Expression of XB130 in Hepatocellular Carcinoma and Its Effect on Cell Invasion and Migration
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摘要:
目的 探讨新型接头蛋白XB130在肝癌组织及癌旁组织中的表达情况及与组织病理之间的关系，并探索其对肝癌细胞侵袭和迁移的影响。 方法 （1）收集染色肝癌病理切片并分析；（2）筛选各肝癌细胞系HCCLM3，HepG2，SMMC-7721，Hep3B，MHCC-97中 XB130的表达情况并抑制XB130基因。采用Western blotting及RT-PCR法检测XB130的表达量；Tranwell观察细胞侵袭能力；细胞划痕观察细胞迁移能力。 结果 90例肝癌临床病理样本中，染色阳性率为44.4%（40例），在阳性染色标本中强阳性29例，中-弱阳性11例，同时研究发现临床样本中，24例为肝癌复发患者。XB130在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织（P < 0.05），肝癌中XB130表达越高，患者复发率较高，且术后生存时间越短（P < 0.05）。抑制XB130基因后其相对表达量、细胞侵袭、迁移能力均下降（P < 0.05）。 结论 XB130有望成为新的肝癌预后标志物，下调肝癌细胞XB130的表达可减弱肝癌细胞侵袭和迁移能力。 -
关键词:
- 肝癌 /
- 新型接头蛋白XB130 /
- 组织病理 /
- 细胞侵袭 /
- 细胞迁移
Abstract:Objective To investigate the expression of new adaptor protein XB130 in hepatocellular carcinoma （HCC） tissues and adjacent tissues and its relationship with histopathology, and to explore its influence on the invasion and migration of hepatocellular carcinoma cells. Methods We collected and analyzed the pathological sections of stained HCC samples. The expression of XB130 in HCC cell lines HCCLM3, HepG2, SMMC-7721, Hep3B and MHCC-97 was screened and the XB130 gene was inhibited. The expression of XB130 was detected by Western blotting and RT-PCR. Cell invasion ability was observed using Tranwell and cell migration ability was observed through cell scratches. Results Among the 90 HCC samples, the positive staining rate was 44.4% （40 cases）; among the positive staining samples, 29 cases were strongly positive and 11 cases were moderately to weakly positive. The study also found that among these samples, 24 cases were patients with recurrence. The expression of XB130 in HCC tissues was significantly higher than that in adjacent tissues （P < 0.05）. The higher the expression of XB130 in HCC, the shorter the postoperative survival time and the higher recurrence rate of patients （P < 0.05）. The relative expression level, cell invasion and migration ability of XB130 were decreased after inhibiting XB130 gene （P < 0.05）. Conclusion XB130 is expected to become a new prognostic marker of HCC. Down-regulating the expression of XB130 in HCC cells can alleviate its invasion and migration. -
Key words:
- Hepatocellular carcinoma /
- Novel adaptor protein XB130 /
- Histopathology /
- Cell invasion /
- Cell migration
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云南地处中国西南，为内陆高原地区，以山地为主，外部环境缺碘，曾是我国碘缺乏病的重灾区之一，有资料显示，1920年至1945年期间，云南患地方性甲状腺肿的患者约占总人口的20%～25%，且女性患者多于男性，山谷居民几乎全部患病[1]。我国自1979年在全国范围内实行碘缺乏病的防治工作，主要措施是在碘缺乏病区实行食盐加碘，至1992年全国有5亿人食用加碘食盐，地方性甲状腺肿率下降至7%左右。但是自1996年我国开始实行全民食盐碘化（universal salt iodination，USI）法规以来，我国居民从碘适宜状态变为碘过量状态，甲状腺疾病发病率呈上升趋势，甲状腺疾病谱也发生了很大的变化[2]，故碘与甲状腺疾病的相关性研究成为热点。本研究旨在研究甲状腺疾病与尿碘、甲功指标、年龄、性别等的相关性，探讨甲状腺疾病发生的危险因素，从而为昆明市甲状腺疾病的防治工作提供一定理论依据。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
收集2018年1月到12月至昆明市第一人民医院甘美医院内分泌科体验和门诊就诊的患者共266例。根据有无甲状腺疾病分为：无甲状腺疾病组59例，甲状腺疾病组207例。无甲状腺疾病组指：甲状腺功能及甲状腺超声均正常。甲状腺疾病组为：甲状腺功能及/或甲状腺超声异常（包括亚临床甲减、亚临床甲亢、甲减、甲亢、桥本氏甲状腺炎、甲状腺结节。其中亚临床甲减38例，亚临床甲亢12例，甲减4例，甲亢4例，桥本氏甲状腺炎并甲功正常33例，甲状腺结节89例，桥本结节并甲功正常27例）。排除标准：有甲状腺手术史，合并妊娠、糖尿病、肝肾功能异常、垂体功能减退、垂体瘤、亚急性甲状腺炎等的患者及近6个月内使用过碘造影剂或含碘药物者。此研究项目通过昆明市第一人民医院医学伦理学委员会批准，所有研究对象均已签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 尿碘检测方法
留取空腹晨尿15 mL，采用国家标准化尿碘检测方法-砷铈催化分光光度法测定尿碘[3]。
1.2.2 一般指标
由专人使用同一设备准确测量身高及体重，计算体重指数（body mass index，BMI）：体重（kg）/身高（m2），并记录年龄及性别。
1.2.3 血生化指标测定
抽取清晨空腹静脉血测甲功、肝肾功能、血脂等，TT3、TT4、FT3、FT4、TGAb及TPOAb采用放射免疫法测定，TSH采用电化学发光法测定。
1.2.4 超声检查
由有资质的超声科医师采用日本生产的飞利浦超声仪对全体受试者进行甲状腺超声检查。
1.3 统计学处理
采用SPSS17.0软件包进行相关相关统计分析。所有数据均进行正态性检验，正态分布计量用（ $\bar x \pm s$）表示，2组间比较采用t检验，非正态分布计量用中位数及M（P25，P75）表示，2组间比较采用秩和检验，计数资料采用χ2检验，甲状腺疾病的危险因素分析采用Logistic回归分析，P < 0.05具有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组间一般资料及尿碘的比较
无甲状腺疾病组与有甲状腺疾病组比较，性别、年龄、T4、TPOAb、TGAb、尿碘，差异有统计学意义（P < 0.05），其中，有甲状腺疾病组尿碘中位数（143.30 µg/L）低于无甲状腺疾病组（178.30 µg/L）。身高、体重、体重指数、FT4、T3、FT3、TSH比较，2组间差异无统计学意义（ P > 0.05），组间具有可比性，见 表1。
表 1 一般资料比较Table 1. General information of the two groups因素 无甲状腺疾病组 有甲状腺疾病组 性别（男/女） 18/41 38/169 身高（m） 1.64 ± 0.078 1.63 ± 0.068 体重（kg） 59.48 ± 10.05 59.64 ± 7.42 体重指数（kg/m2） 21.97 ± 2.30 22.50 ± 1.94 年龄（岁） 33.00（28.00，42.00） 42.00（34.00，55.00） T4（nmol/L） 92.30（80.20，112.60） 102.10（89.50，121.50） FT4（pmol/L） 14.77（13.73，16.71） 14.75（13.13，16.49） T3（nmol/L） 1.58（1.43，1.75） 1.62（1.41，1.80） FT3（pmol/L） 4.73（4.21，5.07） 4.63（4.21，5.11） TSH（mIU/L） 2.43（1.78，3.58） 2.96（1.55，5.16） TPOAb（IU/mL） 30.80（28.00，37.60） 539.30（43.10， 1300.00 ）TGAb（IU/mL） 19.00（16.00，23.20） 38.60（17.00，274.3） 尿碘（µg/L） 178.30（136.40.241.10） 143.30（89.50，212.00） 2.2 甲状腺疾病危险因素的多因素Logistic回归分析结果
以性别、年龄、T4、TPOAb、TGAb、尿碘为自变量，以是否检出甲状腺疾病为因变量，进行多因素Logistic回归分析。结果显示：年龄（OR 1.140、95%CI：1.033-1.257、P = 0.009）、尿碘（OR 0.983、95%CI：0.971-0.996、P = 0.008）及TPOAb（OR 1.018、95%CI：0.979-1.059、P = 0.020）是甲状腺疾病的独立危险因素，见表2。
表 2 甲状腺疾病危险因素的多因素Logistic回归分析结果Table 2. Multivariate logistic regression analysis of risk factors of thyroid diseases因素 B P OR 95%CI 年龄（岁） 0.131 0.009 1.140 1.033～1.257 尿碘（µg/L） −0.017 0.008 0.983 0.971～0.996 T4（nmol/L） 0.003 0.856 1.003 0.971～1.037 TPOAb（IU/mL） 0.018 0.020 1.018 0.979～1.059 TGAb（IU/mL） 0.078 0.062 1.081 0.966～1.173 性别 2.719 0.146 15.172 0.395～59.695 3. 讨论
碘是合成甲状腺激素必须的元素之一，也是引起甲状腺疾病的重要因素之一，很多研究均显示碘摄入量与甲状腺疾病的发生呈“U”字型关系，长期碘摄入不足或过量均会引起甲状腺疾病，只有适量摄入才可维持人体健康。人体里的碘主要通过肾脏和消化道排出体外，其排泄量与摄入量基本相等，而经肾脏排出的碘约占其总排出量的90%左右，所以尿碘水平可基本反映碘的摄入量，故可用尿碘浓度中位数（MUI）来作为评估人群碘营养状况的指标[4]。
本研究，单因素分析研究提示：有甲状腺疾病组与无甲状腺疾病组比较，女性发病明显高于男性，且年龄更大，血清T4、TPOAb、TGAb水平更高，差异有统计学意义（P < 0.05）。提示对于老年女性，更应该关注甲状腺疾病的发生发展，另外对于TPOAb、TGAb水平增高的人群，应该定期监测甲状腺超声及甲功变化，必要时进行及时的干预和治疗。
多因素Logistic回归分析显示：年龄、尿碘及TPOAb是甲状腺疾病的独立危险因素。其中，年龄（OR 1.140，B 0.131）和TPOAb（OR 1.018，B 0.018）与甲状腺疾病的发生呈正相关，也就是说，年龄越大或TPOAb越高，甲状腺疾病的发生风险就越高，与单因素分析结果相符；而尿碘（OR 0.983，B -0.017）与甲状腺疾病的发生呈负相关，即尿碘水平越低，更易发生甲状腺疾病，在单因素分析中，笔者也得到了有甲状腺疾病组的尿碘中位数（143.30 µg/L）低于无甲状腺疾病组（178.30 µg/L）的结论。
碘在人体的生长发育过程中起着极为重要的作用，碘缺乏病主要是因为自然环境碘缺乏导致人体碘营养不良而产生的一组疾病，低碘性甲状腺肿是最常见的表现，它是机体适应和代偿缺碘的结果[5]。儿童及妊娠妇女缺碘可造成儿童智力低下和身体发育迟缓、新生儿甲减等严重后果，而地方性克汀病是严重碘缺乏病的表现，是胚胎期和新生儿期严重缺碘与甲状腺功能低下所造成的大脑与中枢神经系统发育分化障碍的结果[6]。由于这类疾病危害巨大，故在全球范围内很多国家均进行了一系列的补碘措施来治疗和预防此类疾病的发生。就我国而言，至2000年在国家水平上已基本实现了消除碘缺乏病的阶段目标，但是随着全民补碘，碘过量的问题越来越多的引起国内外学者的关注和争论，认为与近年来甲状腺疾病高发有一定关系。中国医科大学附属第一医院在2001年完成的大规模流行病学横断面对比研究指出：碘摄入量增加主要导致了低碘地区临床甲亢发病率的一过性增加及过度补碘地区的临床甲减及亚临床甲减发病率显著增加，并使水源性高碘地区的甲状腺癌患病率增加[7]。2005年调查显示[8]，高碘甲状腺肿分布在我国11个省份，受累人口约为
3000 万人，在病情较重的乡镇中，8～10岁儿童的甲状腺肿大率超过30%。因此，在2000年及2011年，国家先后2次进行食盐加碘浓度的下调，并允许各省份根据本地区情况选择食盐加碘浓度，说明此问题也引起了国家的重视，并采取了干预措施。2012年云南省按国家要求制定了新的食盐碘含量标准，并分别于2010年（调整前）和2015年（调整后）在全省进行抽样评估，结果显示2015年儿童MUI 由2010年的289.0 µg/L下降到157.3 µg/L，从碘超适宜量水平变为碘适宜水平[9]，但自2015年后鲜有进一步的调查评估，随着食盐碘浓度下调后时间的延长，甲状腺疾病的发生率变化情况还需要进行更多的研究。TPOAb是自身免疫性甲状腺疾病（autoimmune thyroid disease，AITD）重要的自身抗体之一，它是合成甲状腺激素的关键酶。TPO表位的异常表达或TPO和TPOAb的免疫反应是引起AITD患者甲状腺细胞损伤的重要机制[10]。甲状腺自身抗体能够诱发甲状腺自身免疫紊乱，可与环境因素及遗传因素共同作用从而引起甲状腺疾病的发生[11]。我国有研究显示，高碘地区的甲状腺自身抗体阳性率显著高于碘适宜的人群[12]。王娟娟等[13]也发现AITD组的TPOAb水平高于对照组，且与尿碘水平呈正相关，提示AITD患者体内的高碘状态可能是促进疾病发生发展的重要因素之一。
本研究结果显示，尿碘、TPOAb和甲状腺疾病之间有着密切关系，低碘、TPOAb阳性均可促进甲状腺疾病的发生及发展，合理补碘对于防治甲状腺疾病的发生及发展有着重要意义；而TPOAb作为AITD的重要自身抗体之一，特别是自身免疫性甲状腺炎（autoimmune thyroiditis，AIT）最敏感的抗体，在疾病早期具有重要的诊断意义，而怎样在亚临床阶段降低和干预TPOAb水平，从而阻止或延缓AIT的发生及发展，目前尚无有效的治疗手段，根据薛利敏[14]的研究显示，补硒联合低碘饮食可降低AIT患者的 TPOAb 水平，延缓甲状腺的炎症反应，减少自身免疫反应对甲状腺组织的破坏，从而对AIT起到一定的治疗作用。期待之后更多研究能找到AIT的早期预防、延缓甲减发生的新途径。
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图 1 肝癌患者XB130表达情况（×400）
A：复发癌组织；B：复发癌旁组织；C：未复发癌组织；D：未复发癌旁组织。
Figure 1. XB130 expression in HCC patients（×400）
图 2 XB130在不同组别的表达情况
Figure 2. The expression of XB130 in different groups
*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。
图 4 肝癌HCCLM3细胞抑制情况
A：RNA抑制XB130的效果；B：XB130抑制后的表达量比较。 **P < 0.01；***P < 0.001。
Figure 4. Inhibition of HCCLM3 cells
图 5 HCCLM3抑制后侵袭情况
A：HCCLM3对照组侵袭结果（ ×400）；B：HCCLM3-shRNA-1组侵袭结果（ ×400）；C：两组细胞侵袭数目的比较。 **P < 0.01。
Figure 5. Invasion after HCCLM3 inhibition
图 6 HCCLM3抑制后迁移情况
A：XB130抑制后细胞迁移情况（×200）；B：细胞迁移定量结果。 *P < 0.05。
Figure 6. Migration after HCCLM3 inhibition
表 1 XB130表达与临床病理特征的相关性（n）
Table 1. Correlation between XB130 expression and clinicopathological characteristics （n）
相关变量 B7-H4 χ2 P 低 高 年龄（岁） ≤50 23 17 11.449 0.316 > 50 23 27 性别（n） 女 11 25 1.246 0.383 男 32 22 乙肝表面抗原 阴性 22 24 0.146 0.624 阳性 26 18 丙肝 阴性 25 28 3.165 0.262 阳性 22 15 肝硬化 无 11 25 5.742 0.644 有 29 25 甲胎蛋白（ng/mL） ≤20 26 16 2.146 0.132 > 20 28 20 ALT（U/L） ≤75 22 31 3.594 0.674 > 75 14 23 肿瘤大小（cm） ≤5 15 20 2.426 0.184 > 5 31 24 肿瘤包膜 无 26 18 0.451 0.397 有 29 17 血管侵犯 无 19 27 0.249 0.378 有 39 5 肿瘤数量 单发 28 24 1.562 1.000 多发 36 2 肿瘤分化 I/II 22 29 5.321 0.784 III/IV 20 19 BCLC分期 0/A 26 28 4.195 0.017* B/C 10 26 B7-H4 50 40 
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