The Effect of Silencing of UBE2C Gene on the Proliferation and Migration of Human Gastric Cancer AGS Cells
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摘要:
目的 探讨UBE2C基因沉默对人胃癌AGS细胞增殖和迁移能力的影响。 方法 将用RNA 干扰技术构建的UBE2C-shRNA表达载体转染到293T细胞，用含有病毒颗粒的上清感染人胃癌AGS细胞，经puromycin筛选获得稳定表达的AGS细胞株。实验分为UBE2C表达沉默人胃癌AGS细胞组（干扰组）和对照组。采用qRT-PCR验证人胃癌AGS细胞中UBE2C的mRNA 表达水平，随后利用实时无标记细胞分析仪（RTCA）检测UBE2C沉默对人胃癌AGS细胞的增殖和迁移情况；同时应用CCK-8 细胞增殖检测试剂盒进一步印证UBE2C表达水平对人胃癌AGS细胞增殖能力影响。 结果 干扰组中UBE2C mRNA 表达 水平与对照组相比明显降低，AGS细胞增殖和迁移能力显著下降（P < 0.01）。 结论 靶向沉默UBE2C基因表达能抑制人胃癌AGS细胞恶性生物学行为。 Abstract:Objective To investigate the influence of the silence of UBE2C gene on the gastric cancer AGS cells proliferation and migration of human. Methods Using RNA interference technology, the expression vector of UBE2C silenced lentivirus was transfered into 293T cell line with packaging plasmids to produce the lentiviral particles. Lentivirus was used to infect human gastric cancer AGS cells, and the cells with stably expressing UBE2C were obtained by puromycin screening. The experiment was divided into the interference group and the interference control group. The expression levels of UBE2C mRNA in human gastric cancer AGS cells were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR）. The capacity of AGS cell proliferation and migration was determined with real-time label free cell analyzer （RTCA）. Meanwhile, Cell counting kit-8 （CCK-8） was used to further confirm the effect of UBE2C expression level on the proliferation of human gastric cancer AGS cells. Results Compared with the interference control group, UBE2C shRNA transfected human gastric cancer AGS cells significantly decreased the expression of UBE2C mRNA （P < 0.05）; the cellular proliferation and migration ability were obviously decreased. Conclusion Targeted silencing of UBE2C gene expression can inhibit the malignant biological behavior of human gastric cancer AGS cells. -
Key words:
- UBE2C /
- human gastric cancer AGS cells /
- proliferation /
- Migration
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起源于上皮的恶性肿瘤胃癌，目前已经成为威胁人类健康的疾病，据国际癌症研究机构的最新的统计结果胃癌在恶性肿瘤的发病率和死亡率分别居于第5 位和第3位，东亚是胃癌的高发区。伴随我国经济快速发展，城市环境污染加剧和人们心理压力空前增大，胃癌的发病率也随着人口老龄化的加剧而增加，为胃癌的防控带来前所未有的挑战[1-2]。尽管近年来手术切除、放疗、化疗、分子靶向治疗和免疫治疗在内的综合治疗迅速的发展，但晚期胃癌患者的5a存活率仍然低于30%。此外，对于胃癌在人体内，如何发生发展及其在人体的作用机制，以及诊断和治疗仍然存在许多未解的问题。泛素结合酶 2（ubiquitin -conjugating enzyme 2C，UBE2C）基因编码的泛素结合酶 2C，作为 E2 泛素结合酶家族的一员，参与了调控许多蛋白质的泛素化降解，特别是细胞周期蛋白的降解，从而影响细胞周期的进程，并在肿瘤的发生和进展中发生作用[3-4]。尽管UBE2C 与肿瘤发生发展之间的关系已经有很多研究，但是仍有一些重要的科学问题尚未解决。本项目的预实验中 笔者通过Oncomine数据库的查询，经分析发现在胃癌组织中UBE2C的表达异常。然而，UBE2C是如何影响胃癌细胞的功能还不甚清楚。为了探讨UBE2C对胃癌细胞生物学功能的影响，本课题通过慢病毒介导的UBE2C沉默表达，初步分析了UBE2C沉默对AGS细胞的细胞迁移和增殖的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料
pLVX-IRES-Puro、293T细胞、质粒pMD2.G和psPAX2本室保存；人胃癌AGS细胞购自昆明细胞库；胎牛血清、puromycin、TRIZOL Reagent、jetPRIME® Transfection Reagent转染试剂和2X RealStar SYBR Mixture分别购自 BI、YEASE、Invitrogen、PolyplusTransfection和GenStar Biosolution公司; UBE2C-shRNA重组质粒和对照重组质粒（UBE2C-shRNA）购自山东维真生物科技有限公司（批号：20191024003）；xCELLigence 实时细胞分析系统（real-time cell analysis system，RTCA）和 CIM-Plate-16 由杭州艾森生物有限公司提供。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
37 ℃、饱和湿度和5% CO2为细胞培养条件，将293T细胞AGS细胞置于含有10% FBS和1%青链霉素双抗的DMEM培基中培养。
1.2.2 UBE2C 重组慢病毒干扰质粒载体的构建
根据 Genebank 中报道的人UBE2C 基因的核苷酸序列（NM _ 007019.4），由山东维真生物科技有限公司设计和构建了3个BUE2C shRNA重组质粒及对照重组质粒（Control shRNA），载体均选用pLent-U6-GFP-Puro，分别命名为UBE2C -shRNA1（序列为：CCCTTACAATGCGCCCACAGT）、UBE2C-shRNA2（序列为：TGTATGATGTCAGGACCATTC）、UBE2C-shRNA3（序列为CCTGCAAGAAACCTACTCAAA）和 Contrl-shRNA（序列为：TTCTCCGAACGTGTCACGT）。
1.2.3 慢病毒上清的收集
转染前将生长良好的293T细胞接种到培养皿中培养，当细胞融合度约75%至80%时，将包装质粒pMD2.G和psPAX2与重组质粒（UBE2C -shRNA1-3；Contrl-shRNA）共转染到293T细胞中，置于培养箱中培养。于72 h收集含有病毒的上清，储存在-80 ℃备用。
1.2.4 慢病毒感染（顺序）
实验分为UBE2C 表达沉默人胃癌AGS细胞组（干扰组）和插入无义序列的对照组。实验时在胃癌AGS细胞融合度约70% 左右，加入含有上述病毒的上清感染分别干扰组和对照组AGS细胞，并加入6 ug/mL的polybrene继续培养，每天2次，持续2 d。48 h后，以浓度为10 ug/mL的puromycin进行抗性筛选，每24 h于倒置荧光显微镜观察绿色荧光的强度和细胞存活情况，48 h后仍然存活的细胞即为带puromycin抗性的细胞株，随后继续扩大培养。
1.2.5 qRT-PCR检测 UBE2C沉默效果（顺序）
收集上述各组细胞检测以 UBE2C mRNA 的表达量。依照Invitrogen 的说明书提取细胞总RNA后，用TAKARA逆转录Kit合成cDNA，随后qRT-PCR检测UBE2C在各组细胞中mRNA的表达水平。反应条件：95 ℃ 5 min、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环后读取荧光值，UBE2C mRNA 相对表达量用 2-△△Ct值表示，GAPDH作为内参。qRT-PCR引物见表1。
表 1 引物信息Table 1. Primer information基因 引物序列5′→3′ UBE2C forward：ATCCATGGAGCAGCTGGAAC reverse：GGCAGCATGTGTGTTCAAGG GAPDH forward：GAGCCACATCGCTCAGACAC reverse：CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG 1.2.6 RTCA检测AGS细胞增殖和迁移
（1）RTCA细胞增殖实验 在E-Plate 16 板的孔中加入 5×104的细胞悬液，用xCELLigence RTCA S16系统上记录0～70 h人胃癌AGS细胞的增殖曲线。
（2）细胞迁移实验 （1）在 CIM-Plate 16 下室各孔中加入 DMEM完全培基，在上室中加入不含血清的DMEM培基，置于 CO2培养箱中使细胞平衡生长1 h。之后CIM-Plate 16 置于RTCA DP Analyzer上，进行基线检测；（2）在上室板内各孔中加入5×10 4 cells/mL细胞悬液后放入培养箱中的RTCA Station上检测细胞迁移过程，每组设4个平行对照孔。
1.2.7 CCK8检测细胞增殖
取实验组和对照组对数生长期的AGS细胞，经胰酶消化后制备细胞悬液，于每孔中加入2×103 细胞，每组设置6个复孔，完全培基作为空白对照。随后将96 孔板置于CO2培养箱培养 1～4 d，检测前2 h加入 CCK-8 试剂，最后用酶标仪分别在0、24、48和72 h测定AGS细胞在450 nm处的吸光度值。上述实验重复3次后取均值。
1.2.8 统计学分析
数据使用 SPSS 17.0 统计软件进行分析。计量资料以 Mean±SD 表示，UBE2C在胃癌和肝癌组织中的表达采用配对资料t检验进行差异性比较。
2. 结果
2.1 慢病毒包装和转染效率评价
用慢病毒包装293T细胞后分别在24 h、48 h和72 h于荧光显微镜观察干扰组和对照组均可出现发绿色荧光的细胞，其中在72 h表达绿色荧光蛋白（green fluorescentprotein，GFP）最强（图1），故选取转染72 h的293T细胞，采用qRT-PCR测定细胞中UBE2C mRNA表达水平。其结果显示，293T细胞转染后 UBE2C -shRNA1、UBE2C-shRNA2和UBE2C-shRNA3的相对表达量均低于Contrl-shRNA，经统计分析UBE2C-shRNA2与Contrl-shRNA相比差异具有统计学意义（P < 0.05），见图2。提示转染UBE2C-shRNA2能下调293T细胞UBE2C的mRNA的表达。故选用UBE2C-shRNA2转染的病毒上清感染AGS细胞构建稳定细胞株进行后续相关功能实验。
图 1 293T细胞转染3组慢病毒干扰质粒和对照质粒72 h荧光显微镜观察结果（100×）Figure 1. 293 T cells transfected with three group of interfering lentiviral vectors and control vector for 72hours were photographed under fluorescene microscope（100×）A：Contrl-shRNA；B：UBE2C -shRNA1；C：UBE2C -shRNA2；D：UBE2C -shRNA3。
图 2 UBE2C-shRNA转染对UBE2C表达的影响（*P < 0.05，与对照组相比，n = 3）与Control-shRNA组比较，*P < 0.05，n = 3。Figure 2. Interference efficiency of UBE2C-shRNA plasmid on UBE2C expression2.2 建立稳定表达UBE2C的AGS 细胞株
经含有病毒上清感染AGS细胞和嘌呤霉素的筛选得到了稳定表达UBE2C的细胞株。该细胞株与未经处理的正常AGS细胞在形态学上无明显的差异，且能稳定表达绿色荧光（见图3）。qRT-PCR结果表明UBE2C干扰组细胞的UBE2C的mRNA相对表达水平下调，与对照组胃癌AGS细胞相比 P < 0.05（图4），提示稳定表达 UBE2C的胃癌AGS细胞株构建成功。
图 3 荧光显微镜下观察稳定表达 UBE2C的 AGS 胃癌细胞株（100×）Figure 3. Stable expressing UBE2C of AGS gastric cancer cell strain under fluorescene microscope（100 ×）A：Contrl-shRNA；B：UBE2C-shRNA2。
图 4 qRT-PCR 检测胃癌AGS细胞株中稳定表达UBE2C的水平与对照组比较，*P < 0.05，n = 3。Figure 4. stable expression of UBE2C in AGS gastric cancer cell strain determined by qRT-PCR2.3 UBE2C干扰抑制AGS细胞增殖
将对照组和干扰组胃癌AGS细胞分别接种在增殖板上，采用RTCA法检测胃癌AGS细胞的细胞增殖情况，得到两组细胞的增殖曲线（图5）。图中横轴为时间，增殖曲线纵轴为细胞指数（Cell Index，CI值）。本实验中，CI值的大小与细胞数量的多少呈正向相关关系，胃癌AGS细胞数量越多，RTCA检测的CI值越高。接种细胞后，细胞开始黏附，CI 值增大。两组细胞均呈现细胞增殖过程，包括细胞前期的黏附伸展、细胞对数增殖期及平台期。干扰组与对照组相比，其CI值在10 h、20 h、30 h、40 h、50 h和60 h均低于对照组，其差异有统计学意义（P < 0.05）。
图 5 RTCA 实时监测胃癌AGS细胞增殖结果与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，n = 3。Figure 5. RTCA monitoring the proliferation of gastric cancer AGS cells采用 CCK-8法用酶标仪上机检测胃癌AGS细胞的生长情况，根据细胞的生长状况，绘制细胞增殖曲线图（图6）。其结果显示胃癌AGS细胞培养24 h、48 h和72 h，与对照组相比干扰组细胞数明显减少，差异有统计学意义（P < 0.001），表明干扰UBE2C表达可抑制胃癌AGS细胞增殖。
图 6 CCK-8 检测UBE2C对胃癌AGS细胞增殖的影响与对照组比较，***P < 0.001，n = 3。Figure 6. Effect of UBE2C on proliferation of gastric cancer AGS cells detected by CCK-82.4 UBE2C干扰抑制AGS细胞迁移
在CIM-Plate 16上室分别接种干扰组和对照组的细胞，干扰组 AGS细胞在RTCA DP上测得CI值均显著低于对照组（图7），说明干扰UBE2C表达能够使胃癌 AGS细胞的迁移能力降低，即对照组细胞迁移信号明显高于实验组迁移信号。
图 7 RTCA 实时监测胃癌AGS细胞迁移结果（*P < 0.05，***P < 0.001，n = 3）Figure 7. RTCA monitoring the migration of gastric cancer AGS cells*P < 0.05，***P < 0.001，n = 3。3. 讨论
我国属于世界上胃癌高发地区之一，其胃癌病例数量占了约东亚地区总数量的一半[1-2]。作为人口大国，我国在对于胃癌的防控和治疗上形势更加严峻。在精准医学理念开始逐渐深入人心的当今社会，探索更加精准的生物标志物，是值得探索并且亟需解决的问题。
在真核细胞中，细胞内蛋白质的降解受到精确的调控。泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是蛋白质降解的主要通路，近年来大量的研究证实，UPP的紊乱与肿瘤细胞的发生发展密切相关，泛素化过程逐渐成为人类防治肿瘤的有效靶点之一。作为泛素结合酶E2家族的重要成员之一的泛素结合酶E2C（UBE2C）是1997年由Townsley等发现的[5]。UBE2C基因位于人类染色体的20q12-13上，核苷酸长度为783 bp，是197个氨基酸组成的蛋白，蛋白质的分子量为19.6 kD。研究表明UBE2C参与了分离酶抑制蛋白的降解过程，以保证分裂时姐妹染色单体能够正确分离，使细胞能从有丝分裂中期进入分裂后期[6]。UBE2C还通过与具有E3连接酶活性的有丝分裂后期促进复合物（anaphase promoting complex，APC）的相互作用共同调节细胞周期蛋白B（Cyclin B）的降解，进一步驱动细胞周期的进展[7]，上述实验提示，UBE2C在细胞周期调控中发挥着重要的作用。Okamoto等发现，UBE2C在许多正常组织中呈低表达，与此相反UBE2C在肿瘤细胞系和组织中呈高度表达的状态。通过小鼠体外实验也发现了在成纤维细胞中，过表达的UBE2C可以促进小鼠细胞克隆及增殖并且提高在软琼脂中非锚定生长的能力[7]，而干扰UBE2C 的表达水平后，肿瘤细胞的增殖和克隆形成能力明显被抑制，肿瘤细胞的衰老加速[8-9]。目前已有大量研究证明，UBE2C 与多种恶性肿瘤如头颈部鳞状细胞癌、肺癌、乳腺癌和结肠癌等[10-13] 的发生、发展密切相关，这些研究结果表明UBE2C作为原癌基因，在人类恶性肿瘤发生及发展过程中发挥着非常重要的作用，推测UBE2C可能成为人类癌症预防和治疗的重要靶点。但迄今，UBE2C在胃癌细胞中的生物学功能还不十分清楚，对于 UBE2C 如何调控其发生发展也知之甚少。
本研究应用RNA干扰技术，在293T细胞内获取病毒上清，根据慢病毒包装技术用含有病毒颗粒的上清液感染人胃癌AGS细胞后，获得能够稳定表达UBE2C基因的人胃癌AGS细胞。随后，检测了UBE2C沉默后对人胃癌细胞增殖和迁移等生物学行为的影响，结果显示UBE2C沉默后抑制人胃癌AGS细胞的增殖和迁移能力，提示UBE2C可能作为癌基因在人胃癌AGS细胞中发生作用，但其作用的具体原理及机制尚不明确。后续笔者将从临床收集胃癌病人的组织标本，并采用免疫组化、western blot 和qRT-PCR等方法，检测不同类型胃癌标本中UBE2C的不同表达情况，同时分析 UBE2C 表达水平与病理分期、转移扩散情况和临床预后状态等病理参数之间的相关性；此外还可以通过裸鼠皮下成瘤动物实验验证UBE2C干扰表达的胃癌细胞成瘤能力和生长情况的变化，以期为胃癌的预防和治疗提供行之有效的分子靶标。
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图 1 293T细胞转染3组慢病毒干扰质粒和对照质粒72 h荧光显微镜观察结果（100×）
Figure 1. 293 T cells transfected with three group of interfering lentiviral vectors and control vector for 72hours were photographed under fluorescene microscope（100×）
A：Contrl-shRNA；B：UBE2C -shRNA1；C：UBE2C -shRNA2；D：UBE2C -shRNA3。
图 2 UBE2C-shRNA转染对UBE2C表达的影响（*P < 0.05，与对照组相比，n = 3）
与Control-shRNA组比较，*P < 0.05，n = 3。
Figure 2. Interference efficiency of UBE2C-shRNA plasmid on UBE2C expression
图 3 荧光显微镜下观察稳定表达 UBE2C的 AGS 胃癌细胞株（100×）
Figure 3. Stable expressing UBE2C of AGS gastric cancer cell strain under fluorescene microscope（100 ×）
A：Contrl-shRNA；B：UBE2C-shRNA2。
图 4 qRT-PCR 检测胃癌AGS细胞株中稳定表达UBE2C的水平
与对照组比较，*P < 0.05，n = 3。
Figure 4. stable expression of UBE2C in AGS gastric cancer cell strain determined by qRT-PCR
图 5 RTCA 实时监测胃癌AGS细胞增殖结果
与对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，n = 3。
Figure 5. RTCA monitoring the proliferation of gastric cancer AGS cells
图 6 CCK-8 检测UBE2C对胃癌AGS细胞增殖的影响与对照组比较，***P < 0.001，n = 3。
Figure 6. Effect of UBE2C on proliferation of gastric cancer AGS cells detected by CCK-8
图 7 RTCA 实时监测胃癌AGS细胞迁移结果（*P < 0.05，***P < 0.001，n = 3）
Figure 7. RTCA monitoring the migration of gastric cancer AGS cells
*P < 0.05，***P < 0.001，n = 3。
表 1 引物信息
Table 1. Primer information
基因 引物序列5′→3′ UBE2C forward：ATCCATGGAGCAGCTGGAAC reverse：GGCAGCATGTGTGTTCAAGG GAPDH forward：GAGCCACATCGCTCAGACAC reverse：CATGTAGTTGAGGTCAATGAAGG 
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