Effects of Different Concentrations of Magnesium Ions on Endothelial Progenitor Cells in Women with Gestational Diabetes
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摘要:
目的 探究不同浓度镁离子干预对妊娠糖尿病(gestaional diabetes mellitus,GDM)妇女内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)的影响。 方法 选取2016年5月至2020年3月的204例妊娠期糖尿病患者为观察组,并选取同期住院的204例正常妊娠妇女为对照组,采用随机数字表法将观察组分为3组,并分别给予浓度不同的镁离子进行干预,A组(4 mmol/L)、B组(8 mmol/L)、C组(16 mmol/L);采用同样的方法将对照组分为3组,并分别给予浓度不同的镁离子进行干预,a组(4 mmol/L)、b组(8 mmol/L)、c组(16 mmol/L)。6组患者中每组均为68例。6组患者中每位孕妇均入组进行脐血分离培养,每例均为6孔细胞入组。对EPCs细胞增殖、凋亡、粘附、细胞周期进行比较。 结果 观察组3组妇女的增殖能力均低于对照组3组,且B组优于A组,A组优于C组;b组优于a组,a组优于c组;以正常人群的细胞凋亡率为100%,观察组3组妇女的增殖能力均高于对照组3组,且B组低于A组,A组低于C组,b组低于a组,a组低于c组,差异有统计学有意义(P < 0.05)。使用Image J软件计算,观察组3组妇女的细胞面积和细胞密度均低于对照组3组,且B组高于A组,A组高于C组,b组高于a组,a组高于c组,差异有统计学有意义(P < 0.05)。观察组3组妇女细胞生长停滞在G0/G1期少于对照组3组,且B组优于A组,A组优于C组,b组优于a组,a组优于c组,差异有统计学有意义(P < 0.05)。 结论 8 mmol/L的镁离子可能与妊娠期妇女EPCs的增殖和粘附相关,进而抑制凋亡,改善细胞周期,且对GDM妇女的作用更显著,进一步研究后可用于帮助改善GDM孕产妇的妊娠结局。 Abstract:Objective To explore the effects of different concentrations of magnesium ion intervention on endothelial progenitor cells (endothelial progenitor cells, EPCs) in women with gestational diabetes (gestaional diabetes mellitus, GDM). Methods 204 cases of gestational diabetes mellitus from May 2016 to March 2020 were selected as the observation group, and 204 cases of normal pregnant women hospitalized during the same period were selected as the control group. The observation group was divided into group A (4 mmol/L), group B (8 mmol/L) and group C (16 mmol/L) by random number table method, and were treated with different concentrations of magnesium ions. Using the same method, the control group was divided into group a (4 mmol/L), group b (8 mmol/L) and group c (16 mmol/L), and was also given different concentrations of magnesium ions. There were 68 patients in each of the six groups. In the six groups of patients, each pregnant woman was enrolled for cord blood isolation and culture, and each case was enrolled with 6-well cells. The cell proliferation, apoptosis, adhesion and cell cycle of EPCs were compared. Results The proliferative capacity of the three groups of women in the observation group was lower than the those of control group, with group B better than group A, group A better than group C, group b better than group a, and group a better than group c. The apoptosis rate is 100% in normal population. The proliferative capacity of the three groups of women in the observation group is higher than that in the control group, with group B lower than group A, group A lower than group C, group b lower than group a, group a lower than group c, the difference is statistically significant (P < 0.05). According to the calculation using Image J software, the cell area and cell density in the observation group were lower than those in the control group, with group B higher than group A, group A higher than group C, group b higher than group a, and group a higher than group c; the difference is statistically significant (P < 0.05). The occurrence of G0 / G1 phase cell cycle arrest in the observation group was lower than that in control group, with group B better than group A, group A better than group C, group b better than group a, and group a better than group c, the difference is statistically significant (P < 0.05). Conclusion 8 mmol/L magnesium ion may be associated with the proliferation and adhesion of EPCs in pregnant women, thus inhibiting apoptosis and upregulating cell cycle, and its effect on women with GDM is more evident, which can be used to help improve the pregnancy outcome of pregnant women with GDM after further study. -
Key words:
- Gestational diabetes /
- Endothelial progenitor cells /
- Magnesium ion
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妊娠期糖尿病(gestaional diabetes mellitus,GDM)是指妊娠期妇女首次出现的糖耐量异常现象,目前我国范围内约17.5%的妊娠妇女存在GDM,是临床常见的危害母婴的疾病之一,对优生优育影响严重,因此临床中积极预防和诊治GDM对改善母婴不良结局有重要意义[1-3]。分析既往关于GDM的研究,发现有研究指出糖代谢异常的发生与血管内皮细胞损伤及功能障碍相关,而血管内皮细胞损伤也受到动脉粥样硬化、脂质过氧化等因素的影响,因此观察机体氧化应激反应指标也能够了解GDM的情况,及时给予相关治疗,改善妊娠结局[4-5]。
内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是临床中常用的反映氧化应激程度的指标,其在促进损伤血管内皮修复中有重要作用,因此了解EPCs水平对治疗妊娠糖尿病有积极影响[6]。同时考虑到镁离子在稳定细胞膜、清除自由基、抑制炎症等方面均有重要作用,因此其可能会通过降低血管内皮细胞产生的刺激,改善妊娠糖尿病妇女的妊娠结局。本研究就不同浓度镁离子干预对GDM妇女EPCs的影响进行了探究,以期能为今后改善GDM妇女的妊娠结局提供新方向,现分析报道如下。
1. 资料与方法
1.1 一般资料
选取2016年5月至2020年3月期间在河北省人民医院住院治疗的204例妊娠期糖尿病患者为观察组,并选取同期住院的204例正常妊娠妇女为对照组。诊断标准:参照最新国际糖尿病与妊娠研究组[7]的标准。观察组年龄22~45岁,平均(29.11±4.46)岁,确诊孕周17~40岁,平均(27.11±4.43)周。对照组年龄为23~43岁,平均(28.76±5.13)岁,确诊孕周19~39周,平均(28.09±3.98)周。比较2组年龄、孕周,有可比性(P > 0.05)。
纳入标准:(1)确诊妊娠糖尿病者;(2)年龄18周岁以上者;(3)单胎妊娠且顺利生产者;(4)资料完整者。
排除标准:(1)产前糖代谢异常或肝脏疾病者;(2)日酒精摄入量≥30 g者;(3)严重脏器功能障碍或代谢疾病者;(4)正在服用糖皮质激素或调脂药物者;(5)严重精神疾病者。
1.2 方法
1.2.1 EPCs细胞的培养
取孕妇分娩后50 mL脐带血,密度梯度离心法分离、接种核细胞,设置浓度5×107~8×107,加入5 mL M199培养液,置于5%CO2、37 ℃培养箱内3 d,培养后洗去未贴壁细胞培养,以后3 d/次添加VEGF至原浓度(采用血球计数板计数并计算浓度)。
1.2.2 EPCs细胞的鉴定
培养第7天给予细胞0.25%胰酶消化,制作为单细胞悬液(109个细胞/L),分别加入VE-Cadherin、抗CD34、CD133单克隆抗体、VEGFR-2各10 μL,使用流式细胞仪鉴定CD34+KDR+细胞为EPCs细胞。
1.2.3 分组
采用随机数字表法将观察组分为A组(4 mmol/L)、B组(8 mmol/L)、C组(16 mmol/L),并分别给予浓度不同的镁离子进行干预;采用同样的方法将对照组分为a组(4 mmol/L)、b组(8 mmol/L)、c组(16 mmol/L),也分别给予浓度不同的镁离子进行干预。6组患者中每组均为68例。
1.2.4 制备镁离子溶液
配置含有10%胎牛血清的EPCs细胞L-DMEM培养液,加入不同质量的氯化镁。
1.2.5 细胞增殖
在24孔板内接种5×104个细胞,每组3孔,培养24 h,胰酶消化制备细胞悬液,在96孔板内加入等量细胞,每组6孔,加入每孔中10 μL cck-8细胞计数试剂,37 ℃下孵育2.5 h,酶标仪(450 nm)读取吸光度A值。
1.2.6 细胞凋亡
在96孔板内接种1.5×104个细胞,每组6孔培养24 h,然后更换3%胎牛血清M199(100 μL),并加入每孔中10 μL cck-8细胞计数试剂,置于37 ℃下孵育2.5 h,酶标仪(450 nm)读取吸光度A值。
1.2.7 细胞粘附
使用共聚焦显微镜对罗丹明标记的DAPI和鬼笔环肽双重染色的EPCs细胞的贴附情况进行评价。
1.2.8 细胞周期
在6孔板内接种5×105个细胞,每组3孔,培养24 h,调整细胞密度为5×108/L,加胰酶缓冲液(100 μL)孵育10 min,然后加入胰酶抑制剂和RNA酶缓冲液孵育10 min,加入4 ℃预冷溶液C燃料,混匀后使用细胞仪在4 ℃下测定细胞生长周期。
1.3 统计学处理
使用SPSS22.0分析数据,计量数据均通过正态性检验,以MEAN±SD描述,多组间比较为方差分析,进一步两两比较为成组t检验,以P < 0.05为差异有统计学有意义。
2. 结果
2.1 对EPCs细胞增殖和凋亡的影响
观察组3组妇女的增殖能力均低于对照组3组,且B组优于A组,A组优于C组,b组优于a组,a组优于c组;以正常人群的细胞凋亡率为100%,观察组3组妇女的增殖能力均高于对照组3组,且B组低于A组,A组低于C组,b组低于a组,a组低于c组,差异有统计学意义(P < 0.05),见表1、图1。
表 1 对EPCs细胞增殖和凋亡的影响($\bar x \pm s$ )Table 1. Effects on proliferation and apoptosis of EPCs ($\bar x \pm s$ )分组 n CCK-8(λ = 450 mm) 凋亡率(%) A组 68 0.20 ± 0.05 279.07 ± 59.84 B组 68 0.23 ± 0.06 214.43 ± 57.76 C组 68 0.18 ± 0.03 317.65 ± 63.32 a组 68 0.28 ± 0.04 121.67 ± 34.52 b组 68 0.30 ± 0.05 95.78 ± 21.34 c组 68 0.25 ± 0.03 156.64 ± 30.09 F 73.541 53.652 P < 0.001 < 0.001 2.2 对EPCs细胞粘附的影响
使用Image J软件计算,观察组3组妇女的细胞面积和细胞密度均低于对照组3组,且B组高于A组,A组高于C组,b组高于a组,a组高于c组,差异有统计学意义(P < 0.05),见表2、图2~4。
表 2 对EPCs细胞粘附的影响($\bar x \pm s$ )Table 2. Effects on EPCs cell adhesion ($\bar x \pm s$ )分组 n 细胞面积(μm2) 细胞密度(cells/mm2) A组 68 5744.38 ± 1022.47 73.32 ± 7.10 B组 68 6193.26 ± 983.77 76.45 ± 6.31 C组 68 5489.05 ± 883.21 70.78 ± 5.57 ` a组 68 7348.79 ± 1143.25 81.06 ± 8.22 b组 68 7548.43 ± 1290.83 82.90 ± 7.43 c组 68 7054.27 ± 1075.43 79.13 ± 8.63 F 63.891 43.857 P < 0.001 < 0.001 2.3 对EPCs细胞周期的影响
观察组3组妇女细胞生长停滞在G0/G1期少于对照组3组,且B组优于A组,A组优于C组,b组优于a组,a组优于c组,差异有统计学意义(P < 0.05),见表3、图5。
表 3 对EPCs细胞周期的影响($\bar x \pm s$ )Table 3. Effects on EPCs cell cycle ($\bar x \pm s$ )分组 n G0/G1 S G2/M A组 68 81.33 ± 2.78 13.36 ± 2.08 3.92 ± 1.43 B组 68 79.19 ± 3.07 15.64 ± 2.77 4.35 ± 1.70 C组 68 84.52 ± 3.14 11.97 ± 1.88 3.65 ± 1.23 a组 68 72.13 ± 2.56 22.98 ± 1.95 5.06 ± 0.78 b组 68 67.56 ± 2.61 26.24 ± 3.17 5.67 ± 1.32 c组 68 77.35 ± 3.56 17.89 ± 2.03 4.98 ± 1.56 F 49.976 63.532 17.037 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 3. 讨论
GDM的出现对产妇及新生儿均有不良影响,尤其是新生儿儿童时期多发代谢综合征、肥胖等疾病[8-9]。临床中多数学者认为,胎儿血管系统的发育与子宫环境的变化有密切关系,虽尚未明确其具体机制,但是已知子宫环境变化可通过EPCs对胎儿脉管系统的正常发育进行影响,诱发内皮功能障碍[10]。EPCs能够分化成为成熟血管内皮细胞,参与到血管生成、形成、修复过程中,可帮助维持内皮完整性[11]。
Buemi等[12]认为高血糖状态会降低CD34+的细胞数量,因此他们在研究中将正常新生儿的脐带血给予高糖孵育,发现其中EPCs衰老明显加重,其血管形成能力和增殖能力明显降低,诱发EPCs凋亡。分析既往学者对该过程的研究,总结其主要作用途径大致可分为如下3点:(1)高血糖能够对EPCs内的p38-MAPK产生刺激,进而加速EPCs的衰老,减少其数量[13];(2)高血糖能够促进EPCs释放NO,并降低其生物利用度,促进超氧负离子产生,导致活性氧簇积聚增多,加速了EPCs的凋亡,影响了迁移能力[14];(3)高血糖损害了EPCs,促进了微粒的释放,对中性粒细胞产生刺激,加速了内皮细胞与单核细胞的结合,对中性粒细胞产生趋化作用,通过炎症反应影响血管内皮功能[15]。
镁离子对人体的多种酶促反应和能量代谢均有重要作用,可促进糖通过细胞膜,加速糖氧化磷酸化及酵解[16-17]。若人体内缺乏镁离子,则胰腺细胞结构不良,进而减少了β细胞颗粒,降低了β细胞对糖的敏感性,造成胰岛素分泌量减少[18-19]。且低血镁也会对胰岛素与细胞受体结合的过程产生影响,促进机体分泌胰高血糖素,加速血糖的升高,导致GDM患者的病情恶化,需要增加胰岛素的用量[20-21]。在葡萄糖代谢过程中,如果血清镁离子浓度低,则会促进糖进行氧化磷酸化酵解和穿透细胞膜,影响葡萄糖的正常糖酵解过程,加重细胞代谢紊乱,导致代谢失衡,促进血糖浓度快速升高。同时,镁离子浓度的降低也会影响胰岛素与相应细胞受体的结合,促进人体内胰高血糖素的分泌,导致血糖浓度升高[22-23]。如果GDM患者长期血糖控制不良,会导致内皮功能不全,导致EPC不能更好地融入动脉内膜,无法进一步分化为成熟内皮细胞,严重的甚至导致血管系统恢复,增加早产、新生儿低血糖和其他不良妊娠结局的发生率,甚至对新生儿有长期影响[24]。因此,常规检测孕妇血清镁离子浓度,采取有效措施,适当补充镁离子,对提高妊娠结局具有重要意义。有研究指出[22-23],GDM患者的并发症的发生和发展与低镁程度存在一致性,推测是由于低血镁降低了体内糖的利用率,增大了胰岛素的用量,诱发了脂质代谢紊乱,进而降低了高密度脂蛋白含量,使血液呈现高凝状态,进而增加了各类并发症的发生率,因此为改善GDM患者的妊娠结局,应积极补充镁离子。在王健[24]的研究中发现,适当浓度的镁离子能够激活PI3K/Akt信号通路,进而增强成骨细胞的黏附能力、ALP活性、细胞活力、成骨细胞相关基因的表达能力、细胞活力等。
本研究中观察组患者的EPCs细胞给予不同浓度的镁离子干预后虽然总体上细胞增殖、凋亡、粘附、细胞周期情况较对照组差,但也呈现出明显的改善,且8 mmol/L镁离子干预具有更佳的效果。基于既往一些研究结论,考虑这是由于补充镁离子后GDM患者体内的胰腺细胞、β细胞等数量、结构、功能的逐步正常化,胰岛素的合成和分泌过程也得到了保证,进而缓解率GDM病情的恶化,对其血糖水平进行了积极的控制,血糖水平得到控制后减少了高血糖环境对EPCs细胞的各种不良影响,保护了血管内皮功能,改善了母婴结局[25-26]。分析既往临床中对于GDM妇女的治疗,主要处理原则为维持正常范围的血糖浓度,以减少母婴并发症的发生率,降低围生儿死亡率,初期使用运动疗法和饮食疗法治疗,若血糖无法较好控制,则推荐使用胰岛素控制。但是由于孕妇的血糖波动较大,且体力消耗大,进食小,因此低血糖发生率较高,对血糖的控制情况较差[27-30]。
综上所述,8 mmol/L的镁离子可能与妊娠期妇女EPCs的增殖和粘附相关,进而抑制凋亡,改善细胞周期,且对GDM妇女的作用更显著,进一步研究后可用于帮助改善GDM孕产妇的妊娠结局。
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表 1 对EPCs细胞增殖和凋亡的影响(
$\bar x \pm s$ )Table 1. Effects on proliferation and apoptosis of EPCs (
$\bar x \pm s$ )分组 n CCK-8(λ = 450 mm) 凋亡率(%) A组 68 0.20 ± 0.05 279.07 ± 59.84 B组 68 0.23 ± 0.06 214.43 ± 57.76 C组 68 0.18 ± 0.03 317.65 ± 63.32 a组 68 0.28 ± 0.04 121.67 ± 34.52 b组 68 0.30 ± 0.05 95.78 ± 21.34 c组 68 0.25 ± 0.03 156.64 ± 30.09 F 73.541 53.652 P < 0.001 < 0.001 表 2 对EPCs细胞粘附的影响(
$\bar x \pm s$ )Table 2. Effects on EPCs cell adhesion (
$\bar x \pm s$ )分组 n 细胞面积(μm2) 细胞密度(cells/mm2) A组 68 5744.38 ± 1022.47 73.32 ± 7.10 B组 68 6193.26 ± 983.77 76.45 ± 6.31 C组 68 5489.05 ± 883.21 70.78 ± 5.57 ` a组 68 7348.79 ± 1143.25 81.06 ± 8.22 b组 68 7548.43 ± 1290.83 82.90 ± 7.43 c组 68 7054.27 ± 1075.43 79.13 ± 8.63 F 63.891 43.857 P < 0.001 < 0.001 表 3 对EPCs细胞周期的影响(
$\bar x \pm s$ )Table 3. Effects on EPCs cell cycle (
$\bar x \pm s$ )分组 n G0/G1 S G2/M A组 68 81.33 ± 2.78 13.36 ± 2.08 3.92 ± 1.43 B组 68 79.19 ± 3.07 15.64 ± 2.77 4.35 ± 1.70 C组 68 84.52 ± 3.14 11.97 ± 1.88 3.65 ± 1.23 a组 68 72.13 ± 2.56 22.98 ± 1.95 5.06 ± 0.78 b组 68 67.56 ± 2.61 26.24 ± 3.17 5.67 ± 1.32 c组 68 77.35 ± 3.56 17.89 ± 2.03 4.98 ± 1.56 F 49.976 63.532 17.037 P < 0.001 < 0.001 < 0.001 -
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