各给药剂量组血清和尿液代谢轮廓均能够分离，见图3。

图  3  PLS-DA得分图

A-C：血清高、中、低剂量组；D-F：尿液高、中、低剂量组(红色 + 表示实验组，蓝色△表示对照组）。

Figure  3.  PLS score plot

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2.4   差异代谢物筛选

血清和尿液中共筛选出17种差异代谢物，其中血清有6种代谢物，尿液中11种，见表1。

表  1  基于GC/MSD鉴定出的差异代谢物

Table  1.  Differential metabolites identified based on GC/MSD

VIP	p	保留时间（min）	差异代谢物	含量变化
1.069	0.00018	12.9127	谷氨基酸a	上调
1.321	0.00092	8.1161	脯氨酸a	上调
1.750	0.0032	7.089	肌氨酸a	上调
1.195	0.044	14.5296	阿拉伯糖b	上调
1.765	0.035	15.414	海藻糖b	上调
1.091	0.00037	7.3244	甘氨酸b	上调
2.817	0.0091	9.1619	苯甲酸b	上调
1.506	0.021	13.2456	苏糖酸b	上调
1.131	0.043	14.8624	核糖b	上调
1.432	0.015	15.4708	乌头酸b	上调
1.109	0.032	16.7069	葡萄糖酸-1,4-内酯b	上调
2.262	0.052	17.6797	半乳糖酸b	上调
2.533	0.044	19.1467	尿酸b	上调
1.729	0.049	15.0794	3-羟基吲哚b	上调
1.738	0.000016	10.7899	丙氨酸a	下调
3.329	0.0062	9.0327	尿素a	下调
4.453	0.0087	9.6232	磷酸a	下调
注：a血清；b尿液。

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2.5   代谢通路筛选

代谢通路分析共找到具有显著性影响的9条差异代谢通路，结合东莨菪碱的毒性作用，最终筛选出3条毒性相关代谢通路，分别为丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸代谢（C00041：丙氨酸，C00049：天门冬氨酸，C00022：丙酮酸，C00025：谷氨酸，C00064：谷氨酰胺，C00122：富马酸）、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢（C00188：苏氨酸，C00037：甘氨酸，C00213： 肌氨酸，C00258：甘油酸，C00065：丝氨酸，C00022：丙酮酸）、谷氨酰胺-谷氨酸代谢（C00064：谷氨酰胺，C00025：谷氨酸）。每个数字代表KEGG中代谢产物的编码，突出显示的是本研究中检测到的代谢物，见图4。

图  4  代谢通路联络图

A ：丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢；B： 甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢；C： 谷氨酰胺-谷氨酸代谢。

Figure  4.  Metabolic pathwayplot

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2.6   病理学检验

与对照组比较，高、中、低3个剂量给药组均可见海马神经细胞变性，核固缩深染，轴突消失，细胞变圆，间质水肿，小血管周围管状炎细胞浸润，其余组织未见明显异常，见图5。

图  5  大鼠脑的病理学检验（×400，HE）

A高剂量组；B中剂量组；C低剂量组；D对照组。

Figure  5.  Pathological examination of rat brain （×400，HE）

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3.   讨论

本研究成功建立了东莨菪碱大鼠长期中毒模型。以P < 0.05为筛选条件，从给药组大鼠血清中共筛选出6种差异代谢物，与对照组相比，谷氨酸、脯氨酸和肌氨酸含量上调，丙氨酸和尿素等含量下调；从给药组尿液中共筛选出11种差异代谢物，其中海藻糖、甘氨酸、3-羟基吲哚含量上调，且上述差异代谢物的上调或下调呈现剂量关系，随着给药量的增加，变化越加显著。血液中谷氨酸的上调，尿液中甘氨酸含量的上调，可能与神经递质由突触间隙向外自由扩散的清除方式有关^[6]。上述差异代谢物涉及9条代谢通路；结合病理学检验结果：3个给药组大鼠海马组织均出现神经细胞变性，核固缩深染，轴突消失，间质水肿，小血管周围管状炎细胞浸润等病变，笔者考虑东莨菪碱的毒性作用靶器官主要为神经系统，东莨菪碱可能主要通过扰乱丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸代谢、甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢、谷氨酰胺-谷氨酸代谢等3条代谢通路，导致氨基酸代谢紊乱，致使氨基酸类神经递质含量异常而诱发神经细胞的毒性损害。

研究表明丙氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸代谢以及谷氨酰胺-谷氨酸代谢代谢通路均与中枢神经兴奋性突触传递有关^[7]。其中谷氨酸扮演着重要角色，首先谷氨酸本身是中枢神经系统重要的兴奋性神经递质，可与大脑中的离子通道受体，如N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体（AMPAR）和红藻氨酸受体结合发挥作用；其次，谷氨酸可通过三羧酸循环转化成天门冬氨酸^[8]，两者作为内源性神经递质共同参与调节海马CA1区域的兴奋性^[9]，其中谷氨酸通过与NMDAR、AMPAR和红藻氨酸受体结合发挥作用，天门冬氨酸与NMDAR结合发挥作用^[10]。钱卓等^[11]采用NR2B过量表达的转基因小鼠进行研究，发现转基因小鼠海马脑区的NMDAR通道开放时间延长，海马CA1区突触可塑性增强，NR2B转基因小鼠在多种行为学测试中表现出更好的学习和记忆能力，表明NMDAR的N-甲基-D-天冬氨酸受体2B（NR2B）亚基对海马脑区的突触可塑性和学习记忆有关，徐向华等^[12]发现东莨菪碱染毒大鼠可诱发中枢电压依赖性钾通道亚型的mRNA水平表达的变化，同时在行为学测试中表现出学习记忆障碍。上述发现均说明离子通道是决定神经元兴奋性的关键环节，并对学习记忆过程发挥着重要作用，东莨菪碱可能通过影响相关离子通道来发挥毒性作用。谷氨酸含量出现病理性升高时产生神经毒性，目前认为其神经毒性作用的分子机制有3种途径，谷氨酸通过介导钙离子内流增加、离子型NMDA谷氨酸受体亚型的媒介作用和谷氨酸介导生成的自由基增加等，无论哪种途径，最终均会介导细胞骨架结构变化并导致细胞变性坏死，同时激活细胞凋亡信号通路^[13]这与本研究中发现东莨菪碱的神经毒性作用，出现神经细胞变性等病变相吻合。

本研究发现的甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸差异代谢通路与中枢神经抑制性突触传递有关。其中甘氨酸作为抑制性神经递质与甘氨酸受体结合后发挥作用，甘氨酸受体主要分布于中枢神经系统脊髓和延髓中，控制着呼吸节律^[14-15]。东莨菪碱通过影响甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢这条通路，最终产生对呼吸中枢的兴奋效果，但关于东莨菪碱如何影响甘氨酸与其受体结合产生神经毒性的机制有待研究。综上所述，本研究结果丰富了曼陀罗和东莨菪碱的毒理学内容，为曼陀罗和东莨菪碱体内代谢与毒性关联性研究提供了实验数据。