The Effect of Silencing of UBE2C Gene on the Proliferation and Migration of Human Gastric Cancer AGS Cells
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摘要:
目的 探讨UBE2C基因沉默对人胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。 方法 将用RNA 干扰技术构建的UBE2C-shRNA表达载体转染到293T细胞，用含有病毒颗粒的上清感染人胃癌AGS细胞，经puromycin筛选获得稳定表达的AGS细胞株。实验分为UBE2C表达沉默人胃癌AGS细胞组（干扰组）和对照组。采用qRT-PCR验证人胃癌AGS细胞中UBE2C的mRNA 表达水平，随后利用实时无标记细胞分析仪（RTCA）检测UBE2C沉默对人胃癌AGS细胞的增殖和迁移情况；同时应用CCK-8 细胞增殖检测试剂盒进一步印证UBE2C表达水平对人胃癌AGS细胞增殖能力影响。 结果 干扰组中UBE2C mRNA 表达 水平与对照组相比明显降低，AGS细胞增殖和迁移能力显著下降（P < 0.01）。 结论 靶向沉默UBE2C基因表达能抑制人胃癌AGS细胞恶性生物学行为。 Abstract:Objective To investigate the influence of the silence of UBE2C gene on the gastric cancer AGS cells proliferation and migration of human. Methods Using RNA interference technology, the expression vector of UBE2C silenced lentivirus was transfered into 293T cell line with packaging plasmids to produce the lentiviral particles. Lentivirus was used to infect human gastric cancer AGS cells, and the cells with stably expressing UBE2C were obtained by puromycin screening. The experiment was divided into the interference group and the interference control group. The expression levels of UBE2C mRNA in human gastric cancer AGS cells were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The capacity of AGS cell proliferation and migration was determined with real-time label free cell analyzer （RTCA）. Meanwhile, Cell counting kit-8 （CCK-8） was used to further confirm the effect of UBE2C expression level on the proliferation of human gastric cancer AGS cells. Results Compared with the interference control group, UBE2C shRNA transfected human gastric cancer AGS cells significantly decreased the expression of UBE2C mRNA （P < 0.05）; the cellular proliferation and migration ability were obviously decreased. Conclusion Targeted silencing of UBE2C gene expression can inhibit the malignant biological behavior of human gastric cancer AGS cells. -
Key words:
- UBE2C /
- human gastric cancer AGS cells /
- proliferation /
- Migration
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脑震荡（cerebral concussion，CC）是创伤性脑损伤（traumatic brain injuries，TBI）中的轻度损伤类型，死亡率和致残率高。美国脑震荡年发病率约为5/1000，并有逐年上升得趋势[1]。目前研究发现，反复轻型脑损伤（repetitive mild traumatic brain injury，rmTBI）即多次脑震荡（multiple cerebral concussion，MCC）易出现学习记忆功能与情感障碍问题等，最终可发展为慢性创伤性脑病（chronic traumatic encephalopathy，CTE）[2]。课题组前期研究发现：3次性多重脑震荡（3 MCC）大鼠较一次性脑震荡组（pure cerebral concussion，PCC组）大鼠出现了明显的抑郁样行为损害，且随着打击次数的增加，其抑郁样行为损害程度更加严重[3]。但有关MCC大鼠对比PCC大鼠伤后早期焦虑行为变化尚未见有报道，为深入了解一重和多重脑震荡大鼠伤后早期焦虑行为变化特点，为后续干预和治疗评价提供实验依据，特设计本实验研究。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验动物及分组：雄性SD大鼠50只（购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司），合格证编号：SCXK（湘）2016-0002，体重（280±20）g，大鼠于实验前1周运到实验室，在安静环境下（明/暗周期12 h）分笼饲养，自由取食饮水，饲养环境温度15 ℃-22 ℃，湿度50%～60%，模型复制时随机将实验大鼠分入正常对照组（N组）、PCC组和3 MCC组。
1.2 方法
1.2.1 模型复制
模型复制方法参照于建云等[4]的方法，将每次打击符合轻型脑损伤判别标准的大鼠纳入实验对象，多重脑震荡大鼠每次打击的间隔时间为24 h，排除模型复制过程中判断为重型颅脑损伤与死亡的大鼠。
1.2.2 旷场实验（OFT）
1.2.3 实验方法
模型复制成功后饲养14 d，于伤后第14天进行旷场实验（OFT）。旷场实验箱规格为100 cm×100 cm×50 cm，顶部敞开，箱底均分为25个方格，四周墙壁为黑色有机玻璃，沿四周墙壁的区域为外周区域（surround areas，SA），其余区域为中央区域（center areas，CA）。每次实验将大鼠放到正中格开始实验，实验者站到1.5 m外观测，同时打开视频记录系统，记录大鼠在旷场中的活动情况。每次测试结束后，需要用清水和酒精清除掉大鼠的排泄物跟气味。再进行下一只动物的实验。正常大鼠因好奇而自动到CA区域进行探索活动，而焦虑大鼠则更愿意在SA区域活动。
1.2.4 检测指标
每只大鼠需观测5 min并录像，记录大鼠在CA区穿格数与CA区停留时间，SA区穿格数与SA区停留时间，梳理毛发次数。
1.3 高架十字迷宫实验（HPM）
1.3.1 实验方法
HPM由2条相对开臂（open arms，OA）和2条相对闭臂（enclosed arms，EA）组成，互相垂直成十字交叉。将大鼠轻放在十字迷宫的中央部位、面向开臂（OA），实验者迅速离开装置，站到1.5 m以外观测，同时打开电脑实验记录系统，记录大鼠在高架十字迷宫中的活动情况，每次测试结束后，需要用清水和酒精清除掉大鼠的排泄物跟气味。再进行下一只动物的实验。上述实验过程全部录像保存，进行统计分析。大鼠在闭臂中的时间与其焦虑程度呈正相关。
1.3.2 检测指标
每次观测5 min，主要记录大鼠进入OA次数、在OA停留时间、在OA中向平台下探望次数；进入EA次数和停留在EA的时间。
1.4 统计学处理
用SPSS20.0统计软件对数据进行处理，结果采用均数±标准差（
$\bar{{x}} \pm s$ ）及四分位数M（P25，75）表示，统计方法采用单因素方差分析和Kruskal-Wallis H检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。2. 结果
2.1 旷场实验结果
（1）CA区行走格数与停留时间：损伤组在CA区行走格数与停留时间均少于N组，且打击次数越多，CA区走格数与停留时间均呈减少趋势，3 MCC组与N组、PCC组比较差异有统计学意义，P < 0.05（P = 0.024，P = 0.033）；（2）SA区行走格数与停留时间：损伤组在SA区行走格数与停留时间均高于N组，且打击次数越多，SA区走格数与停留时间均呈增多趋势，SA区走格数3 MCC组与N组比较差异有统计学意义，P < 0.05（P = 0.015），SA区停留时间各组间差异无统计学意义，P > 0.05；（3）梳理毛发次数：损伤组梳理毛发次数均明显少于N组，且打击次数越多，梳理毛发次数越少，3 MCC组与N组、PCC组比较差异有统计学意义，P < 0.05（P = 0.013，P = 0.019）；（4）OFT实验焦虑行为损伤组较正常组变化率：各损伤组大鼠在旷场实验中CA区行走格数、行走时间与理毛次数，均随着打击次数的增加呈现下降趋势，其中一次性脑震荡大鼠的探索行为分别下降为正常的95.00%、61.88%和80.8%，三次性脑震荡大鼠的探索行为分别下降为正常的50.00%、25.41%和46.90%。此外，随着打击次数的增加，损伤大鼠在SA区行走格数与行走时间则呈上升趋势，其中一次性脑震荡大鼠的焦虑行为分别上升了165.15%和103.30%，三次性脑震荡大鼠的焦虑行为分别上升了196.97%和116.08%，见表1，表2。
表 1 PCC与3 MCC大鼠伤后14 d OFT数据[（$\bar x \pm s$ ），n = 12，M（P25，P75）]Table 1. OFT data of PCC and 3 MCC rats on the 14th day after injury [（$\bar x \pm s$ ），n = 12，M（P25，P75）]分组 中央格数（格） 中央格时间（s） 周边格数（格） 周边格时间（s） 理毛频次（次） N 10.00（7.00，17.88） 90.50（65.25，286.50） 33.00（1.13，51.50） 227.00（13.50，251.75） 5.20 ± 1.62 PCC 9.500（6.50，16.75） 56.00（32.25，104.00） 54.50（26.88，62.25） 234.50（196.00，275.75） 4.20 ± 1.03 3 MCC 5.00（3.50，9.00）▲* 23.00（11.00，36.00）▲* 65.00（28.50，81.00）▲ 263.50（217.00，278.00） 2.44 ± 0.73▲* 与N组比较，▲P < 0.05；与PCC组比较，*P < 0.05。 表 2 伤后14 d OFT实验PCC与3 MCC大鼠焦虑行为较正常组变化率（%）Table 2. The changes of anxious behaviors of PCC and 3 MCC rats on the 14th day after injury by OFT test （%）分组 中央格数（格） 中央格时间（s） 周边格数（格） 周边格时间（s） 理毛频次（次） N 100 100 100 100 100 PCC 95.00 61.88 165.15 103.30 80.8 3 MCC 50.00 25.41 196.97 116.08 46.9 2.2 高架十字迷宫实验结果
（1）进入OA次数与时间：各损伤组进入OA的次数与进入OA的时间均少于N组，且打击次数越多，进入OA次数与时间越少，但各组间差异无统计学意义，P > 0.05；（2）在OA中向台下探望次数：损伤组进入OA后向台下探望次数均少于N组，其中3 MCC组较N差异具有统计学意义，P < 0.05（P = 0.032）；（3）进入EA次数与时间：损伤组进入EA次数均低于N组，但在EA中的停留时间增加，且打击次数越多，这些变化更加明显，进入EA次数，3 MCC组与PCC组比较，差异具有统计学意义，P < 0.05（P = 0.015）；进入EA时间，3 MCC组与N组、PCC组比较差异有统计学意义，P < 0.05（P = 0.042，P = 0.027）；（4）HMP实验焦虑行为损伤组较正常组变化率：各损伤组大鼠在高架十字迷宫实验中，进入OA臂的次数、时间与向台下探望次数，均随着打击次数的增加呈现下降趋势，其中一次性脑震荡大鼠的探索行为分别下降为正常的100%、10.05%和53.44%，三次性脑震荡大鼠的探索行为分别下降为正常的50.00%、6.78%和32.66%。此外，随着打击次数的增加，损伤大鼠在EA臂中的停留时间则呈上升趋势，见表3，表4。
表 3 PCC与3 MCC大鼠伤后14 d HMP数据[（$\bar x \pm s$ ），n = 12，M（P25，P75）]Table 3. HMP data of PCC and 3 MCC rats on the 14th day after injury [（$\bar x \pm s$ ），n = 12、M（P25，P75）]分组 开臂 闭臂 开臂进入次数（次） 进入开臂时间（s） 向台下探究次数（次） 闭臂进入次数（次） 进入闭臂时间（s） N 1.00（0.00，2.00） 199.00（0.00，299.75） 8.42 ± 6.26 1.00（0.00，1.00） 0.00（0.00，201.25） PCC 1.00（0.00，1.00） 20.00（0.00，111.75） 4.50 ± 4.36 1.00（1.00，1.00） 241.50（4.25，289.25） 3 MCC 0.50（0.00，1.00） 13.50（0.00，109.25） 2.75 ± 3.77▲ 0.00（0.00，1.00）* 271.50（0.00，297.00）▲* 与N组比较，▲P < 0.05；与PCC组比较，*P < 0.05。 表 4 伤后14 d HMP实验PCC与3 MCC大鼠焦虑行为较正常组变化率（%）Table 4. The changes of anxious behaviors of PCC and 3 MCC rats on the 14th day after injury by HMP test （%）分组 开臂 闭臂 开臂进入次数（次） 进入开臂时间（s） 向台下探究次数（次） 闭臂进入次数（次） 进入闭臂时间（s） N 100 100 100 100 100 PCC 100 10.05 53.44 100 0.00 3 MCC 50.0 6.78 32.66 0.00 0.00 3. 讨论
焦虑症（Anxiety）又称焦虑性障碍，是一种处于应激状态时的正常情绪反应，表现为以焦虑情绪为主的神经症，临床上常伴有头晕、呼吸困难、心悸、汗出、胸闷、口干、尿急、尿频和运动不安等，属于防御性的心理反应[5-6]。焦虑症的神经生理学基础主要涉及扣带回、前额叶以及杏仁核等脑区功能与结构异常[7]。神经科学研究发现大脑加工“恐惧”情绪的神经通路发生异常是焦虑症的神经基础。LeDoux等研究者通过在实验动物大脑信息加工环路上制造一系列病灶，最终确立了杏仁核在恐惧加工中的关键地位，并在脑成像技术中得到证明。高度焦虑个体在看到恐惧表情的面孔后，其杏仁核外侧基底部的活动跟对照组不同[8]面孔表情使创伤后应激综合征患者杏仁核的活动增强，支持了杏仁核在焦虑症发病中的作用[9]。Kalisch等研究发现高度焦虑大鼠在应激时，其背内侧前额叶的活动较低焦虑大鼠低。也有研究提出：大鼠情绪、神经性行为等活动主要由海马CA1区调控。海马神经细胞丢失、神经树突萎缩与突触点减少，可通过影响海马在下丘脑—垂体—肾上腺（The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）轴反馈抑制导致焦虑症[10-11]。
有关大鼠焦虑样情感行为，多采用旷场实验（OFT）和高架十字迷宫实验（HPM）进行检测。OFT实验是由Hall等于1934年设计发明的，主要用于检测实验动物焦虑、抑郁状态、自发活动及探索行为。其原理是基于动物存在畏惧空旷场地、对新鲜事物探索、趋壁性的天性而设置。该实验主要检测大鼠在CA区和SA区行走格数及活动时间指标，实验动物在CA区活动的距离与时间越长，说明其自主活动能力越高，焦虑程度越低。该实验操作简单，所得数据丰富，被研究者广泛应用[12-13]。HPM实验主要用于检测大鼠在复杂环境中的自主活动能力和焦虑程度，被广泛用于抑郁症、痴呆等疾病模型研究[14]。其原理是是基于动物对新异环境的探索性和对高悬敞开臂的恐惧性而设计。主要通过观测大鼠在OA和EA次数和时间，来判断大鼠的焦虑程度和自主活动能力。实验动物进入OA的次数和时间越长，说明实验动物的自主活动能力越高，焦虑程度越低。
本实验结果显示：一次与三次性脑震荡大鼠在伤后14 d，均表现出一定程度的焦虑行为增加，各损伤组大鼠伤后14 d对新奇环境的探索行为呈明显下降趋势。主要表现在损伤组大鼠在旷场实验中央（CA）区行走格数下降为正常的95.0%～50.0%，在CA区的停留时间减少为正常的61.88%～25.41%；同时在高架十字迷宫实验中，损伤大鼠进入开放臂（OA）次数下降为正常的100%～50.0%，停留在OA的时间下降为正常的10.05%～6.78%，向台下探望的次数下降为正常的53.44%～32.66%。上述结果提示，不论是一次还是三次脑震荡大鼠的探索行为在伤后14 d都有程度不等的受损下降。另一方面，一次与三次性脑震荡大鼠在伤后14天，其焦虑行为也一定程度出现增加，表现为损伤组大鼠在旷场实验周边（SA）区行走距离与停留时间较正常组大鼠分别增加了165.15%～196.97%，103.30%～116.08%，代表大鼠安宁自在的理毛行为频数较正常组大鼠减少了80.8%～46.9%。
本实验研究结果还显示，随着打击次数的增加，伤后14 d三重脑震荡大鼠的焦虑行为异常变化较正常组大鼠出现了显著的损伤性变化，且在各项观测指标中，三重脑震荡大鼠的焦虑行为变化较一次性脑震荡大鼠的改变更加突出，表现出了不同程度的损伤累加效应趋势，推测随着实验观测时间的延长，这些变化很可能会出现更显著性的差异。
一次性与多次性脑震荡大鼠于伤后14 d，开始出现了明显的焦虑行为增多趋势，并随打击次数的增加，表现出不同程度的损伤累加效应。一次与多次脑震荡大鼠焦虑行为改变的具体机制有待深入研究。
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图 1 293T细胞转染3组慢病毒干扰质粒和对照质粒72 h荧光显微镜观察结果（100×）
Figure 1. 293 T cells transfected with three group of interfering lentiviral vectors and control vector for 72hours were photographed under fluorescene microscope（100×）
A：Contrl-shRNA；B：UBE2C -shRNA1；C：UBE2C -shRNA2；D：UBE2C -shRNA3。
图 2 UBE2C-shRNA转染对UBE2C表达的影响（*P < 0.05，与对照组相比，n = 3）
与Control-shRNA组比较，*P < 0.05，n = 3。
Figure 2. Interference efficiency of UBE2C-shRNA plasmid on UBE2C expression
图 3 荧光显微镜下观察稳定表达 UBE2C的 AGS 胃癌细胞株（100×）
Figure 3. Stable expressing UBE2C of AGS gastric cancer cell strain under fluorescene microscope（100 ×）
A：Contrl-shRNA；B：UBE2C-shRNA2。
图 4 qRT-PCR 检测胃癌AGS细胞株中稳定表达UBE2C的水平
与对照组比较，*P < 0.05，n = 3。
Figure 4. stable expression of UBE2C in AGS gastric cancer cell strain determined by qRT-PCR
图 5 RTCA 实时监测胃癌AGS细胞增殖结果
与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，n = 3。
Figure 5. RTCA monitoring the proliferation of gastric cancer AGS cells
图 6 CCK-8 检测UBE2C对胃癌AGS细胞增殖的影响与对照组比较，***P < 0.001，n = 3。
Figure 6. Effect of UBE2C on proliferation of gastric cancer AGS cells detected by CCK-8
图 7 RTCA 实时监测胃癌AGS细胞迁移结果（*P < 0.05，***P < 0.001，n = 3）
Figure 7. RTCA monitoring the migration of gastric cancer AGS cells
*P < 0.05，***P < 0.001，n = 3。
表 1 引物信息
Table 1. Primer information
基因 引物序列5′→3′ UBE2C forward：ATCCATGGAGCAGCTGGAAC reverse：GGCAGCATGTGTGTTCAAGG GAPDH forward：GAGCCACATCGCTCAGACAC reverse：CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG 
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